Nrf2基因rs35652124C/T多態(tài)性與伴熱性驚厥史的難治性顳葉癲癇的相關(guān)性研究☆

尹小健劉洲李克深趙斌

·論 著·

Nrf2基因rs35652124C/T多態(tài)性與伴熱性驚厥史的難治性顳葉癲癇的相關(guān)性研究☆

尹小健*△劉洲△李克深△趙斌△

目的探討核因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)基因rs35652124C/T突變和伴熱性驚厥史的難治性顳葉癲癇(febrile seizure refractory temporal lobe epilepsy，F(xiàn)RTLE)的相關(guān)性。方法通過(guò)病例對(duì)照研究，收集18例漢族FRTLE患者、166例漢族非同時(shí)兼熱性驚厥史及難治性的顳葉癲癇（非FR?TLE）患者及183例漢族非癲癇患者。使用SNaPshot方法檢測(cè)患者外周血Nrf2基因rs35652124C/T多態(tài)性。結(jié)果有熱性驚厥(febrile seizure，F(xiàn)S)史的患者占難治性顳葉癲癇(refractory temporal lobe epilepsy,RTLE)的25%，明顯高于非RTLE的12.5%(OR：2.3，95%CI：1.07～5.05，P=0.029)。FRTLE組分別與非FRTLE組及非癲癇對(duì)照組比較，rs35652124 CC、CT、TT基因型及C、T等位基因間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論FS可能是RTLE的危險(xiǎn)因素，而rs35652124 C/T突變與FRTLE無(wú)關(guān)。

熱性驚厥 難治性癲癇 基因多態(tài)性

研究顯示，基因遺傳、部分性發(fā)作、多種癲癇發(fā)作類(lèi)型、病程中發(fā)作類(lèi)型改變等與難治性癲癇(refractory epilepsy,RE)有關(guān)，而熱性驚厥(febrile seizures,FS)與RE的關(guān)系尚有爭(zhēng)議[1-2]，與難治性顳葉癲癇(refractory temporal lobe epilepsy,RTLE)的關(guān)系鮮有研究，但是，F(xiàn)S患者容易出現(xiàn)海馬硬化[3]，而后者是RTLE的常見(jiàn)病理表現(xiàn)，而且，在RTLE及FS患者中，過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)這些氧化應(yīng)激的標(biāo)記物明顯升高[4-5]，因此，F(xiàn)S可能是RTLE的一個(gè)危險(xiǎn)因素。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor ery?throid 2-related factor 2,Nrf2)是體內(nèi)廣泛存在，作用最強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子。包括GSH-Px在內(nèi)的眾多抗氧化劑是Nrf2基因的下游產(chǎn)物[6]，Nrf2 mRNA表達(dá)量在TLE患者海馬組織中明顯升高[7]，因此，Nrf2可能與RTLE也相關(guān)。因此，我們對(duì)FS是否是RTLE的危險(xiǎn)因素，以及Nrf2基因啟動(dòng)子區(qū)rs35652124是否是伴FS的RTLE的危險(xiǎn)因素進(jìn)行研究。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 TLE患者為自2010年7月至2012年7月在廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的診斷明確用藥合理的癲癇患者184例(FRTLE 18例，非FRTLE166例)，所有患者均行24 h動(dòng)態(tài)腦電圖(EEG)，頭顱CT或MRI檢查。入選標(biāo)準(zhǔn)：①漢族；②臨床上至少有2次間隔24 h以上，發(fā)作明確的癇樣發(fā)作；③發(fā)作間期或發(fā)作期腦電圖顯示顳部導(dǎo)聯(lián)棘波、尖波、棘慢、尖慢波發(fā)放；④CT或MRI排除進(jìn)行性的神經(jīng)系統(tǒng)病變和占位病變；⑤根據(jù)發(fā)作類(lèi)型，正確選擇AED至少治療2年。排除標(biāo)準(zhǔn)：①誤診；②發(fā)作分型不確切；③選藥不當(dāng)；④用藥量不足；⑤依從性差。

依照2010年國(guó)際抗癲癇聯(lián)盟關(guān)于RE的定義[8]將癲癇患者分為難治性癲癇組和藥物反應(yīng)組。難治性癲癇定義為2種正確選擇、可耐受的抗癲癇藥物單藥或聯(lián)合治療仍未能達(dá)到無(wú)發(fā)作的癲癇。其中癲癇“無(wú)發(fā)作”被定義為無(wú)癲癇發(fā)作期至少3倍于治療前最長(zhǎng)發(fā)作間隔期(依過(guò)去12個(gè)月中的情況進(jìn)行判定)或者12個(gè)月，以時(shí)間相對(duì)長(zhǎng)者為準(zhǔn)。

對(duì)照組為在廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院體檢中心體檢的對(duì)象183例，本人及所在家系三代以?xún)?nèi)沒(méi)有癲癇發(fā)作史，本人亦無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)疾病病史。

所有受試者均經(jīng)知情同意，并經(jīng)廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)同意。

1.2 方法

1.2.1 一般資料 收集研究對(duì)象的年齡、性別，TLE患者還要收集熱厥史，頭影像資料。

1.2.2 基因組DNA提取 采早晨肘部靜脈血5 mL于抗凝管中，用血液基因組DNA快速抽提試劑盒(上海生工)，提取外周血白細(xì)胞的基因組DNA，DNA的濃度用紫外分光光度計(jì)測(cè)定。

1.2.3 SNP分型 參考本課題組[9]及其它課題組的方法[10]，rs35652124多態(tài)性分析由上海天昊遺傳分析中心協(xié)助完成，利用SNaPshot SNP分型技術(shù)對(duì)約136個(gè)樣本進(jìn)行SNP位點(diǎn)分型。引物用在線Prim?er3軟件設(shè)計(jì)(http://frodo.wi.mit.edu/)，PCR擴(kuò)增引物(F:CTCACTTTACCGCCCGAGAATG，R:CGCTTTG?GTGGGAAGAGGTTCT)，緊鄰SNP位點(diǎn)的延伸引物(TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTGGAGACACGTGGGAGTTCAGAGG)。①PCR反應(yīng)：反應(yīng)體系(20 μL)包含1×HotStarTaq buffer，3.0 mM Mg2+，0.3 mM dNTP，1 U HotStarTaq polymerase(Qiagen Inc.)，1 μL樣本DNA和2 μL多重PCR引物。PCR循環(huán)程序：95℃2 min；94℃20s,65℃-0.5℃/cycle 40 s,72℃1 min 30 s，共11循環(huán)；94℃20 s,59℃30 s,72℃1.5 min，共24循環(huán)；72℃2 min;4℃冷卻。②PCR產(chǎn)物純化：15μl PCR產(chǎn)物中加入5U SAP酶和2U Exonuclease I酶，37℃溫浴1 h，75℃滅活15 min。③延伸反應(yīng)：延伸反應(yīng)體系(10 μL)包括5 μL SNaPshot Multiplex Kit(ABI)，2 μL純化后多重PCR產(chǎn)物，1 μL延伸引物混合物，2 μL超純水；PCR循環(huán)程序：96℃1 min；96℃10 s，55℃5 s，60℃30 s，共28循環(huán)；4℃冷卻。④延伸產(chǎn)物純化：在10 μL延伸產(chǎn)物中加入1U SAP酶，37℃溫浴1 h，75℃滅活15 min。⑤延伸產(chǎn)物測(cè)序：取0.5 μL純化后的延伸產(chǎn)物，與0.5 μL Liz120 SIZE STANDARD，9 μL Hi-Di混勻，95℃變性5 min后上ABI3730XL測(cè)序儀，在測(cè)序儀上收集的原始數(shù)據(jù)用GeneMapper 4.1(Ap?pliedBiosystems Co.,Ltd.,USA)來(lái)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用Mann-Whitney檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料較采用fisher確切概率或卡方檢驗(yàn)。檢驗(yàn)研究對(duì)象是否符合Har?dy-Weinberg平衡。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

表1 臨床資料

2.1 臨床資料本研究共納入TLE研究對(duì)像有184例，其中伴熱性驚厥的RTLE(FRTLE)有18例，其他166例，非癲癇對(duì)照組183例。與非FRTLE組，兩組在年齡、性別、癲癇持續(xù)狀態(tài)史、頭CT或MRI異常比較時(shí)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。而與非癲癇的對(duì)照組比較，F(xiàn)RTLE患者的年齡更小(P＜0.05)（見(jiàn)表1）。

2.2 熱性驚厥與難治性顳葉癲癇的關(guān)系為了明確FS是否是RTLE的危險(xiǎn)因素，我們將TLE是否是難治型、伴FS病史分為4個(gè)組進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，F(xiàn)S在RTLE中占的比例為25%，在非TRTLE中為12.5%，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OR：2.3,95%CI：1.07～5.05,P=0.029）。

2.3 Hardy-Weinburg平衡吻合度檢測(cè)FRTLE組、非FRTLE組、非癲癇對(duì)照組人群的rs35652124 C/T基因型分布經(jīng)χ2檢驗(yàn)均符合Har?dy-Weinburg平衡，具有群體代表性(見(jiàn)表2)。

2.4 Nrf2基因rs35652124 C/T位點(diǎn)分布FRTLE組CC、CT、TT基因型分別6、5、7例；非FRTLE組分別為34、79、53例，對(duì)照組分別為45、86、52，F(xiàn)R?TLE組分別與非FRTLE組及對(duì)照組比較，總體差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。FRTLE組等位基因C、T頻率分別為47.2%(17/36)、52.8%(19/36)，非FRTLE組分別為44.3%(147/332)，55.7%(185/332)，對(duì)照組分別為48.1%(176/366)，51.9%(190/366)，F(xiàn)RTLE組分別與非FRTLE組及對(duì)照組比較，差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)表3）。

3 討論

本研究通過(guò)病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)S可能是RTLE的發(fā)病的影響因素，而Nrf2基因rs35652124-C/T多態(tài)性與FRTLE的發(fā)病無(wú)關(guān)。

我們的研究證實(shí)了FS可能是RTLE的病因，Scantlebury[11]與McClelland[12]在他們綜述中提出假設(shè)，F(xiàn)S特別是延長(zhǎng)型FS可能與RTLE有關(guān)。FS是影響兒童的常見(jiàn)神經(jīng)系統(tǒng)疾病，在伴FS的TLE患者的腦標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)，他們海馬中的顆粒細(xì)胞丟失更明顯[13]，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)FS發(fā)作后，動(dòng)物會(huì)表現(xiàn)為學(xué)習(xí)和記憶功能受損及相應(yīng)的海馬MRI T2相的信號(hào)增長(zhǎng)[14]。這些都提示FS對(duì)海馬產(chǎn)生了損害，而海馬病變是RTLE的主要病理表現(xiàn)[15]，因此，F(xiàn)S可能是通過(guò)損傷海馬，從而導(dǎo)致RTLE。然而Sànchez報(bào)道[16]FS與伴海馬硬化的內(nèi)側(cè)TLE預(yù)后無(wú)關(guān)，Savitr[17]的研究卻發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)S與CA4區(qū)海馬神經(jīng)元丟失是TLE預(yù)后良好的因素，但是作多因素回歸分析后這種作用消失。在我們的研究中，F(xiàn)S是作為病史診斷，部分患者或家屬在回憶時(shí)可能存在偏差，從而造成偏移。而且那些發(fā)作持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，發(fā)作次數(shù)更多的FS更容易被記起，因此，這部分病人被診斷為延長(zhǎng)型FS的可能性更大，這也可能是我們發(fā)現(xiàn)FS與RTLE相關(guān)，與其它研究結(jié)果不一致的原因。

表2 Nrf2基因rs35652124 C/T基因型Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

表3 Nrf2基因rs35652124 C/T基因型及等位基因頻率

Cardenas等[18]認(rèn)為，氧化應(yīng)激與RE有密切關(guān)系。而Nrf2是體內(nèi)抗氧化應(yīng)激調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子。Nrf2通過(guò)與胞漿蛋白Keap1以及抗氧化反應(yīng)元件相互作用，啟動(dòng)下游編碼抗氧化蛋白和II相解毒酶的基因表達(dá)，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。Nrf2介導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)是一種主要的細(xì)胞防御機(jī)制。Nrf2缺失或激活障礙，可加重氧化應(yīng)激源的細(xì)胞毒性，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙、凋亡甚至死亡。眾多研究顯示，通過(guò)激活Nrf2反應(yīng)，減少氧化應(yīng)激，保護(hù)神經(jīng)元，對(duì)阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病有效。Nrf2與FS的關(guān)系尚未見(jiàn)研究，然而FS患者存在明顯的氧化應(yīng)激狀態(tài)[19]。而Nrf2的mRNA在癲癇患者海馬組織中高表達(dá)，在誘惑的癲癇狀態(tài)小鼠腦中，Nrf2的表達(dá)量在72小時(shí)逐步升高，并且受其調(diào)節(jié)的血紅素加氧酶-1、醌NADH脫氫酶1、微粒體谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶等表現(xiàn)類(lèi)似，然而，注射N(xiāo)rf2轉(zhuǎn)染的腺病毒后，小鼠的癲癇發(fā)作次數(shù)明顯下降，而且小膠質(zhì)細(xì)胞激活明顯減少，有更多的海馬神經(jīng)元存活[7,20]。說(shuō)明Nrf2被癇性發(fā)作激活，并且進(jìn)一進(jìn)上調(diào)其控制的下游抗氧化的各種酶。rs35652124位于Nrf2基因啟動(dòng)子區(qū)，能調(diào)控Nrf2的表達(dá)[21]，其多態(tài)性的變化，可能會(huì)影響到體內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)物的清除，從而導(dǎo)致FS及RTLE的發(fā)生。已經(jīng)有研究顯示，rs35652124與與白癜風(fēng)[21]、血管功能[22]及血壓與心血管病的病死率[23]有關(guān)。因此，我們推測(cè)rs35652124可能是FRTLE的遺傳易感因素，然而我們的研究并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)rs35652124 C/T與FRTLE有關(guān)。目前尚無(wú)Nrf2基因多態(tài)性與癲癇的相關(guān)性研究的報(bào)道，故我們無(wú)法找到相關(guān)的研究進(jìn)行比較。然而在歐洲人群中，包含rs35652124、rs6706649、rs6721961三個(gè)啟動(dòng)子基因多態(tài)位點(diǎn)在內(nèi)的AGC單倍體能減少帕金森患的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[24]，而該結(jié)果在臺(tái)灣人群未能重復(fù)[25]。因此，不同人群之間存在遺傳異質(zhì)性會(huì)影響研究結(jié)果的一致性。其次，F(xiàn)RTLE是一種復(fù)雜的多基因疾病，還受基因-基因及基因-環(huán)境交互作用的影響，因此，單一基因的位點(diǎn)的變化可以還不足以導(dǎo)致疾病的發(fā)生。最后，同時(shí)符合FRTLE四個(gè)條件的病例較少，我們的樣本量只有18例，還可能沒(méi)有反映出rs35652124 C/T與FRTLE的真實(shí)關(guān)系。

[1]Tripathi M,Padhy UP,Vibha D,et al.Predictors of refractory epilepsy in north India:a case-control study[J].Seizure,2011, 20(10):779-783.

[2]張燕芳,狄睛,余年,等.新診斷癲癇患者演變?yōu)殡y治性癲癇的發(fā)生率及危險(xiǎn)因素探討[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志, 2011,28(5):441-444.

[3]Labate A,Mumoli L,Fratto A,et al.Hippocampal sclerosis worsens autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy (ADNFLE)phenotype related to CHRNB2 mutation[J].Eur J Neurol,2013,20(3):591-593.

[4]Lopez J,Gonzalez ME,Lorigados L,et al.Oxidative stress mark?ers in surgically treated patients with refractory epilepsy[J].Clin Biochem,2007,40(5-6):292-298.

[5]Gunes S,Dirik E,Yis U,et al.Oxidant status in children after febrile seizures[J].Pediatr Neurol,2009,40(1):47-49.

[6]龔建明,黃引平.脂氧素通過(guò)Nrf2信號(hào)通路對(duì)LPS誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的抑制作用[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2011, (01):97-101.

[7]Mazzuferi M,Kumar G,van Eyll J,et al.Nrf2 defense pathway: Experimental evidence for its protective role in epilepsy[J].Ann Neurol,2013,74(4):560-568.

[8]洪楨,洪震,周東.耐藥性癲癇的定義:國(guó)際抗癲癇聯(lián)盟治療策略委員會(huì)專(zhuān)項(xiàng)工作組統(tǒng)一提案[J].中華神經(jīng)科雜志, 2010,43(7):487-492.

[9]Li Y,Liao F,Yin XJ,et al.An association study on ADAM10 promoter polymorphisms and atherosclerotic cerebral infarction in a Chinese population[J].CNS Neurosci Ther,2013,19(10): 785-794.

[10]王燕,張華,劉志連,等.新疆維吾爾族,漢族人群TIM-3啟動(dòng)子區(qū)rs10053538與過(guò)敏性鼻炎的相關(guān)性[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2011,34(001):21-24.

[11]Scantlebury MH,Heida JG.Febrile seizures and temporal lobe epileptogenesis[J].Epilepsy Res,2010,89(1):27-33.

[12]McClelland S,Dube CM,Yang J,et al.Epileptogenesis after prolonged febrile seizures:mechanisms,biomarkers and thera?peutic opportunities[J].Neurosci Lett,2011,497(3):155-162.

[13]Bando SY,Alegro MC,Amaro E,et al.Hippocampal CA3 tran?scriptome signature correlates with initial precipitating injury in refractory mesial temporal lobe epilepsy[J].PLoS One,2011,6 (10):e26268.

[14]Dube CM,Zhou JL,Hamamura M,et al.Cognitive dysfunction after experimental febrile seizures[J].Exp Neurol,2009,215(1): 167-177.

[15]Lee SK.Treatment strategy for the patient with hippocampal sclerosis who failed to the first antiepileptic drug[J].J Epilepsy Res,2014,4(1):1-6.

[16]Sanchez J,Centanaro M,Solis J,et al.Factors predicting the outcome following medical treatment of mesial temporal epilep?sy with hippocampal sclerosis[J].Seizure,2014,23(6):448-453.

[17]Savitr Sastri BV,Arivazhagan A,Sinha S,et al.Clinico-patho?logical factors influencing surgical outcome in drug resistant epi?lepsy secondary to mesial temporal sclerosis[J].J Neurol Sci, 2014,340(1-2):183-190.

[18]Cardenas-Rodriguez N,Huerta-Gertrudis B,Rivera-Espinosa L,et al.Role of oxidative stress in refractory epilepsy:evidence in patients and experimental models[J].Int J Mol Sci,2013,14 (1):1455-1476.

[19]Abuhandan M,Calik M,Taskin A,et al.The oxidative and anti?oxidative status of simple febrile seizure patients[J].J Pak Med Assoc,2013,63(5):594-597.

[20]Wang W,Wang WP,Zhang GL,et al.Activation of Nrf2-ARE signal pathway in hippocampus of amygdala kindling rats[J]. Neurosci Lett,2013,543:58-63.

[21]宋璞.NRF2,HO-1基因多態(tài)性與白癜風(fēng)罹患危險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性研究[D].In,Vol.碩士.西安:第四軍醫(yī)大學(xué),2013:3.

[22]Marczak ED,Marzec J,Zeldin DC,et al.Polymorphisms in the transcription factor NRF2 and forearm vasodilator responses in humans[J].Pharmacogenet Genomics,2012,22(8):620-628.

[23]Shimoyama Y,Mitsuda Y,Tsuruta Y,et al.Polymorphism of Nrf2,an antioxidative gene,is associated with blood pressure and cardiovascular mortality in hemodialysis patients[J].Int J Med Sci,2014,11(7):726-731.

[24]von Otter M1,Landgren S,Nilsson S,et al.Association of Nrf2-encoding NFE2L2 haplotypes with Parkinson's disease[J]. BMC Med Genet，2010,11:36.

[25]Chen YC,Wu YR,Wu YC,et al.Genetic analysis of NFE2L2 promoter variation in Taiwanese Parkinson's disease[J].Parkin?sonism Relat Disord，2013,19(2):247-50.

R742.1

A

2014-08-25）

（責(zé)任編輯:李立）

10.3936/j.issn.1002-0152.2015.05.011

☆ 國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31171219）

* 暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院（廣州 510630）

△ 廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

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