MicroRNA：從生物標(biāo)志物到基因治療

湯森路透

MicroRNA：從生物標(biāo)志物到基因治療

湯森路透

microRNA（miRNA）作為生物標(biāo)志物和治療靶點的價值已被公認(rèn)。簡介miRNA及其生物合成與功能，探討 miRNA與疾病及癌癥的關(guān)系，綜述miRNA在疾病治療中及作為生物標(biāo)志物的應(yīng)用研究。

microRNA；生物標(biāo)志物；基因治療

10年前，首個人類microRNA（miRNA）被發(fā)現(xiàn)。時至今日，據(jù)Thomson Reuters Integrity披露的數(shù)據(jù)顯示，已有210個miRNA藥物正處不同研發(fā)階段（見表1）。2014年6月發(fā)布的miRBase序列數(shù)據(jù)庫顯示，在223個物種中，已收載了可表達(dá)35 828種成熟miRNA的28 645個前體miRNA詞條。

表1 部分在研miRNA藥物Table1 Some miRNA-based therapeutics under active development

續(xù)表1

1 miRNA簡介

miRNA是長度約為21～24個核苷酸的一類非編碼的小RNA分子，其與argonaute蛋白（RNA介導(dǎo)的基因沉默復(fù)合體中成分蛋白）一起共同參與mRNA沉默過程。1993年，miRNA首次在秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）中被發(fā)現(xiàn)。之后，在所有的生物體內(nèi)，包括蠕蟲、蠅、魚、蛙、哺乳動物和開花植物，都發(fā)現(xiàn)有miRNA，且有些大型病毒也會產(chǎn)生miRNA。盡管通常情況下，在近親物種中，miRNA較為保守，但在遠(yuǎn)親物種中，miRNA有時也會具有同源性。比如，在秀麗隱桿線蟲和人類間，let-7 miRNA具有100%保守性。這表明了miRNA在生物學(xué)上的重要性。許多miRNA具有多種拷貝或相關(guān)序列，并形成不同家族，如let-7、mir-515和mir-548家族。人類可能存在超過1 000種miRNA，它們廣泛參與各種不同的生理過程，包括發(fā)育、分化、細(xì)胞增殖與凋亡、應(yīng)激反應(yīng)等。因此，miRNA的失調(diào)與很多疾病相關(guān)，如癌癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）疾病、炎癥、心血管疾病和代謝性疾病等。

2 miRNA的生物合成與功能

miRNA是由其基因通過RNA聚合酶Ⅱ而轉(zhuǎn)錄。最初的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物pri-miRNA是帶有莖環(huán)結(jié)構(gòu)（stemloop）的長分子前體，其莖環(huán)經(jīng)RNase Ⅲ酶Drosha和輔助因子DGCR8的核切除，形成由大約70個核苷酸組成的pre-miRNA；隨后，另一個RNase Ⅲ酶Dicer在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)將pre-miRNA剪切，產(chǎn)生成熟的miRNA。成熟miRNA再與argonuate蛋白一起形成RNA介導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）。當(dāng)帶有互補序列的mRNA結(jié)合到RISC上后，經(jīng)過降解或沉默，確保這些mRNA不再被翻譯成蛋白（見圖1）。

圖1 miRNA的生物合成與功能示意圖Figure 1 Schematic diagram of the biosynthesis and function of miRNA

與其他小核RNA（snRNA）不同，miRNA的沉默作用只需要miRNA和mRNA之間的部分互補，即6個堿基對就足矣。因此，一條單鏈miRNA能夠使數(shù)百個基因沉默，而一個基因可被多條miRNA沉默，如miR-34a可抑制參與致癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的多個基因。另外，相似的miRNA在不同的組織和不同的發(fā)育階段，其表達(dá)也不相同。例如，一個miRNA可在發(fā)育早期階段表達(dá)，但到后期則不表達(dá)。所以，一個miRNA的多個拷貝能根據(jù)需要同時調(diào)控多個不同的基因或單一基因。當(dāng)多個不同的miRNA與同一靶mRNA結(jié)合，它們可協(xié)同降低靶mRNA水平，其作用大于單個miRNA作用的總和。miRNA的這種功能特點是基于靶識別，比如let-7g～let-7a1基因簇可識別3p2染色體位點，let-7f-1～let-7d 基因簇可識別9q22.3染色體位點，let-7a-2可識別11q23-q24染色體位點，let-7c可識別21q21染色體位點。由于這些染色體位點與一些實體癌相關(guān)，如肺癌、尿路上皮癌、乳腺癌、卵巢癌和宮頸癌，所以可靶向識別這些染色體位點的上述miRNA被認(rèn)為能發(fā)揮抑制腫瘤的作用。根據(jù)生物信息學(xué)靶點預(yù)測，估計一個miRNA可識別1至數(shù)百個靶基因。

3 miRNA與疾病的關(guān)系

miRNA的突變可導(dǎo)致其功能喪失或增強，從而影響正常的翻譯過程，并最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生。miRNA突變可發(fā)生在體細(xì)胞或生殖細(xì)胞。已被檢測到的基因畸變類型包括缺失、擴增和表觀遺傳改變。除了miRNA突變外，靶mRNA或經(jīng)miRNA加工的蛋白的突變也會導(dǎo)致疾病。比如，miRNA生物合成酶Drosha的輔助因子DGCR8蛋白的缺失會導(dǎo)致miRNA的加工功能異常，而DGCR8結(jié)構(gòu)域的單倍體缺損（haploinsufficiency）是DiGeorge綜合征的誘因，因此可以說，miRNA參與了DiGeorge綜合征的發(fā)生。另一個靶基因位點突變而導(dǎo)致疾病的例子是，SLITRK1的突變會影響到miR-189的結(jié)合，從而導(dǎo)致Tourette綜合征。而另一種致病機制是一個基因獲得一個新的miRNA靶序列。miRNA往往可特異性存在并作用于疾病的某個特定階段，比如，miR-10b可調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移，且存在于高惡性乳腺癌組織中，但在癌癥早期階段，其似乎并無作用。表2介紹了在臨床研究中用于不同疾病的miRNA。

4 miRNA與癌癥的關(guān)系

miRNA與多種癌癥相關(guān)，其可能呈現(xiàn)為抑癌或致癌基因。而定義一個miRNA是抑癌或致癌基因，取決于它的細(xì)胞或組織定位。例如，miR-221和miR-222可靶向作用于致癌基因KIT，因此它們在成紅細(xì)胞中發(fā)揮抑癌基因功能；但是，它們也能靶向作用于抑癌基因PTEN、p27、p57和TIMP3，故又可成為致癌基因。Let-7在卵巢癌組織中可抑制致癌基因RAS、MYC和HMGA-2的表達(dá)，而在乳腺癌細(xì)胞中其表達(dá)減少，也同樣發(fā)揮抑癌作用。miRNA-34家族是另一種抑癌基因，其在某些癌癥組織中缺失。miRNA-15和-16也常在B細(xì)胞淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞中缺失，且在前列腺癌組織中的表達(dá)減少80%。其他已被深入研究的抑癌基因還有：miR-10b、miR-21、miR-26a、miR-126、miR-335和miR-29a。致癌基因則有miR-155和miR-17-92基因簇（包括miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b1和miR-92-1），其中，miR-17-92基因簇與多種實體瘤相關(guān)，如乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌，且也與彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤相關(guān)。miR-17-92基因簇的miRNA參與多個生理過程，如細(xì)胞增殖和凋亡以及血管生成，它們通過降低PTEN、p21和Bim等抑癌基因而發(fā)揮作用。表3介紹了已處臨床研究后期的癌癥相關(guān)miRNA。

表2 處在臨床研究階段用于各種疾病的miRNA*Table2 miRNAs in clinical study for various diseases

表3 已處臨床研究后期的癌癥相關(guān)miRNA*Table3 Cancer-related miRNAs in late stage clinical studies

5 miRNA用于治療

由于單個miRNA可影響到參與單一通路的很多基因，基于miRNA的治療藥物要優(yōu)于靶向作用于該通路中多個不同致癌基因的療法。大多數(shù)miRNA藥物屬于兩個類別：引入miRNA類（miRNA模擬物）和反義miRNA類（miRNA拮抗劑）。將miRNA引入體內(nèi)，需要借助載體或脂質(zhì)體。將miRNA遞送至靶組織的載體通常有腺病毒、腺相關(guān)病毒（AAV）或逆轉(zhuǎn)錄病毒，而干細(xì)胞中獨特的miRNA表達(dá)模式也可被利用。而且，可以選擇一些表達(dá)所需miRNA的特定干細(xì)胞類型，并將其回輸給患者。目前，Let-7模擬物正在被開發(fā)用于治療多種實體癌，如肺癌和前列腺癌?？商禺愋宰饔糜谛呐K的一種mir-208拮抗劑也正在被開發(fā)用于心血管疾病的治療。用于丙型肝炎治療的一種mir-122拮抗劑則已進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗。而唯一進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗的miRNA藥物MRX34是抑癌基因miR-34的模擬物，正在被開發(fā)用于治療不能手術(shù)的原發(fā)性肝癌或影響到肝臟的轉(zhuǎn)移性癌癥。

6 miRNA用作生物標(biāo)志物

由于miRNA的表達(dá)與疾病相關(guān)，所以miRNA表達(dá)譜可用于患者分層和治療方案的選擇。例如，let-7和miR-122存在于肺癌組織中，而mir-208可用于心血管疾病的診斷。如前所述，miRNA具有組織和發(fā)育階段特異性。而在不同體液中，miRNA也很穩(wěn)定，且大多數(shù)循環(huán)miRNA能很容易通過PCR方法檢測出來。這就使得miRNA成為非常有前途的無創(chuàng)性生物標(biāo)志物。然而，由于面臨技術(shù)上的挑戰(zhàn)，miRNA開發(fā)用作生物標(biāo)志物，已遇到不少阻礙。比如，因不同的miRNA中有保守序列，故引物設(shè)計可能會導(dǎo)致極為不同的結(jié)果；而且，因不同miRNA在體液中的含量都很低，且有較高的序列相似度及較短長度，所以微陣列（microarray）方法也不適用。不過，新一代測序（NGS）技術(shù)可以避免這些問題，因為它不再嚴(yán)重依賴于引物設(shè)計，但此項技術(shù)的引用可能較為昂貴。此外，miRNA樣本的降解也是個問題，且缺乏miRNA的標(biāo)準(zhǔn)品制備和規(guī)范化方法。所有這些基本問題致使跨平臺比較難以進(jìn)行。當(dāng)然，隨著1 000多種潛在miRNA生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)及對其生物學(xué)意義的認(rèn)知，科學(xué)界一直在致力于解決這些挑戰(zhàn)性問題。

7 結(jié)論

miRNA作為治療靶點和生物標(biāo)志物的價值已被公認(rèn)。目前，有多個miRNA已經(jīng)臨床前驗證，正待臨床開發(fā)。眼下，亟需加強對更有效的miRNA藥物遞送系統(tǒng)的開發(fā)，以增加miRNA的體內(nèi)吸收和穩(wěn)定性，并促進(jìn)miRNA藥物的開發(fā)。而且，更進(jìn)一步地探究miRNA在病理通路中的作用、明確它們的靶點以及相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，將有助于推動miRNA生物標(biāo)志物試劑盒進(jìn)入臨床。

MicroRNAs: from Biomarkers to Gene Therapy

Thomson Reuters

The value of miRNAs as therapeutic targets and biomarkers has been well established.In this article, the biosynthesis and function of miRNAs were introduced; the roles of miRNAs in disease and cancer were discussed; the researches on the applications of miRNAs in the treatment of diseases and as biomarkers were reviewed.

microRNA; biomarker; gene therapy

R362; R456

A

1001-5094（2015）03-0235-04