克唑替尼對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞放射增敏作用的研究

【摘要】目的 觀察體外環(huán)境下克唑替尼對(duì)NSCLC細(xì)胞的放射增敏效果及其潛在機(jī)制。方法 以H2228及H3122細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，MTT法檢測(cè)不同濃度克唑替尼對(duì)NSCLC細(xì)胞的抑制作用；平板克隆形成實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定NSCLC細(xì)胞在克唑替尼作用下照射以及單純照射的SF，擬合細(xì)胞生存曲線并計(jì)算放射增敏比；流式細(xì)胞儀檢測(cè)各細(xì)胞株的接受不同劑量放射線后細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期分布的變化；Western Blot檢測(cè)各細(xì)胞株接受放射線照射后STAT3及p-STAT3蛋白表達(dá)水平變化。結(jié)果 MTT實(shí)驗(yàn)：抑制率與濃度變化呈正相關(guān)。IC50分別為330 nM和102 nM。克隆形成實(shí)驗(yàn)：附加藥物照射的細(xì)胞SF低于單純照射組。H2228/ H3122細(xì)胞株組中，SER（D0）：1.064/1.004；SER（Dq）：1.079/1.047。流式細(xì)胞術(shù)：兩細(xì)胞的凋亡率與照射劑量呈正比。在H2228組細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞阻滯現(xiàn)象明顯，H3122細(xì)胞各周期細(xì)胞比率未見(jiàn)明顯變化。Western Blot法：應(yīng)用克唑替尼聯(lián)合時(shí)STAT3的磷酸化過(guò)程受到阻滯。H2228細(xì)胞株阻滯現(xiàn)象更為明顯。結(jié)論 克唑替尼對(duì)NSCLC H2228及H3122細(xì)胞株均有放射增敏作用，對(duì)H2228細(xì)胞株的放射增敏效果更加明顯。

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B

【文章編號(hào)】1674-9308（2015）04-0196-02

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2015.04.169

作者單位：450001鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)教研室

The Study of Radiosensitization of Crizotinib on Cells in Non-small Cell Lung Cancer

YANG Wenkui JIAGN Wenhan LI Dianyuan, Basic Medical College of Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China

[Abstract] Objective To observe the radiosensitization of crizotinib on NSCLC cells in vitro and to explore the potential mechanisms. Methods NSCLC cell lines H2228 and H3122 were used in this study. MTT was used to investigate the cytotoxicity of crizotinib and define the IC50 for H2228 and H3122 cells. Clonogenic assay was used to determine cell SF of cells received radiation alone and crizotinib administrated for 36 h before irradiation, fitting cell survival curve and calculating the ratio radiosensitization. Flow cytometry was used to detect the cell lines of different doses of radiation to accept change rate of apoptosis and cell cycle distribution. Western Blotting was used to detect STAT3 and p-STAT3 protein levels of cell lines after irradiation. Results The inhibition rate was positively related with the concentration change. The IC50 concentration of crizotinib were 330 nM and 102 nM. In the H2228/ H3122 cell group, SER (D0) were: 1.064/1.004, SER (Dq) were: 1.079/1.047. H2228 cells after the application of crizotinib, G0/G1 phase cell cycle arrest phenomenon obviously. H3122 cells for application the crizotinib after each cycle the cells did not change the ratio. Conclusion The crizotinib in non-small cell lung cancer cell lines H2228 and H3122 was radiosensitizing effect, the radiosensitizing effect on the H2228 cell line was more obvious.

[Key words] Crizotinib, H2228, H3122, Apoptosis, Radiosensitizer, STAT3, P-STAT3

肺癌是全世界最常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是惡性腫瘤死亡的主要原因，其中以非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）為主，占所有類型的80%～85%，Ⅰ、Ⅱ期及Ⅲa期（非N2患者）的NSCLC能夠行根治性切除術(shù) [1]。EML4-ALK融合基因的表達(dá)與非小細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，已經(jīng)成為NSCLC分子靶向治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn) [2]?？诉蛱婺幔–rizotinib）是口服型三磷酸腺苷競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，本研究只要目的是觀察體外環(huán)境下克唑替尼對(duì)NSCLCH3122及H2228細(xì)胞株的放射增敏效果及其潛在機(jī)制。

1　材料與方法

1.1　材料

EML4-ALK融合基因陽(yáng)性的H2228細(xì)胞株及H3122細(xì)胞株購(gòu)自南京科佰生物科技有限公司；RPMI-1640完全培養(yǎng)液及優(yōu)級(jí)胎牛血清均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；克唑替尼購(gòu)自Selleckchem公司；MTT購(gòu)自 北京索萊寶科技有限公司；抗p-STAT兔單克隆抗體、抗STAT兔單克隆抗體及HRP-山羊抗兔IgG均購(gòu)自Cell Signaling Technology公司。

1.2　細(xì)胞培養(yǎng)

使用含有10%優(yōu)級(jí)胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)；0.25%胰酶消化、傳代；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3　MTT試驗(yàn)

取指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞株消化后加入培養(yǎng)基配置成細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl。將96孔板分為上下兩個(gè)區(qū)，4個(gè)重復(fù)孔。培養(yǎng)24 h加入MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h再加入DMSO，震蕩后放置到酶標(biāo)儀中，記錄570 nm波長(zhǎng)處的吸光度。生長(zhǎng)抑制率（IR）＝1－（藥物作用組OD值/空白對(duì)照組OD值）×100%，計(jì)算出克唑替尼對(duì)兩細(xì)胞株的IC50值。

1.4　克隆形成實(shí)驗(yàn)

采用兩細(xì)胞株的50%IC50值為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)藥物濃度。單純藥物組在加入藥物后繼續(xù)孵育72 h后，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，當(dāng)培養(yǎng)板中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)細(xì)胞群落時(shí)，棄培養(yǎng)液。照射組選擇0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy的放射線下進(jìn)行照射，照射后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)胞群落的形成。應(yīng)用Sigmaplot軟件繪制劑量效應(yīng)曲線，構(gòu)建多靶單擊模型，Dq = D0×1 nN 來(lái)擬合存活曲線，計(jì)算SER。

1.5　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期分布情況

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H2228與H3122細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成10 6個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，各自分為四組進(jìn)行相應(yīng)的處理，以細(xì)胞凋亡試劑盒和周期試劑盒說(shuō)明書收集細(xì)胞并染色后用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率和周期分布。

1.6　Western Blotting檢測(cè)STAT3及p-STAT3蛋白的表達(dá)

收集長(zhǎng)滿瓶的H3122及H2228細(xì)胞，用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，所得總蛋白經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將一抗（抗STAT兔單克隆抗體或抗p-STAT兔單克隆抗體）用TBST稀釋至適當(dāng)濃度，并將封閉好的PVDF膜放入一抗稀釋液中，過(guò)夜4℃下孵育，用同樣的方法孵育二抗（HRP-山羊抗兔IgG）1 h。以β-actin作內(nèi)參照，紅外熒光Ⅱ抗顯色，分析條帶以灰度確定蛋白表達(dá)。

1.7　統(tǒng)計(jì)學(xué)方式

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行檢驗(yàn)， P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖像處理應(yīng)用ImageJ2x及SigmaPlot10.0軟件。

2　結(jié)果

2.1　對(duì)H3122及H2228細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)克唑替尼濃度分別為0～1 600 nM時(shí)，作用于H2228細(xì)胞24 h后，增殖抑制率分別是：2.89%，21.03%，34.09%，43.36%，60.75%，68.54%，84.02%，抑制率與濃度變化呈正相關(guān)，IC50濃度為330 nM。作用于H3122細(xì)胞24 h后，增殖抑制率分別是：23.17%，37.98%，49.80%，58.46%，65.62%，76.46%，84.07%，抑制率與濃度變化呈正相關(guān)，IC50濃度為102 nM。

2.2　對(duì)H3122及H2228細(xì)胞株的放射增敏作用

采用50%的IC50值為實(shí)驗(yàn)藥物濃度，選用160 nM及50 nM，作用時(shí)間為36 h，根據(jù)細(xì)胞克隆集落數(shù)目計(jì)算出細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)。在等量照射劑量下，附加藥物照射的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)低于單純照射組。經(jīng)計(jì)算兩組的SER（D0）分別為1.064/1.079、SER（Dq）分別為1.004/1.047。

2.3　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡及周期分布

H2228及H3122細(xì)胞的凋亡率與照射劑量呈正比。附加克唑替尼的細(xì)胞株經(jīng)照射后細(xì)胞凋亡率明顯高于單純照射組。在H2228組細(xì)胞中，G0/G1期比率升高；S期比率減少；G2/M期比率升高。應(yīng)用了克唑替尼后G0/G1期細(xì)胞阻滯現(xiàn)象尤為突出。在H3122組細(xì)胞中，作用前后各細(xì)胞周期比率均表現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)。

2.4　Western Blotting檢測(cè)克唑替尼對(duì)JAK-STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)信號(hào)蛋白的影響

根據(jù)克隆形成實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞儀得到的數(shù)據(jù)，選擇8 Gy放射劑量發(fā)現(xiàn)JAK-STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要的底物STAT3表達(dá)上升，及其磷酸化產(chǎn)物p-STAT3表達(dá)下降，H2228細(xì)胞株在放射線及克唑替尼的作用下，對(duì)STAT3磷酸化的阻滯作用較H3122細(xì)胞株更為明顯。

3　討論

NSCLC患者中大約有3%～5%的患者ALK基因重排，約2～5%NSCLC患者體內(nèi)形成EML4-ALK融合藍(lán)氨酸集美，高表達(dá)的EML4-ALK融合基因往往預(yù)后較差，而且對(duì)放、化療抗拒。Soda M等人首次從1例62歲的吸煙肺腺癌患者的腫瘤組織中擴(kuò)增得到3926bp組成的DNA片段，翻譯轉(zhuǎn)錄得到1059個(gè)氨基酸組成的融合蛋白EML4-ALK [3]。各亞型中多見(jiàn)的是變體1型（EML4 13；ALK 20）占33%及變體3型（EML4 6a/b；ALK 20）占29%。EML4-ALK融合基因與EGFR突變之間是相互獨(dú)立可共存 [4]。克唑替尼是口服型三磷酸腺苷競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，可抑制ALK和MET酪氨酸激酶，還能夠抑制ROS1 [5]和RON激酶的活性是目前使用較為廣泛的針對(duì)EML4-ALK融合基因的靶向治療藥物 [6]。經(jīng)細(xì)胞平板克隆法檢測(cè)后，克唑替尼對(duì)于兩細(xì)胞株均具有放射增敏作用，而對(duì)于H2228細(xì)胞株的放射增敏比更大；應(yīng)用了克唑替尼及放射線后H2228細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞阻滯更明顯。STAT3是JAKSTAT途徑中最重要的底物，在信號(hào)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起到關(guān)鍵的作用，是一種雙功能蛋白，存在于細(xì)胞質(zhì)中并與酪氨酸磷酸化的信號(hào)通路相偶聯(lián) [7]。JAK-STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常與腫瘤的細(xì)胞凋亡、血管新生、侵襲轉(zhuǎn)移、增殖分化、免疫逃跑等密切相關(guān) [8]。在克唑替尼及放射線的作用下，兩細(xì)胞株均有抑制STAT3磷酸化的作用，對(duì)于H2228細(xì)胞株的阻滯效果更明顯。阻斷了以STAT3為中心的JAK-STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)一步抑制了腫瘤細(xì)胞的血管新生、侵襲轉(zhuǎn)移、增殖分化、免疫逃跑的能力，最終促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡，腫瘤組織的縮小。