應(yīng)用通用寡核苷酸芯片技術(shù)檢測病原菌的研究

【摘要】 本文以DNA為靶標(biāo)，針對待檢細(xì)菌制備寡核苷酸芯片，根據(jù)雜交條件進(jìn)行摸索，然后重新確立寡核苷酸芯片，通過結(jié)果的相似性來判斷樣本的種類。檢測中利用通用引物SUA和GO7B對涉及40多個進(jìn)行擴(kuò)增和標(biāo)記后，針對不同的種、屬的混合模式，增加它們相互之間的分辨能力，同樣樣品中存在多個菌種時也可檢測出來，并為臨床診斷提供依據(jù)。綜合比較，該項檢測技術(shù)具有良好的使用價值。

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B

【文章編號】1674-9308（2015）06-0170-02

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2015.06.140

作者單位：152511伊春，黑龍江省雙豐林業(yè)局職工醫(yī)院

Applied Study on Oligonucleotide Microarray Technology to Detect Pathogens

ZHANG Xuefeng, Shuangfeng Forest Workers Hospital, Yichun 152511, China

[Abstract] Targeting to DNA, preparation of oligonucleotide microarray for the bacteria to be detected under hybridization conditions were found, and then re-establishment of oligonucleotide microarray, to judge by similarity of the results of sample types. Using universal primers SUA and G07B in the detection after amplification and label involved more than 40 more for different species and genus of blend modes, increase their ability to distinguish between each other, as when there are multiple strains can also be detected in a sample and provide the basis for the clinical diagnosis. The detection technology is a good value.

[Key words] Oligonucleotide microarray, Pathogen, Detection

細(xì)菌的 16SrDNA 的堿基序列在被測定的情況下，根據(jù)可變區(qū)和保守區(qū)交錯排列，通用寡核苷酸芯片技術(shù)為病原菌的快速診斷提供了技術(shù)支持，可建立平行檢測多種病原菌的微陣列技術(shù)，在其保守區(qū)和特異區(qū)設(shè)計寡核苷酸探針，運用雜交的方法對檢測系統(tǒng)進(jìn)行分析，其結(jié)果的準(zhǔn)確率為89.5%。通用寡核苷酸芯片技術(shù)構(gòu)建的微陣列可鑒別出很多無法區(qū)分的大腸埃希菌和沙門菌，為難以分離的幽門螺桿菌鑒定提供了有效的技術(shù)手段。同時，通用寡核苷酸芯片技術(shù)實現(xiàn)了快速早期診斷的目的，適合臨床的實際需求。

1　寡核苷酸芯片技術(shù)檢測病原菌的重要性

由于人體體液的細(xì)菌感染往往比較兇險，尤其是神經(jīng)系統(tǒng)的病原菌感染，如不及時治療會危及患者生命。因此，需要快速檢測標(biāo)本中感染的病原菌，對細(xì)菌感染病原學(xué)診斷方法提供重要依據(jù)。過去傳統(tǒng)的檢測方法存在敏感度低，影響診斷結(jié)果及抗菌素的有效使用，導(dǎo)致很多神經(jīng)疾病患者的死亡率逐年升高。利用寡核苷酸芯片可以對常見病原菌的感染標(biāo)本進(jìn)行檢測，該技術(shù)具有靈敏度高、不受細(xì)菌生理條件和抗生素使用的限制的優(yōu)點。此外，寡核苷酸芯片技術(shù)可以根據(jù)所在地域、醫(yī)院病原菌的分布情況，同時特異檢測多種生物分子。但是點膜技術(shù)會直接影響到通用寡核苷酸芯片技術(shù)的穩(wěn)定性，因此寡核苷酸芯片技術(shù)還需要在醫(yī)學(xué)實驗室繼續(xù)研究探索。目前，以通用寡核苷酸芯片檢測為代表的技術(shù)成為最有價值的研究手段，此項通用寡核苷酸芯片技術(shù)已經(jīng)越來越多的應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）感染中病原菌DNA的擴(kuò)增和檢測，為細(xì)菌感染提供了快速的檢測手段，寡核苷酸芯片技術(shù)在病原微生物的檢測中有廣闊的應(yīng)用前景。

2　應(yīng)用通用寡核苷酸芯片技術(shù)檢測病原菌研究中存在的問題。

利用生物芯片檢測和鑒定常見病原菌技術(shù)制備寡核苷酸芯片，針對細(xì)菌的可變區(qū)設(shè)計探針，對探針進(jìn)行了驗證和篩選。根據(jù)一種含26條種特異性探針的試驗芯片，對通用寡核苷酸芯片的雜交和洗滌條件進(jìn)行摸索，得到新的數(shù)據(jù)，然后進(jìn)行混合樣品檢測試驗及靈敏度試驗，以相對信號強度為依據(jù)的信號陰陽性判斷思路，以及以特異性寡核苷酸為檢測方式。通常情況下，通用寡核苷酸芯片技術(shù)在確立檢測模式后，從已提取的模板庫可準(zhǔn)確地鑒定到種或?qū)俚乃?，但是由于在混合樣品很多信號模糊不清，個別菌種檢測結(jié)果需要進(jìn)一步驗證，靈敏度較低，檢測系統(tǒng)的功能無法滿足通用寡核苷酸芯片技術(shù)。

3　利用寡核苷酸芯片技術(shù)檢測人體內(nèi)的常見病原菌

3.1　檢測耐藥基因

寡核苷酸芯片技術(shù)對耐藥性檢測方法，主要受到培養(yǎng)法、時間、實驗結(jié)果不定因素較多的影響。該技術(shù)可同時檢測耐藥菌的多個耐藥基因，通過檢測突變位點來分析其耐藥機(jī)制，有利于在臨床上有效的使用抗生素。病原菌耐藥機(jī)制是通過水解而使抗生素失活，引起對超廣譜頭孢菌素類、單內(nèi)酰環(huán)菌素類的耐藥。例如：結(jié)核病的結(jié)核分支桿菌的耐藥性，其耐藥分子機(jī)制是由于其作用靶分子RNA聚合酶的 β 亞單位的編碼基因（rpoB）突變所致 [1]。

3.2　檢測病原菌毒素

寡核苷酸芯片技術(shù)檢測病原菌毒素，主要是根據(jù)ent基因制備微陣列，建立毒力因子微陣列，可確定大腸埃希菌致病性的靶基因，為毒力基因的確定提供了強有力的技術(shù)手段。該項技術(shù)用于檢測艾滋病病毒，根據(jù)病毒逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生的耐藥突變位點，將基因突變部位的全部序列構(gòu)建在基因芯片上，能夠有助于快速而有針對性的進(jìn)行檢測。檢測肝炎病毒（HCV）Livache的原理，是利用寡核苷酸芯片技術(shù)先確定HCV的基因型，將HCV基因探針固定于硅片上，然后將待測基因和芯片上的探針雜交，拉米夫定是抗乙肝病毒藥物，利用病毒的耐藥性突變誘導(dǎo)HBV產(chǎn)生耐藥株，達(dá)到對樣本檢測的目的。由此可見，寡核苷酸芯片是檢測HBV耐藥突變的一種可靠和有用的工具 [2]。

3.3　檢測人類乳頭狀瘤病毒

婦科檢驗中發(fā)現(xiàn)，低危險型別HPV常引起外生殖器濕疣，確定 HPV的型別對于探究腫瘤的病因及腫瘤的預(yù)防有重要臨床意義。通用寡核苷酸芯片技術(shù)進(jìn)入了廣泛研究和應(yīng)用，它具有操作簡便快速的優(yōu)越性，可以對婦科中的致病菌一次得出全部檢測結(jié)果 [2]。

4　結(jié)束語

目前，寡核苷酸芯片技術(shù)可以同時檢測特異多種生物分子。但點膜技術(shù)會直接影響到該方法的穩(wěn)定性，因此寡核苷酸芯片技術(shù)還需要在醫(yī)學(xué)實驗室繼續(xù)研究探索。