類檸檬苦素生物轉(zhuǎn)化與脫苦研究進展

王松林，彭 榮，崔 榕，殷鐘意，鄭旭煦,,*

（1.重慶工商大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院，重慶 400067；2.重慶工商大學(xué)教務(wù)處，重慶 400067；3.催化與功能有機分子重慶市重點實驗室，重慶 400067）

柑橘類水果是世界最重要的水果之一，目前總年產(chǎn)量超過10 300萬t。柑橘果實營養(yǎng)豐富，富含單糖、VC、類胡蘿卜素、類黃酮、類檸檬苦素、單萜、香豆素、吖啶酮、葉酸和甘油糖脂質(zhì)等，這些物質(zhì)對調(diào)節(jié)人體新陳代謝、保護人體健康大有裨益[1-2]。幾乎一半左右柑橘類水果被加工成果汁、果醬等食品，但苦味一直是柑橘產(chǎn)業(yè)的重要問題之一。引起苦味的物質(zhì)主要來自兩大類不同的植物化學(xué)家族：類黃酮（以柚皮苷為主）和類檸檬苦素（以檸檬苦素為主）[3]。檸檬苦素苦味閾值很低，在水溶液中為1.0 mg/L，在果汁中約為3.4 mg/L。檸檬苦素比柚皮苷約苦20倍[4]，且柑橘榨汁過程中出現(xiàn)的“后苦”現(xiàn)象，也是由檸檬苦素前體物在酶催化下轉(zhuǎn)化為檸檬苦素而引起的。因此，研究如何改善檸檬苦素的苦味顯得尤為重要。

1 類檸檬苦素的結(jié)構(gòu)與分類

類檸檬苦素（limonoids）是一類高度氧化的四環(huán)三萜類植物次生代謝物質(zhì)，主要存在于蕓香科（Rutaceae）和楝科（Meliaceae）植物的組織中，在葉柄花科（Cneoraceae）和苦木科（Harrisoniasp）中亦有分布[5]。迄今已分離出大約300多種類檸檬苦素化合物。1841年，首次分離得到檸檬苦素（又稱檸堿，limonin）；20世紀60年代Arigoni等[6]用化學(xué)和X射線衍射的方法確認了檸檬苦素的結(jié)構(gòu)，得到其分子式為C26H30O8，相對分子質(zhì)量為470[7]；1989年研究者發(fā)現(xiàn)類檸檬苦素的糖苷存在形式[8]。目前已從柑橘屬植物中分離出38種類檸檬苦素苷元和20種類檸檬苦素糖苷[9]。類檸檬苦素是立體結(jié)構(gòu)的配位化合物，其原型結(jié)構(gòu)包含或源自一種具有4,4,8-三甲基-17-呋喃固醇骨架的前體[5]。自然形成的類檸檬苦素結(jié)構(gòu)為D環(huán)的C17位上連有一個呋喃環(huán)，其C3、C4、C7、C16和C17上連有含氧官能團，除脫氧檸檬苦素外，C14和C15位上均有環(huán)氧結(jié)構(gòu)[10-11]（圖1）。acid）[19]。檸檬苦素是發(fā)現(xiàn)的6種天然苦味物質(zhì)中最苦的一種，諾米林次之，而宜昌素和諾米林酸等因含量較低而苦味不明顯[10,20]，6種苦味物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)式如圖1a～1f所示。

圖1 幾種重要類檸檬苦素的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Several important limonoids

類檸檬苦素苷元又可分為中性和酸性兩種類型[8-9]，其中酸性苷元結(jié)構(gòu)式如圖1g～1i所示。類檸檬苦素糖苷的結(jié)構(gòu)均是苷元在C17位與一分子葡萄糖以糖苷鍵的形式結(jié)合，如圖1j～1l所示。苷元與糖苷結(jié)構(gòu)的差別導(dǎo)致了性質(zhì)的差異，苷元的水溶性差且具有明顯苦味，而糖苷具有良好的水溶性且?guī)缀鯖]有苦味。

2 類檸檬苦素的自然生物轉(zhuǎn)化

脫乙酰諾米林酸（角鯊烯，squalene）被認為是已知的蕓香科柑橘屬中類檸檬苦素的前體物[21-22]，它是在莖的韌皮部由醋酸、甲羥戊酸以及法尼醇磷酸等生物合成的，放射性示蹤實驗發(fā)現(xiàn)，脫乙酰諾米林酸轉(zhuǎn)化成了諾米林[23]。脫乙酰諾米林酸和諾米林都在莖的韌皮部合成，然后轉(zhuǎn)移到植物的其他組織中，如葉、果實、種子等。在種子和果實中脫乙酰諾米林酸至少會通過4種獨立的代謝途徑[2,24-26]，如檸檬苦素途徑（limonin pathway）、卡拉敏途徑（calamin pathway）、宜昌素途徑（ichangensin pathway）和7-醋酸酯類檸檬苦素途徑（7-acetatelimonoid pathway）等轉(zhuǎn)化成類檸檬苦素。在果實成熟過程中，類檸檬苦素苷元會大量轉(zhuǎn)化成沒有苦味的類檸檬苦素糖苷，其自然生物轉(zhuǎn)化途徑詳見圖2[5]。

在分離獲得的38種類檸檬苦素苷元中，只有6種是具有苦味的[9,12-14]，包括檸檬苦素[5]、諾米林（nomilin）[15]、黃柏酮酸（obacunone acid）[16]、宜昌素（ichangin）[17]、脫氧檸檬苦酸（deoxylimonoic acid）[18]和諾米林酸（nomilin

圖2 柑橘屬植物中類檸檬苦素的生物轉(zhuǎn)化途徑[5]Fig.2 Proposed biosynthetic pathways of limonoids in citrus[5]

柑橘屬類植物體內(nèi)主要有5種酶參與到檸檬苦素的生物合成及轉(zhuǎn)化過程中[24]。乙?；呀饷福╝cetyllyase）促進脫乙酰諾米林酸轉(zhuǎn)化為脫乙酰諾米林，只存在于韌皮部。檸檬苦素脫氫酶（limolin dehydrogenase）將檸檬苦素轉(zhuǎn)化成17-脫氫檸檬苦酸A環(huán)內(nèi)酯，其含量非常少。另一類酶存在于柑橘屬生長的各階段，如莖、葉、果汁、果皮和種子中，并將檸檬苦素轉(zhuǎn)化成對應(yīng)的檸檬苦素糖苷；如檸檬苦素D環(huán)內(nèi)酯水解酶（limonoid D-ring lactone hydrolase，LDRLase）在種子中促進D環(huán)的內(nèi)酯化，且新生成的單內(nèi)脂衍生物（monolactones）在這種酶的作用下繼續(xù)轉(zhuǎn)化為雙內(nèi)酯（dilactones）；檸檬苦素-尿苷二磷酸（uridine diphosphate，UDP）-糖基轉(zhuǎn)移酶（limonoid-UDP-glycosyltransferase，LGTase）在果肉組織及種子中將檸檬苦酸A環(huán)內(nèi)酯（1imonoate A-ring lactone，LARL）轉(zhuǎn)化成不具苦味的檸檬苦素配糖體（1imonoid glucosides，LG）[8-10,26]；檸檬苦素β-葡萄糖苷酶在種子萌發(fā)過程中催化檸檬苦素苷元水解成檸檬苦素糖苷和糖。

3 “后苦”現(xiàn)象

成熟柑橘果實中檸檬苦素的含量極少，但由于在柑橘果實中含有大量的檸檬苦素前體物質(zhì)——非苦味的LARL，榨汁后果汁在pH＜6.0、加熱、冰凍或機械損傷等逆境條件下，LARL在檸檬苦素D環(huán)內(nèi)酯水解酶的催化下迅速轉(zhuǎn)化為具有強烈苦味的檸檬苦素，產(chǎn)生“后苦”（delayed bitterness）或“延遲苦味”的現(xiàn)象[14,26-27]。柑橘果實中存在的檸檬苦素D環(huán)內(nèi)酯水解酶受反應(yīng)體系的pH值影響很大，在pH＜6.0時，促進檸檬苦素D環(huán)內(nèi)酯化；在pH＞8.0時，水解檸檬苦素D環(huán)內(nèi)酯成檸檬苦酸A環(huán)內(nèi)酯，其轉(zhuǎn)化過程見圖3。

圖3 “后苦”現(xiàn)象的轉(zhuǎn)化途徑Fig.3 Mechanism of delayed bitterness

4 類檸檬苦素的生物脫苦方法

脫除類檸檬苦素苦味物質(zhì)的方法主要有物理法和生物法。物理脫苦法主要包括吸附脫苦、膜分離脫苦、超臨界CO2脫苦、屏蔽法脫苦和添加苦味抑制劑脫苦等。生物脫苦法主要包括自然生物轉(zhuǎn)化脫苦（如類檸檬苦素苷元轉(zhuǎn)化為類檸檬苦素糖苷等）、酶法脫苦、固定化細胞脫苦和基因工程脫苦等。已有的研究表明，生物脫苦法是當(dāng)前改善類檸檬苦素苦味的首選方法[3,8,28-30]。

4.1 酶法脫苦

生物酶法脫苦具有專一性強、對柑橘果汁風(fēng)味和營養(yǎng)成分無破壞、條件溫和、效果好等特點，是較為理想的脫苦方法。作用于類檸檬苦素的脫苦酶主要有：檸檬苦素環(huán)氧酶、檸檬苦素脫氫酶、檸檬苦醇脫氫酶、反式消除酶（transeliminase）、乙?；呀饷福╝cetyl-lyase）等。Puri等[31]報道酶促檸檬苦素還原為非苦衍生物通過3 條路線實現(xiàn)，并且轉(zhuǎn)化程度的大小取決于酶的分解代謝水平。3 條轉(zhuǎn)化途徑如圖4[32]所示。

圖4 檸檬苦素在酶作用下的轉(zhuǎn)化途徑[32]Fig.4 Biotransformation pathway of limonin under the action of enzymes[32]

檸檬苦素脫氫酶可在不同微生物如球形節(jié)桿菌、假單胞菌321-18和束紅球菌中分離純化得到，該酶可以防止新鮮提取的柑橘果汁中檸檬苦素的產(chǎn)生，通過促進檸檬苦酸A環(huán)內(nèi)酯轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的無苦味衍生物17-脫氫檸檬苦酸A環(huán)內(nèi)酯，而不會被轉(zhuǎn)換成檸檬苦素[28]。不同類型微生物中的脫苦酶及其轉(zhuǎn)化途徑如表1所示。

表1 不同類型微生物中脫苦酶及其轉(zhuǎn)化檸檬苦素的途徑Table1 Debittering enzyme types in microorganisms responsible for transformation pathways of limonin

4.2 固定化細胞脫苦

適用于類檸檬苦素生物轉(zhuǎn)化的酶在實際應(yīng)用中因果汁的低pH值而易失活，且生產(chǎn)成本高，因此在工業(yè)生產(chǎn)中受到很大程度的限制。利用固定化細胞脫苦技術(shù)，不僅可省去復(fù)雜的酶分離提純步驟，保持細胞內(nèi)酶活性的穩(wěn)定性，還可將菌種連續(xù)培養(yǎng)復(fù)壯使用。

固定化細胞常用菌有假單胞菌、束紅球菌、球形節(jié)桿菌、球形節(jié)桿菌Ⅱ等，其固定化材料的選擇也非常重要。Iborra等[40]將束紅球菌的細胞固定在κ-角叉藻聚糖上，可脫除大約60%的檸檬苦素；Hasegawa等[33,37]還將厭氧棒狀桿菌固定在丙烯酰胺上，含有20～50 mg/kg諾米林的柑橘汁一次通過便可完全脫除苦味，該系統(tǒng)連續(xù)使用15次后仍然有效。羅自生等[41]將醋酸桿菌于固定化細胞生物反應(yīng)器中，以2 mL/min流速處理柑橘汁，檸檬苦素脫苦率達58.3%，該反應(yīng)器每次處理柑橘汁120 mL，可連續(xù)使用11次，脫苦率仍可達到51.08%。Vaks等[42]從土壤中分離出鮑曼不動桿菌，將該菌裝入滲透性囊袋，置于高檸檬苦素果汁中處理2 h，檸檬苦素含量降低了50%，而果汁中其他營養(yǎng)成分沒有損失。

固定化細胞利用的菌株中惡臭假單胞菌G7的檸檬苦素生物轉(zhuǎn)化能力也被證實[43-44]。惡臭假單胞菌株是公認的一種卓越的營養(yǎng)機會主義和范式代謝多功能的微生物，能利用檸檬苦素進行代謝。Chatterjee等[22]也報道稱，惡臭假單胞菌MTCC1072可分解代謝單萜檸檬烯為非苦衍生物紫蘇醇和反式-對薄荷-6-烯-2,8-二醇。

然而固定化細胞由于細胞膜對基質(zhì)和產(chǎn)物的滲透性屏障會導(dǎo)致反應(yīng)速率較低。Kondo等[45]提出通過減少滲透性屏障以提高固定化細胞催化的有效性，已驗證了可通過使用有機溶劑、清潔劑、鹽、酶、化學(xué)品和電脈沖的方法來增加細胞通透性[43,46-48]。透化作用簡化了細胞的通透性屏障，使物質(zhì)穿過細胞膜的自由流動過程變得更加容易。這樣微生物細胞保留其內(nèi)在的組織及必要的幾種輔酶因子而發(fā)揮作用[46,49-50]。

4.3 基因工程脫苦

固定化細胞代謝檸檬苦素的生物轉(zhuǎn)化率很低，而阻礙了其實際應(yīng)用的可行性。微生物具有耐酸和代謝檸檬苦素酶基因這兩種生存優(yōu)勢，而遺傳基因操縱工具的不成熟也阻礙了微生物的充分開發(fā)。

目前，關(guān)于檸檬苦素D環(huán)內(nèi)酯水解酶及其基因的研究很少，研究主要集中在提高檸檬苦素D環(huán)內(nèi)酯水解酶活性的方法以及在假單胞菌中D環(huán)內(nèi)酯水解酶的活性方面[13,51]。而通過基因工程技術(shù)增強檸檬苦素-UDP-糖轉(zhuǎn)移酶活性的研究已成為培植脫苦轉(zhuǎn)基因柑橘和高類檸檬苦素糖苷轉(zhuǎn)基因柑橘果樹的重要突破口[2,27]。Kita等[52]分離出了能編碼翻譯LGTase的cDNA克隆基因（CitLGT），研究表明CitLGT是柑橘基因組中的一個單拷貝基因，在臍橙果實發(fā)育過程中，CitLGT mRNA轉(zhuǎn)錄物含量的變化與檸檬苦素苷元含量的波動變化一致，說明CitLGT轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)檸檬苦素類似物苷元轉(zhuǎn)化為其糖配體。Karim等[53]提出，柑橘類水果中的苦味物質(zhì)含量可以通過在分子水平上操縱酶的活性而得到降低，他們還建議LGTase基因可被引入到細菌細胞，用來作用于固定化細胞以轉(zhuǎn)換類檸檬苦素為其配糖體。基因工程的植株再生系統(tǒng)已有報道，且已被證明通過改變胚胎的愈傷組織培養(yǎng)基，用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法可以獲得愈傷組織胚胎。因此可以有針對性地通過柑橘基因遺傳工程最大限度地獲取檸檬苦素配糖體，通過自然生物轉(zhuǎn)化將檸檬苦素等苦味物質(zhì)轉(zhuǎn)化成非苦衍生物，以解決柑橘類果汁的苦味問題。

5 結(jié) 語

用于檸檬苦素生物轉(zhuǎn)化的酶因其穩(wěn)定性差、易變性失活、成本較高而不便于工業(yè)連續(xù)化生產(chǎn)。固定化細胞省去了酶的分離提純步驟，保持細胞內(nèi)酶的穩(wěn)定性，可連續(xù)發(fā)酵用于生產(chǎn)，但細胞膜對基質(zhì)和產(chǎn)物的滲透性屏障導(dǎo)致反應(yīng)速率較低。通過選育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)酶菌株提高酶活性，以及通過物理化學(xué)和生物方法來增加全細胞通透性，選擇合適的固定化材料等是目前酶法脫苦及固定化細胞脫苦的主要研究方向。在脫苦研究中，同時也發(fā)現(xiàn)類檸檬苦素具有多種生物活性，如具有抗癌、抗人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）、抗炎、抗氧化性、抗菌、鎮(zhèn)痛、除蟲、調(diào)節(jié)血糖等作用[12,54]。攝取類檸檬苦素的最好途徑是飲用果汁或食用鮮果，然而檸檬苦素等苦味物質(zhì)又大大降低了人們的食欲，如何既不損失原有果汁的風(fēng)味和營養(yǎng)成分，又能實現(xiàn)高效脫苦，既簡便又低成本地消除柑橘果汁中的苦味物質(zhì)將是今后研究的重要方向。研究表明，無苦味的類檸檬苦素配糖體的生物學(xué)活性及藥理作用等同于檸檬苦素等苦味物質(zhì)[54-55]。因此，在保證果實中類檸檬苦素應(yīng)用價值的前提條件下，如何利用分子生物學(xué)的手段和方法將檸檬苦素等苦味物質(zhì)轉(zhuǎn)化成類檸檬苦素配糖體或17-脫氧檸檬苦素等非苦衍生物，從根本上消除檸檬苦素等苦味物質(zhì)，將具有廣闊的應(yīng)用前景。

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