火龍果皮原花青素提取純化及定性分析

楊志娟，曾 真*，吳曉萍

（廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524025）

火龍果（Hylocereus undatus），屬仙人掌科（Cactaceae）量天尺屬（Hylocereus）和蛇鞭柱屬（Selenicereus）植物。原產(chǎn)于巴西、墨西哥等中美洲熱帶沙漠地區(qū)[1]，現(xiàn)人工栽培遍及泰國、越南、中國臺灣、哥倫比亞等20多個國家和地區(qū)。近10 a來，我國廣西、貴州、廣東、海南等地火龍果種植面積迅速擴大[2]?；瘕埞诟星逑?，甜而不膩，富含糖、有機酸、蛋白質(zhì)，其中膳食纖維含量2.33%，高于蘋果纖維含量（1.2%）[3]。常食用可具有降低血糖、膽固醇、血壓、尿酸等功效[3]。

火龍果皮含有原花青素[4]。原花青素是植物中廣泛存在的一類多酚類化合物的總稱，具有清除自由基、抗氧化的活性，并且在抗炎癥、抑制腫瘤、保護血管等方面發(fā)揮著重要的作用[5]，其在功能性食品[6-8]、醫(yī)藥[9]、化妝品[10]行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景。

從火龍果皮中提取所得的原花青素為粗提取物，其中含有大量雜質(zhì)，需要進行純化。大孔吸附樹脂為吸附性和篩選性原理相結(jié)合的分離材料，是近10 a來發(fā)展起來的一類有機高分子聚合物吸附劑，其吸附實質(zhì)為表面物理吸附現(xiàn)象，是氫鍵相互作用或范德華引力作用的結(jié)果，同時大孔吸附樹脂本身的多孔結(jié)構(gòu)使其對分子大小不同的物質(zhì)具有篩選作用。通過這種吸附和篩選，有機化合物根據(jù)吸附力的不同及分子質(zhì)量的大小，經(jīng)一定溶劑洗脫而達到分離、純化、富集、濃縮等不同目的[11]。楊青等[12]對不同極性的10種大孔吸附樹脂的靜吸附和解吸性能進行比較后，確定XDA-7型弱極性大孔吸附樹脂為純化山竹殼原花青素的最佳分離樹脂。劉睿等[13]以高粱為原料，采用大孔吸附樹脂法純化其原花青素，得到低聚體原花青素的純度高于95 g/100 g。

本研究采用大孔吸附樹脂法純化原花青素，建立火龍果皮中原花青素的提取純化工藝，分離出具有生物活性的原花青素，這不但在醫(yī)藥和食品行業(yè)有廣闊的應(yīng)用前景，而且也為當?shù)刎S富的火龍果的資源開發(fā)和利用提供一條新途徑，提高火龍果的利用率和經(jīng)濟效益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

火龍果皮原花青素粗提物按前火龍果皮中原花青素提取及含量的測定實驗[14]最佳條件制得。

葡萄糖、石油醚、氫氧化鈉、乙醇、鹽酸、硫酸鉀、硫酸銅、硫酸（均為分析純） 廣州化學試劑廠；甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜純） 德國Merk公司；AB-8大孔樹脂、DM130大孔樹脂、ADS-17大孔樹脂杭州普修生物科技有限公司；香草醛（分析純）、葡萄籽原花青素標準對照品（純度99.27%） 天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

101-2 型電熱鼓風干燥箱 上海浦東躍欣科學儀器廠；TD5臺式離心機 長沙英泰儀器有限公司；AUY120電子天平 日本島津公司；501s型超級恒溫水槽（水浴鍋） 上海躍進醫(yī)療器械廠；TDL-5-A型低離心機 海安亭科學儀器制作廠；DHL-A電腦恒流泵、智能編程層析箱 上海青浦滬西儀器廠；RE52-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海瀘西分析儀器廠有限公司；TU-1901雙束光紫外-可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 火龍果皮原花青素的純化及定性分析實驗流程

圖1 實驗流程圖Fig.1 Flow chart of experiments

1.3.2 原花青素的測定

本實驗選用靈敏度高重復(fù)性好的低質(zhì)量濃度香草醛-鹽酸法[15]。在酸性條件下，原花青素組成單元兒茶素上的羥基和香草醛發(fā)生縮合反應(yīng)，在濃酸作用下形成的產(chǎn)物變成有色的正離子，可采用分光光度法在500 nm波長處檢測。

配制顯色劑：10 g/L香草醛溶液和8%的鹽酸溶液體積比1∶1，現(xiàn)配現(xiàn)用。

原花青素標準曲線的制作：準確稱取葡萄籽原花青素標準對照品20 mg，用甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標準溶液。分別取1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于容量瓶（10 mL）中，用甲醇定容至10 mL。從中各取1 mL分別加入5 mL顯色劑，搖勻，避光，在25℃條件下反應(yīng)30 min，以甲醇為空白對照于500 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線。得到吸光度（Y）與原花青素質(zhì)量濃度（X）的標準回歸方程：Y=0.403 2X－0.009 3，R2=0.997 6。

1.3.3 大孔吸附樹脂的預(yù)處理及再生

預(yù)處理：分別稱取3種不同類型的大孔吸附樹脂（AB-8、DM130、ADS-17型），用體積分數(shù)95%的乙醇浸泡，直至上清液用蒸餾水沖洗無白色渾濁現(xiàn)象為止，用蒸餾水洗至洗滌液無乙醇氣味。

再生：將活性已明顯下降的大孔吸附樹脂用異丙醇浸泡1 d，用蒸餾水洗至流出液無醇味；用鹽酸溶液（1 mol/L）浸泡1 d，用蒸餾水沖洗至流出液呈中性；用NaOH溶液（1 mol/L）浸泡1 d，用蒸餾水沖洗至流出液呈中性。

1.3.4 大孔樹脂吸附量及解吸率的測定[16]

1.3.4.1 吸附量的測定

稱取經(jīng)預(yù)處理的樹脂各1 g于250 mL的三角瓶中，準確加入質(zhì)量濃度為5.92 mg/mL原花青素粗品l00 mL，使原花青素含量對吸附樹脂是過量的，密封并置空氣浴搖床上振蕩，溫度為25℃，轉(zhuǎn)速為100 r/min，振蕩7 h，充分吸附后，過濾，測定濾液中剩余原花青素的質(zhì)量濃度，按式（1）計算各樹脂的吸附量。

式中：ρ1為吸附前溶液質(zhì)量濃度/（mg/mL）；ρ2為吸附后溶液質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為溶液體積/mL；M為樹脂質(zhì)量/g。

1.3.4.2 解吸率的測定

取吸附后的樹脂置于250 mL三角瓶中，分別精密加入70%乙醇100 mL，密封并置空氣浴搖床上振蕩，溫度為25℃，搖床轉(zhuǎn)速為100 r/min，振蕩7 h，過濾，測定濾液中原花青素的質(zhì)量濃度，計算解吸率。

式中：ρ為濾液中原花青素的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為溶液體積/mL；M為樹脂質(zhì)量/g；m為樹脂吸附量/（mg/g）。

1.3.5 上樣流速的選擇

處理好的樹脂濕法裝柱，平衡靜置后，將原花青素的粗提液以1、2、3 mL/min速率分別上柱吸附，每10 mL收集1 管，用1.3.2節(jié)方法測定流出液吸光度，繪制泄漏曲線。當流出液中原花青素質(zhì)量濃度達進樣質(zhì)量濃度的1/10時認為已達到吸附的穿透點，停止進樣，計算吸附量。

1.3.6 解吸流速的選擇

按照動態(tài)吸附的最佳條件準備已達最大上樣量的柱子，吸附平衡后再用50%的乙醇溶液以不同流速1、2、3 mL/min洗脫，每20 mL收集1 管，用1.3.2節(jié)方法測定流出液吸光度，繪制動態(tài)解吸圖并計算解吸率。

1.3.7 解吸劑體積分數(shù)的選擇

按照動態(tài)吸附的最佳條件準備已達最大上樣量的柱子，分別用體積分數(shù)10%、30%、50%、70%、90%的乙醇溶液，以相同的流速進行洗脫，每20 mL收集1 管，過濾后，用1.3.2節(jié)方法測定流出液吸光度，繪制動態(tài)解吸圖。

1.3.8 火龍果皮中原花青素提取物的定性分析

原花青素水溶液經(jīng)AB-8大孔樹脂純化后，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、用水稀釋、冷凍真空干燥后，制得原花青素精制品粉末，冷藏備用。

1.3.8.1 花青素反應(yīng)

準確稱取適量相同質(zhì)量的原花青素標準品、原花青素精制品，用60%的乙醇溶液溶解后，利用香草醇-鹽酸法比色，觀察溶液顏色變化，即溶液從無色變?yōu)榧t色或者紅色加深。

1.3.8.2 高效液相色譜-質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometer，HPLC-MS）分析[17]

采用HPLC-MS法對原花青素精制品進行定性定量分析。準確稱取10 mg火龍果皮原花青素精制物，用甲醇溶解定容至10 mL，4℃避光保存，測定時移取1.0 mL上機測定。

標準曲線制作：準確稱取10 mg原花青素標準品用甲醇溶解定容至10 mL，4℃避光保存，此為標準儲備液（1 mg/mL），準確吸取0、20、40、60、80、100 μL標準儲備液，并用甲醇定容到1 mL，配制成質(zhì)量濃度分別為0、20、40、60、80、100 mg/L的標準溶液，上機測定。

色譜條件：色譜柱：ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱溫：30℃；進樣量：10 μL；流動相：0.1%甲酸溶液（A）和0.1%甲酸的乙腈溶液（B）；流速：0.2 mL/min。梯度洗脫程序見表1。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子模式；離子掃描范圍m/z 200～1 200；霧化氣溫度350℃；電噴霧電壓－4 000 V；源內(nèi)碎裂電壓135 V。

表1 梯度洗脫程序Table1 Gradient elution procedure

2 結(jié)果與分析

2.1 不同大孔樹脂對原花青素吸附、解吸性能

通常，樹脂的吸附能力與其表面極性、比表面、孔結(jié)構(gòu)、孔隙率等有關(guān)。本實驗選擇3種極性不同的大孔樹脂測定原花青素吸附、解吸性能，結(jié)果如表2所示。

表2 不同大孔樹脂對原花青素吸附、解吸性能Table2 The adsorption and desorption capacities of different macroporous adsorption resins for proanthocyanidins

不同的樹脂對原花青素的吸附能力和解吸能力差異較大。AB-8吸附量最大，DM130次之。AB-8和DM130有較好的解吸率，ADS-17稍差。綜合考慮吸附率和解吸率2個因素，本實驗原花青素的純化采用AB-8大孔樹脂。

2.2 不同上樣流速對AB-8大孔樹脂吸附原花青素的影響

圖2 上樣流速對動態(tài)吸附效果的影響Fig.2 Effect of sample loading flow rate on dynamic adsorption efficiency

由圖2可知，上樣流速越快，泄漏點出現(xiàn)得越早，吸附量越小，不利于樹脂吸附原花青素。1、2、3 mL/min上樣流速吸附量分別為37.7、44.8、49.4 mg/g。當上樣流速為1 mL/min時，雖然泄漏點出現(xiàn)最遲，但因為流速慢，導(dǎo)致循環(huán)周期延長。綜合考慮，上樣流速選擇2 mL/min。

2.3 不同解吸流速對AB-8大孔樹脂動態(tài)解吸效果的影響

由于3 根柱子上樣條件相同，即樣液中原花青素含量跟吸附流出液中含原花青素總量相同，解吸液中含有原花青素總量等于流出液體積與原花青素質(zhì)量濃度乘積，即圖中峰面積，由圖3可知，1 mL/min解吸流速的解吸率最大，其次是2 mL/min，解吸液以1 mL/min的流速進行洗脫得到的峰形較窄，峰值最高；2 mL/min的洗脫峰比1 mL/min的峰形矮且拖尾比較嚴重；3.0 mL/min的峰形最矮，拖尾最嚴重。因此選擇解吸流速為1 mL/min。

圖3 不同解吸流速對動態(tài)解吸的影響Fig.3 Effect of elution flow rate on dynamic desorption

2.4 不同乙醇體積分數(shù)對動態(tài)解吸效果的影響

圖4 不同乙醇體積分數(shù)對動態(tài)解吸效果的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on dynamic adsorption efficiency

由于原花青素上樣質(zhì)量濃度跟體積量一樣，根據(jù)圖4可知，乙醇體積分數(shù)為50%時，峰面積最大，即解吸率最大，且峰值最高，其次，90%乙醇解吸率較好，但拖尾嚴重。50%乙醇已基本可以達到較高的回收率，因此選體積分數(shù)為50%乙醇作為解吸溶液。

2.5 花青素反應(yīng)

原花青素在酸性條件下加熱生成紅色的花青素，這一反應(yīng)是原花青素最具特征的化學反應(yīng)，對標準品和樣品進行花青素反應(yīng)實驗，樣品跟標準品溶液均呈紅色，顏色接近，即兩樣品均有反應(yīng)，說明樣品為原花青素。

2.6 HPLC-MS分析

由圖5可知，原花青素的標準品各聚體有6個峰值，分別在15.64 min（M1）、17.94 min（M2）、21.01 min（M3）、23.41 min（M4）、24.46 min（M5）、27.72 min（M6）出峰，各峰峰形良好，且分離度較高，說明HPLC-MS法能夠有效分離原花青素的各聚體；火龍果皮原花青素精制品中有2個峰值，分別在21.08 min（M7）、24.31 min（M8）出峰，與標準品峰值M3、M5很接近，說明該精制品中含有原花青素或其類似物。應(yīng)，說明樣品為原花青素。

圖5 空白對照（a）、原花青素標準品（b）、火龍果皮原花青素精制品（c）的總離子色譜圖Fig.5 TICs of blank control (a), proanthocyanidins standard (b) and pitaya peel procyanidin extract (c)

圖6 原花青素標準品質(zhì)譜圖Fig.6 ESI-MS spectra of proanthocyanidins standard

由圖6可知，原花青素標準品在負離子模式下形成的準分子離子[M－H]－有m/z 289.0、441.0、577.2、579.1、729.2，耦合離子[2M－H]－有m/z 579.2。結(jié)合圖3分析，峰M1、M2、M3、M4、M5中均含有m/z 289.0，這些離子峰為兒茶素峰或表兒茶素峰或準分子離子m/z 441.0失去沒食子?；纬傻碾x子峰；峰M1、M3均含有m/z 577.0，這些離子峰為二聚體峰；峰M2、M5均含有m/z 579.2，該離子為m/z 289.0的耦合離子；峰M6含有m/z 441.0，此離子峰為表兒茶素沒食子酸酯峰；峰M3、M4、M5、M6均含有m/z 729.0，該離子為二聚單酯準分子離子。

火龍果皮原花青素精制品在相同條件下形成的離子有m/z 289.0、577.2、579.1，結(jié)果見圖7，推測該精制品中含有的原花青素為兒茶素、表兒茶素和二聚體。

圖7 火龍果皮原花青素精制品質(zhì)譜圖Fig.7 ESI-MS spectra of pitaya peel procyanidin extract

取10 μL 0、20、40、60、80、100 mg/L的原花青素標準溶液進樣，參照1.3.8.2節(jié)的色譜條件和質(zhì)譜條件，測得峰面積，以原花青素標準品的總峰面積（各個峰面積之和）（Y）對于質(zhì)量濃度（X）進行回歸分析，得到線性回歸方程：Y=0.292 9X+0.211 4，R2=0.999 7。

線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2＞0.99，說明原花青素的峰面積與質(zhì)量濃度之間有良好的線性關(guān)系，由此計算得出樣品溶液中原花青素的質(zhì)量濃度為9.665 mg/mL，火龍果皮原花青素精制品純度為96.65%。

3 結(jié) 論

通過比較3種不同的大孔樹脂對原花青素的吸附和解吸能力，確定火龍果皮中原花青素粗提物的最佳純化樹脂為AB-8樹脂。AB-8樹脂純化的最佳工藝為上樣流速2 mL/min、解吸流速1 mL/min、解吸劑體積分數(shù)50%，在此條件下，得到火龍果皮原花青素精制品并通過原花青素反應(yīng)與HPLC-MS定性分析，證實該精制品中含有的原花青素為兒茶素、表兒茶素和二聚體，且原花青素純度為96.65%。

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