新型親和雙水相成相劑Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ)的制備*

彭 帥，鄧 剛，劉 耀，王怡梅

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

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新型親和雙水相成相劑Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ)的制備*

彭 帥，鄧 剛，劉 耀，王怡梅

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

以小分子表面活性劑Triton X-100為載體，采用環(huán)氧氯丙烷(ECH)活化法偶聯(lián)亞氨基二乙酸(IDA)，通過配位反應(yīng)螯合Cu(Ⅱ)，合成了一種新型親和雙水相成相劑Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ)，并對(duì)其合成條件進(jìn)行了優(yōu)化.結(jié)果表明：最佳活化工藝為n(ECH)∶n(Triton X-100)=2∶1,n(BF3)∶n(Triton X-100)=1∶25，冰浴反應(yīng)22 h，按n(NaOH)∶n(Triton X-100)=1∶1加入NaOH，環(huán)氧化反應(yīng)3 h，環(huán)氧產(chǎn)物得率達(dá)到72.4%；最佳偶聯(lián)工藝為pH 13條件下，加入等摩爾的IDA，55 ℃反應(yīng)21 h，IDA的偶聯(lián)率為76.3%；最佳螯合工藝為在0.05 mol/L醋酸鈉溶液中，n(CuSO4)∶n(Triton X-100-IDA)=1∶1，室溫反應(yīng)6 h，Cu(Ⅱ)的螯合率可達(dá)80.5%.通過測(cè)定Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ)與陽離子型疏水改性聚氧乙烯(HM-EO)所構(gòu)成的雙水相系統(tǒng)的相圖,知兩者可形成帶親和配基的穩(wěn)定雙水相系統(tǒng).

Triton X-100；雙水相系統(tǒng)；固定化金屬親和分配;Cu(Ⅱ)

固定化金屬離子親和色譜(Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography，IMAC)1975年由Porath等[1]提出，是一種利用特異性親和作用分離蛋白質(zhì)的方法，具有條件溫和、簡(jiǎn)單快捷等優(yōu)勢(shì)，但由于其分離處理量有限、回收利用困難等導(dǎo)致該方法使用成本相對(duì)較高[2-4].如果把這種親和介質(zhì)引入到雙水相系統(tǒng)中，不僅可以進(jìn)行批次可循環(huán)萃取，大幅度降低使用成本，而且可以顯著提高雙水相的分配效率.文獻(xiàn)[5]利用GMA-co-EDMA為載體制備得到了GMA-co-EDMA-IDA-Cu(Ⅱ)，并將其嘗試用于谷胱甘肽的分離.夏海鋒等[6]通過在瓊脂糖微球上偶聯(lián)亞氨基二乙酸(IDA)并螯合Ni(Ⅱ)，得到了一種鎳離子親和層析介質(zhì)，并成功用于純化基因工程目標(biāo)蛋白酶.其他已合成的可用于雙水相系統(tǒng)的親和成相劑包括dextran-IDA-Cu(Ⅱ)和PEG-IDA-Cu(Ⅱ)[7-8]，研究表明這類介質(zhì)可顯著提高雙水相萃取系統(tǒng)的選擇性分配系數(shù).因此，研究與開發(fā)新型親和作用主導(dǎo)雙水相成相劑已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn).

聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)是一種非離子型小分子表面活性劑，在水溶液中對(duì)膜蛋白具有增溶作用，并且具有良好的生物相容性，因此被廣泛用作雙水相系統(tǒng)的成相劑[9-10].本實(shí)驗(yàn)選用Triton X-100為載體，以環(huán)氧氯丙烷(ECH)為活化劑，IDA為螯合劑，Cu(Ⅱ)為配體，合成了一種新型親和雙水相成相劑Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ)，并通過對(duì)活化反應(yīng)過程中活化劑(ECH)、催化劑(BF3)和反應(yīng)物NaOH的濃度、偶聯(lián)反應(yīng)過程中IDA的濃度及各反應(yīng)過程的時(shí)間等因素的考察，優(yōu)化了制備工藝，旨在獲得高效、穩(wěn)定、高性能的親和作用雙水相成相劑.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

疏水改性聚氧乙烯(HM-EO)購(gòu)自Akzo Nobel Surface Chemistry公司(瑞典)；Triton X-100(C34H62O11，純度>98%，上海生工生物工程有限公司進(jìn)口分裝，Mr為647);環(huán)氧氯丙烷、三氟化硼乙醚溶液、亞氨基二乙酸均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);五水硫酸銅(上海山浦化工有限公司).其他試劑均為市售分析純.

UV-2550紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津公司)；LC218制備型液相色譜系統(tǒng)(美國(guó)Agilent公司)；6230 Accurate-Mass TOF LC/MS系統(tǒng)(美國(guó)Agilent公司)；KjelFlex K-360全自動(dòng)凱氏定氮儀(瑞士Buchi公司)；877 Titrino Plus自動(dòng)滴定儀(瑞士Metrohm公司).

1.2 Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ)的制備

1.2.1 Triton X-100上羥基的活化

首先，在三氟化硼的催化下，環(huán)氧氯丙烷開環(huán)并與小分子表面活性劑Triton X-100的羥基反應(yīng)生成氯代物；然后，在氫氧化鈉的作用下氯代物脫去氯化氫，閉環(huán)形成環(huán)氧活化Triton X-100.反應(yīng)過程如圖1所示.

1.2.2 IDA的偶聯(lián)

在0.5 mol/L NaOH溶液中，緩慢加入IDA和環(huán)氧活化Triton X-100，攪拌至完全溶解，55 ℃水浴反應(yīng)21 h，冷卻后將反應(yīng)液pH調(diào)為中性，2倍體積的氯仿萃取，脫溶劑并干燥，得到Triton X-100-IDA.反應(yīng)式如圖2(a)所示.

1.2.3 金屬離子Cu(Ⅱ)的螯合

在0.05 mol/L醋酸鈉溶液中，緩慢地加入Triton X-100-IDA和CuSO4·5H2O，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)6 h，2倍體積的氯仿萃取，脫溶劑并干燥，得到Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖2(b).

1.3 環(huán)氧產(chǎn)物含量的測(cè)定

環(huán)氧產(chǎn)物含量采用四乙基溴化銨-高氯酸非水滴定法[11]測(cè)定.準(zhǔn)確稱取0.5 g試樣溶于5 mL氯仿中，加入4 mL冰醋酸，準(zhǔn)確加入2 mL四乙基溴化銨和3滴結(jié)晶紫指示劑，混合均勻，用高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，直至溶液顏色由藍(lán)綠色變?yōu)榫G色.

上式中：V為滴定所消耗高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V0為空白滴定所消耗高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；C為高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；M為Triton X-100的相對(duì)分子質(zhì)量；W為所稱取試樣的質(zhì)量，g；w為樣品中Triton X-100的質(zhì)量分?jǐn)?shù).

1.4 IDA偶聯(lián)量的測(cè)定

凱氏定氮法，通過測(cè)定產(chǎn)物的含氮量換算出產(chǎn)物中IDA的含量.

1.5 Cu(Ⅱ)螯合量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取一定量的Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ)，用0.05 mol/L EDTA溶液(pH=8.0)分解螯合的Cu(Ⅱ)，定容，以EDTA溶液為空白，在740 nm處測(cè)定吸收值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到Cu(Ⅱ)的含量[12].

1.6 LC/MS分子量測(cè)定

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，采用正離子化模式；掃描質(zhì)量范圍m/z為50～1 000；干燥氣(N2)流速為8 L/min，溫度為350 ℃；毛細(xì)管電壓為4 000 V.

1.7 Triton X-100-IDA的制備型色譜純化

合成的產(chǎn)物Triton X-100-IDA加入流動(dòng)相溶解，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾并定容，最終樣品溶液中含粗產(chǎn)物30 mg/mL.采用制備型液相色譜進(jìn)行分離純化，色譜條件：Agilent Prep-C18色譜柱(21.2 mm×250 mm，10 μm，10 nm)；流動(dòng)相V(甲醇)∶V(水)=90∶10，流速為10 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為273 nm；進(jìn)樣量為5 mL[13].

1.8 雙水相系統(tǒng)的配制及相圖的測(cè)定

雙水相膠束系統(tǒng)的配制：取一定量的Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ)和HM-EO母液于10 mL玻璃離心管中，加入緩沖液，準(zhǔn)確定量至5 g，振蕩，充分混勻，25 ℃靜置72 h，充分分相.

HM-EO含量的測(cè)定：準(zhǔn)確稱取一定量的待測(cè)樣品，加入等質(zhì)量的丙酮，以m(丙酮)∶m(水)為1∶1進(jìn)行稀釋，取稀釋液0.5 g加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G250顯色液，放置30 min，在620 nm處測(cè)定吸收值，通過計(jì)算獲得HM-EO的含量.

相圖的繪制：配制的雙水相膠束系統(tǒng)中HM-EO的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為2.5%，Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0,0.2%,0.4%,0.6%,0.8%和1.0%.取一定量的上相測(cè)定HM-EO的含量，并利用重量法(真空干燥法)得到上相中水的含量，通過計(jì)算得到上相中Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ)的含量.同法可測(cè)得下相中各組分的含量.

2 結(jié)果與討論

2.1 羥基活化反應(yīng)條件的確定

2.1.1 活化劑濃度對(duì)環(huán)氧產(chǎn)物得率的影響

考察了交聯(lián)活化劑(ECH)的濃度對(duì)環(huán)氧產(chǎn)物得率的影響，結(jié)果如圖3所示.根據(jù)文獻(xiàn)[14]選取3組不同的初始反應(yīng)物配比，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，環(huán)氧產(chǎn)物得率都呈現(xiàn)出先升高、后降低、最后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)，且在反應(yīng)3 h左右活化反應(yīng)基本完成，尤其是當(dāng)ECH與Triton X-100的摩爾比為2∶1時(shí)，環(huán)氧產(chǎn)物得率達(dá)到最高為72.4%.ECH濃度對(duì)環(huán)氧產(chǎn)物得率的影響較為明顯，隨著ECH濃度的增大，環(huán)氧產(chǎn)物得率反而減小，這與文獻(xiàn)[15]報(bào)道的在含水體系中環(huán)氧產(chǎn)物得率隨著ECH含量增大而增大并趨于穩(wěn)定的結(jié)果不同.這可能是由于本實(shí)驗(yàn)在無水體系中進(jìn)行，隨著ECH濃度的增大，其強(qiáng)疏水性不利于NaOH擴(kuò)散于反應(yīng)溶液中[16]，進(jìn)而導(dǎo)致活化反應(yīng)的第2步相對(duì)較難進(jìn)行，因此環(huán)氧產(chǎn)物的得率較低.

2.1.2 催化劑濃度對(duì)環(huán)氧產(chǎn)物得率的影響

三氟化硼是一種很強(qiáng)的Lewis酸，能夠催化環(huán)氧鍵開環(huán).在ECH與Triton X-100的摩爾比為2∶1時(shí)，考察了催化劑BF3的濃度對(duì)環(huán)氧產(chǎn)物得率的影響，結(jié)果見圖4.在不同的BF3配比下，環(huán)氧產(chǎn)物得率隨著時(shí)間的變化趨勢(shì)大致相同：隨著反應(yīng)的進(jìn)行，環(huán)氧產(chǎn)物得率先升高后降低，最后逐漸趨于平穩(wěn)，并且都在反應(yīng)3 h左右達(dá)到最大值；隨著BF3濃度的增大，初始反應(yīng)速度有所增加，并且在反應(yīng)1～2 h內(nèi)環(huán)氧產(chǎn)物得率迅速升高；當(dāng)BF3與Triton X-100的摩爾比為1∶35時(shí)環(huán)氧產(chǎn)物得率明顯較低，而其摩爾比為1∶15時(shí)環(huán)氧產(chǎn)物的得率低于為1∶25時(shí)，原因可能是隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，BF3容易水解生成酸，使部分連接在Triton X-100上的環(huán)氧基在酸性環(huán)境發(fā)生酸化開環(huán)反應(yīng)，導(dǎo)致環(huán)氧產(chǎn)物含量降低.因此，實(shí)驗(yàn)選取BF3與Triton X-100的摩爾比為1∶25進(jìn)行下一步的反應(yīng).

2.1.3 NaOH濃度對(duì)環(huán)氧產(chǎn)物得率的影響

NaOH能夠促使活化反應(yīng)第1步得到的氯代產(chǎn)物脫去氯化氫形成環(huán)氧化產(chǎn)物，在n(ECH)∶n(Triton X-100)=2∶1,n(BF3)∶n(Triton X-100)=1∶25時(shí)，圖5給出了不同NaOH用量對(duì)環(huán)氧產(chǎn)物得率的影響:在不同的NaOH濃度下，環(huán)氧產(chǎn)物得率都隨著時(shí)間的延長(zhǎng)快速升高，在反應(yīng)3 h時(shí)環(huán)氧基取代度達(dá)到最高值，之后呈現(xiàn)降低趨勢(shì)并逐漸趨于平穩(wěn)；當(dāng)NaOH濃度增大時(shí)，環(huán)氧產(chǎn)物的得率反而減小，這可能是由于NaOH濃度的增大在促進(jìn)環(huán)氧產(chǎn)物形成的同時(shí)也使環(huán)氧基的水解作用加劇，因此，當(dāng)NaOH與Triton X-100的摩爾比為1.6∶1時(shí)，環(huán)氧基的水解反應(yīng)造成環(huán)氧產(chǎn)物得率降低.Matsumoto等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在較低濃度的堿液反應(yīng)體系中環(huán)氧基的水解可被有效抑制，使環(huán)氧產(chǎn)物含量在4 h左右維持恒定.本實(shí)驗(yàn)中加入NaOH之后環(huán)氧化反應(yīng)3 h基本完成，因此整個(gè)反應(yīng)對(duì)環(huán)氧產(chǎn)物的形成是有利的.

2.2 偶聯(lián)IDA反應(yīng)條件的確定

IDA是一種良好的鰲合劑，金屬離子一般與IDA以3個(gè)配位鍵結(jié)合，空出的配位點(diǎn)可以與帶有組氨酸標(biāo)簽的基因工程蛋白發(fā)生特異性親和作用.環(huán)氧活化的Triton X-100與螯合劑IDA反應(yīng)，可以制得Triton X-100-IDA.圖6顯示了IDA用量對(duì)偶聯(lián)率的影響：在IDA和Triton X-100的摩爾比分別為1∶1和2∶1時(shí)，偶聯(lián)率隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)快速升高，在21 h左右達(dá)到最高值76.3%，其后隨著反應(yīng)的進(jìn)行偶聯(lián)率降低；隨著IDA濃度的增大，偶聯(lián)率有所提高，但是最大值幾乎相同.因此，實(shí)驗(yàn)選擇IDA與Triton X-100的摩爾比為1∶1.

同時(shí)，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)反應(yīng)液的pH對(duì)IDA的偶聯(lián)有較大的影響，隨著pH值的升高，IDA的偶聯(lián)率快速增加，當(dāng)pH值為13時(shí)達(dá)到最高(見圖7).這與文獻(xiàn)[17]在凝膠上偶聯(lián)IDA的結(jié)果相符.

2.3 Triton X-100-IDA的純化

研究表明，Cu(Ⅱ)的螯合量隨著IDA偶聯(lián)率的升高而增大[18-19].這就意味著：IDA偶聯(lián)產(chǎn)物的純度越高，其與Cu(Ⅱ)的螯合量也相應(yīng)增加.為了提高Triton X-100-IDA與Cu(Ⅱ)的螯合率，獲得較優(yōu)的終產(chǎn)物，因此采用制備型高效液相色譜對(duì)Triton X-100-IDA進(jìn)行了純化，結(jié)果如圖8所示，明顯有2個(gè)峰(峰1和峰2)，分別收集，脫溶劑并干燥得到樣品，峰1為油狀物，峰2為膏狀物.質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，峰2的ESI-MSm/z：[M+H]為791.4，[M+Na]為813.5，分子量與Triton X-100-IDA一致.因此，峰2所得產(chǎn)物為合成的Triton X-100-IDA.

2.4 Cu(Ⅱ)的螯合

在以上所得最佳活化和偶聯(lián)條件下制備得到Triton X-100-IDA，然后以CuSO4與Triton X-100-IDA的摩爾比為1∶1在醋酸鈉溶液中室溫?cái)嚢璺磻?yīng)6 h，得到Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ)，Cu(Ⅱ)的螯合率可達(dá)80.5%.

2.5 HM-EO/Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ)雙水相系統(tǒng)的相圖

測(cè)定了雙水相系統(tǒng)中HM-EO的含量均為2.5%，Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0,0.2%,0.4%,0.6%,0.8%和1.0%，在pH 7，25 ℃下的相圖(見圖9).結(jié)果表明，帶有親和配基的小分子表面活性劑Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ)與HM-EO能形成穩(wěn)定的雙水相系統(tǒng).圖9中：內(nèi)部直線為雙節(jié)線，曲線為雙節(jié)點(diǎn)曲線，曲線內(nèi)部代表的是雙相區(qū)，外部為單相區(qū)，并且兩相中含水量均超過90%，表明該系統(tǒng)適合用于生物活性分子的分離.

3 結(jié) 論

本研究以小分子表面活性劑Triton X-100為載體、環(huán)氧氯丙烷(ECH)為活化劑、亞氨基二乙酸(IDA)為螯合劑、Cu(Ⅱ)為配體合成得到了Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ)，并對(duì)羥基活化、IDA偶聯(lián)和Cu(Ⅱ)螯合等過程中的工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了最佳的制備路線.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

1)活化反應(yīng)：n(ECH)∶n(Triton X-100)=2∶1,n(BF3)∶n(Triton X-100)=1∶25，冰浴反應(yīng)21 h，然后加入400 g/L氫氧化鈉，n(NaOH)∶n(Triton X-100)=1∶1，環(huán)氧化反應(yīng)3 h，環(huán)氧產(chǎn)物得率達(dá)到72.4%.

2)偶聯(lián)反應(yīng)：pH 13，n(IDA)∶n(Triton X-100)=1∶1，55 ℃反應(yīng)21 h，IDA的偶聯(lián)率為76.3%.采用LC/MS測(cè)定了偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物的分子量，與Triton X-100-IDA的分子量相符.

3)螯合反應(yīng)：經(jīng)制備型液相色譜純化后的偶聯(lián)產(chǎn)物在n(CuSO4)∶n(Triton X-100-IDA)=1∶1，0.05 mol/L的醋酸鈉溶液中，室溫反應(yīng)6 h，Cu(Ⅱ)的螯合率可達(dá)80.5%.

4)雙水相系統(tǒng)相圖的考察結(jié)果表明，Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ)與HM-EO能形成穩(wěn)定的雙水相系統(tǒng).

本實(shí)驗(yàn)合成得到的Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ)是一種新型親和雙水相成相劑，在后續(xù)的研究中將與其他成相聚合物構(gòu)成親和作用主導(dǎo)的雙水相膠束系統(tǒng)，可用于循環(huán)萃取、回收高附加值的重組蛋白，有一定的規(guī)?；?、商業(yè)化應(yīng)用前景.

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(責(zé)任編輯 薛 榮)

Preparationofanovelphase-formingcomponentTritonX-100-IDA-Cu(Ⅱ)foraffinityaqueoustwo-phasesystem

PENG Shuai，DENG Gang，LIU Yao，WANG Yimei

(CollegeofChemistryandLifeSciences,ZhejiangNormalUniversity,JinhuaZhejiang321004,China)

A novel phase-forming component for affinity aqueous two-phase system, Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ) was prepared. The nonionic surfactant (Triton X-100) was used as the matrix, which was activated by epichlorohydrin (ECH) and coupled with iminodiacetic acid (IDA), and finally chelated with Cu(Ⅱ). The synthesis conditions on Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ) was optimized systematacially. The result indicated that the yield of Triton X-100-epoxide above 72.4% was achieved in the ice-water bath consisting ofn(ECH)∶n(Triton X-100) = 2∶1,n(BF3)∶n(Triton X-100) = 1∶25 for 22 hours and then as the molar ratio of NaOH to Triton X-100 was 1∶1 for 3 hours. After reacting under the optimal linkaging conditions asn(IDA)∶n(Triton X-100) = 1∶1, pH 13, 55 ℃, 21 hours, the maximum yield of Triton X-100-IDA was 76.3%. In the solution composed ofn(CuSO4)∶n(Triton X-100-IDA) = 1∶1 at room temperature for 6 hours, the chelating yield of Cu(Ⅱ) reached 80.5%. Phase diagram determination showed that Triton X-100-IDA-Cu(Ⅱ) and HM-EO could compose stable affinity aqueous two-phase system (ATPS).

Triton X-100; aqueous two-phase system; immobilized metal ion affinity partitioning; Cu(Ⅱ)

10.16218/j.issn.1001-5051.2015.04.011

2015-01-20；

：2015-03-08

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21006098)

彭 帥(1988-)，男，河南項(xiàng)城人，碩士研究生.研究方向：生物化工.

鄧 剛.E-mail: denggang@zjnu.cn

O658

：A

：1001-5051(2015)04-0420-06