蛇足石杉形態(tài)解剖學(xué)與組織化學(xué)定位研究*

盧婧瑋1，陳沈超1，馮曉燕1，周江俊1，張曉丹2，祁哲晨2，侯卓妮2，呂洪飛1,2

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004;2.浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310018)

?

蛇足石杉形態(tài)解剖學(xué)與組織化學(xué)定位研究*

盧婧瑋1，陳沈超1，馮曉燕1，周江俊1，張曉丹2，祁哲晨2，侯卓妮2，呂洪飛1,2

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004;2.浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310018)

采用石蠟切片法，對蛇足石杉的不同器官進行了解剖學(xué)特征研究；結(jié)合冰凍切片法，用碘化鉍鉀、氯化鐵染色法分別對蛇足石杉的根、莖和葉中的生物堿和黃酮類化合物進行了組織化學(xué)定位.結(jié)果表明：生物堿主要存在于蛇足石杉根和莖的中柱木質(zhì)部和皮層的薄壁細(xì)胞中，少數(shù)存在于葉肉細(xì)胞及其胞間隙中，其含量大小順序為：莖≈根>葉；黃酮類化合物主要存在于蛇足石杉的小型葉肉細(xì)胞及其胞間隙中，部分存在于根和莖的中柱韌皮部，含量大小順序為：葉>莖≈根；在不同的器官中，生物堿和黃酮類化合物的含量存在差異，其中莖和根的生物堿含量較高，而葉中黃酮類化合物含量較高.

蛇足石杉；形態(tài)解剖；組織化學(xué)定位；生物堿；黃酮類化合物

蛇足石杉(Huperziaserrata(Thunb.) Trev.)屬石杉科石杉屬，又名蛇足草、金不換、萬年杉等，植株小型，為多年生草本蕨類植物，分布廣泛.蛇足石杉是一種珍貴的藥用植物，民間用于治療瘀血腫痛、內(nèi)傷吐血、解毒止痛等[1].藥理實驗證明，蛇足石杉所含生物堿具有膽堿酯酶抑制作用，對肌肉有舒張和收縮作用，可提高學(xué)習(xí)記憶能力和改善記憶障礙；另外，臨床研究表明石杉堿甲對于治療老年性癡呆具有良好效果[1-4].有研究表明蛇足石杉中含有黃酮類化合物[5]，并有學(xué)者對其提取工藝進行了優(yōu)化[6].近年來，黃酮類化合物因其具有重要的抗氧化、抗衰老和抗病毒等作用而受到廣泛關(guān)注.藥理實驗表明,適量攝入黃酮類化合物能減少癌癥、腫瘤、心血管疾病、脂質(zhì)過氧化及骨質(zhì)疏松等疾病的發(fā)病率[7].

由于蛇足石杉所含化學(xué)成分的藥用價值逐漸被發(fā)現(xiàn)，人們越來越意識到蛇足石杉可以作為一種新藥資源來開發(fā)利用.目前已有學(xué)者對蛇足石杉所含生物堿成分的提取與含量測定進行了相關(guān)研究[7-10].但是，關(guān)于總生物堿及黃酮類化合物在蛇足石杉不同部位中的分布規(guī)律，至今未見詳細(xì)報道.作為一種與生物堿反應(yīng)顯色的試劑，Dragendorff試劑(碘化鉍鉀試劑)被廣泛用于各類生物堿的鑒定[11-12]，而改良的碘化鉍鉀試劑可以更好地用于生物堿的鑒定和測定[13-16].本實驗通過對蛇足石杉的形態(tài)解剖學(xué)研究，以及用改良的碘化鉍鉀法和5%氯化鐵法分別對蛇足石杉中的生物堿和黃酮類化合物進行了定位研究，旨在闡明生物堿和黃酮類化合物在蛇足石杉不同器官中的分布，以期為其藥材真?zhèn)舞b別、藥物資源的開發(fā)利用及蛇足石杉的組織培養(yǎng)和科學(xué)栽培管理等提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

蛇足石杉全草采自浙江省金華市北山，經(jīng)呂洪飛教授鑒定后栽培于浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院的實驗園地.

1.2 形態(tài)解剖學(xué)研究

用于結(jié)構(gòu)觀察的新鮮材料，經(jīng)FAA固定液(V(福爾馬林)∶V(冰醋酸)∶V(70%乙醇)=5∶5∶90)固定，采用石蠟切片技術(shù)，切片厚度為10 μm，粘片、展片后采用番紅-固綠對染，于Olympus BX 50光學(xué)顯微鏡下觀察、攝影.

1.3 組織化學(xué)定位

用于組織化學(xué)定位研究的材料為新鮮的根、莖和葉，采用冰凍切片技術(shù)，切片厚度為10～12 μm，生物堿和黃酮類化合物分別經(jīng)改良的碘化鉍鉀試劑[12]、5%氯化鐵試劑染色，于Olympus BX 50光學(xué)顯微鏡下觀察、攝影.

定性測定蛇足石杉的根、莖、葉中生物堿和黃酮類化合物的分布密度和顆粒大?。喝〔贿B續(xù)的冰凍切片比較觀察，根據(jù)著色顆粒的分布密度和大小劃分5個等級：+++++級，顆粒分布密度大、顆粒大；++++級，顆粒分布密度中等、顆粒大，或顆粒的分布密度大、顆粒大小中等；+++級，顆粒分布密度中等、顆粒大小中等，或顆粒分布密度大、顆粒小，或顆粒分布密度稀少、顆粒大；++級，顆粒分布密度稀少、顆粒大小中等；+級，顆粒分布密度稀少、顆粒小或無.

2 結(jié)果與分析

2.1 蛇足石杉的內(nèi)部結(jié)構(gòu)

2.1.1 根的石蠟切片

圖1(a)和(b)為蛇足石杉根的石蠟切片，其橫切面呈近圓形，由外至內(nèi)為表皮、皮層和中柱.表皮細(xì)胞為1列輕微栓化的方形薄壁細(xì)胞，排列整齊且緊密.外皮層細(xì)胞為2～3列排列整齊、緊密的長方形薄壁細(xì)胞；中皮層由5～7列厚壁細(xì)胞組成，排列緊密，偶有細(xì)胞間隙；內(nèi)皮層為3～5列薄壁細(xì)胞，排列緊密，無細(xì)胞間隙.維管柱為原生中柱，中柱鞘為1列長方形薄壁細(xì)胞，排列緊密.

2.1.2 莖的石蠟切片

圖1(c)和(d)為蛇足石杉莖的石蠟切片，其橫切面呈近圓形，分為表皮、皮層和中柱.表皮由1～3列長方形薄壁細(xì)胞組成，排列整齊緊密.表皮外附著有木栓化的死細(xì)胞殘余.皮層發(fā)達，由外皮層、中皮層和內(nèi)皮層構(gòu)成：外皮層是厚壁細(xì)胞，排列緊密，無細(xì)胞間隙；中皮層為薄壁細(xì)胞，排列疏松，有較大的細(xì)胞間隙；內(nèi)皮層明顯，由1列薄壁細(xì)胞組成，排列緊密，無細(xì)胞間隙.中央有維管柱，維管柱的木質(zhì)部向四周生長出輻射排列的倒三角形的脊?fàn)钔黄?，形成星狀中?

2.1.3 葉的石蠟切片

蛇足石杉葉由表皮、葉肉和葉脈組成，表皮外包被一層角質(zhì)層.葉的上、下表皮均為1列長方形薄壁細(xì)胞.橫切面觀葉肉細(xì)胞由不規(guī)則細(xì)胞組成，細(xì)胞間隙較大，分化不明顯(見圖1(e)).

2.2 蛇足石杉根、莖、葉的改良碘化鉍鉀反應(yīng)

對蛇足石杉的根、莖、葉冰凍切片進行改良的碘化鉍鉀反應(yīng)，結(jié)果表明：根的冰凍切片中，根中柱的木質(zhì)部有大量橘紅色顆粒狀沉淀(如圖2中↑所示)，內(nèi)外皮層之間的薄壁細(xì)胞中散見有橘紅色顆粒狀沉淀(見圖2(a)和(b))；莖的冰凍切片中，莖中柱的木質(zhì)部有較多的橘紅色顆粒狀沉淀，內(nèi)外皮層之間的薄壁細(xì)胞中散見有橘紅色顆粒狀沉淀(見圖2(c))；葉的冰凍切片中，葉肉細(xì)胞及胞間隙中可見細(xì)小的橘紅色沉淀(見圖2(d)和(e)).碘化鉍鉀染色顯示生物堿的分布及含量在蛇足石杉的不同器官存在差異(見表1).

2.3 蛇足石杉根、莖、葉的氯化鐵反應(yīng)

對蛇足石杉的根、莖、葉冰凍切片進行氯化鐵反應(yīng)，結(jié)果表明：根的冰凍切片中，根中柱的木質(zhì)部被染成深綠色(見圖3(a)中↑所示)；莖的冰凍切片中，莖中柱的木質(zhì)部被染成深綠色(見圖3(b))；葉的冰凍切片中，在小型葉肉細(xì)胞及胞間隙中觀察到大量的深綠色沉淀，其中胞間隙顏色較細(xì)胞壁淺(見圖3(c)和(d)).氯化鐵染色顯示,黃酮類化合物的分布及含量在蛇足石杉不同器官存在一定的差異(見表1).

3 討 論

3.1 蛇足石杉的形態(tài)解剖學(xué)特征

蛇足石杉的莖中皮層細(xì)胞排列疏松，有一定的細(xì)胞間隙，便于儲存水分，反應(yīng)莖結(jié)構(gòu)對水分的適應(yīng)性.研究發(fā)現(xiàn)，蛇足石杉莖的維管柱組織不發(fā)達，其木質(zhì)部向四周生長出7個脊?fàn)钔黄?，形成星散?與黎有有等[17]對蛇足石杉莖木質(zhì)部的觀察結(jié)果基本一致.周毅等[18]研究發(fā)現(xiàn)5個居群的蛇足石杉木質(zhì)部多數(shù)是6個或7個脊，也有出現(xiàn)4，5或8個脊的；而魯潤龍等[19]認(rèn)為蛇足石杉的木質(zhì)部是由6個輻射排列的脊?fàn)钔黄饦?gòu)成.這可能是由于蛇足石杉的木質(zhì)部在不同的生態(tài)環(huán)境中存在著變異所致.

3.2 蛇足石杉的組織化學(xué)定位

根據(jù)對蛇足石杉的根、莖、葉所含生物堿進行組織化學(xué)定位可知，生物堿主要存在于蛇足石杉根和莖的中柱木質(zhì)部和內(nèi)外皮層之間的薄壁細(xì)胞中，含量大小順序為莖≈根>葉.杜次等[10]對湘西蛇足石杉的總生物堿進行了測定，發(fā)現(xiàn)石杉堿甲和乙的分布均為葉>莖>根，石杉堿丙的分布則是根>葉和莖；而孫遠(yuǎn)明等[20]通過對不同產(chǎn)地蛇足石杉的不同部位所含石杉堿甲(Hup A)進行考察,并用RP-HPLC法檢測了Hup A的含量，發(fā)現(xiàn)Hup A含量在蛇足石杉地上部分>地下部分，且不同地區(qū)含量有差異.由于蛇足石杉中生物堿單體種類有20多個[21]，本實驗是對蛇足石杉根、莖、葉中生物堿總量進行組織化學(xué)定位，并沒有確定具體單體的含量及其分布情況，因此與前人的研究結(jié)果并不矛盾.

黃酮類化合物經(jīng)氯化鐵反應(yīng)后呈現(xiàn)出深綠色.蛇足石杉的根、莖、葉中黃酮類化合物的組織化學(xué)定位結(jié)果表明，蛇足石杉莖和根中柱韌皮部的總黃酮含量低于葉片中的，即黃酮類化合物以葉片中分布為主.這與魯翠濤等[22]利用分光光度計對蛇足石杉莖葉內(nèi)的黃酮類物質(zhì)進行測定的結(jié)果一致.同時，文獻[22]對千層塔葉片黃酮提取液進行各種定性顏色反應(yīng)，初步判斷其中的黃酮類物質(zhì)主要為黃酮類和黃酮醇類.本實驗中對蛇足石杉葉片所含黃酮類物質(zhì)進行組織化學(xué)定位的顏色也有差異，可能是由于器官中含有不同的黃酮類物質(zhì)引起的.

對蛇足石杉組織化學(xué)定位的研究結(jié)果表明，生物堿和黃酮類化合物的含量在蛇足石杉不同器官中存在差異.因此,可以根據(jù)不同的需要選擇合適的部位進行組織培養(yǎng).

[1]余紅英,孫遠(yuǎn)明,楊躍進.草藥蛇足石杉的研究進展[J].中草藥,2001,32(3):279-281.

[2]Ma X,Gang D R.The lycopodium alkaloids[J].Natural Product Reports,2004,21(6):752-772.

[3]Ma X,Tan C,Zhu D,et al.Huperzine A from Huperzia species—an ethnopharmacolgical review[J].Journal of Ethnopharmacology,2007,113(1):15-34.

[4]Liu J S,Zhu Y L,Yu C M,et al.The structures of huperzine A and B,two new alkaloids exhibiting marked anticholinesterase activity[J].Canadian Journal of Chemistry,1986,64(4):837-839.

[5]馬燮,何笑聰,楊郭,等.分光光度法測定蛇足石杉中總黃酮含量[J].時珍國醫(yī)國藥,2008(10):2491-2492.

[6]武蕓,鄭小江,楊婷,等.千層塔全草總黃酮提取工藝的優(yōu)化[J].熱帶作物學(xué)報,2013(9):1814-1818.

[7]袁帶秀.藥用植物蛇足石杉的化學(xué)成分與藥理活性研究進展[J].中國野生植物資源,2011,30(3):1-3.

[8]曾漢元,印彪,連琰.蛇足石杉生物堿的提取與測定[J].懷化學(xué)院學(xué)報,2007,26(8):30-32.

[9]易學(xué)文,張利,羅容珍,等.蛇足石杉中石杉堿甲的酶法提取研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(32):19798-19799.

[10]杜次,彭清忠,田向榮,等.湘西蛇足石杉中石杉堿甲,乙和丙含量的測定[J].廣西植物,2013,33(3):406-409.

[11]Coe F G,Anderson G J.Screening of medicinal plants used by the garifuna of Eastern Nicaragua for bioactive compounds[J].Journal of Ethnopharmacology,1996,53(1):29-50.

[12]肖桂青,田云,盧向陽,等.微波輔助提取荷葉生物堿條件的優(yōu)化[J].氨基酸和生物資源,2007,29(2):76-79.

[13]Simonovska B,Vovk I.High-performance thin-layer chromatographic determination of potato glycoalkaloids[J].Journal of Chromatography A,2000,903(1):219-225.

[14]呂洪飛,羅文姬,盛仙永,等.二種石斛屬植物和小葉石仙桃生物堿的組織化學(xué)定位[J].中國藥學(xué)雜志,2006(11):824-826;867.

[15]章育中,張淑蓉,崔建芳,等.苦參及其制劑中生物堿的薄層分離和含量測定[J].藥學(xué)學(xué)報,1981,16(4):283-283.

[16]雷崎方,孫桂波,沈壽茂,等.附子的化學(xué)成分研究[J].中草藥,2013,44(6):655-659.

[17]黎有有,唐源江,李菁,等.蛇足石杉的形態(tài)學(xué)及不同光照處理下氣孔特征的研究[J].植物研究,2009(4):411-416.

[18]周毅,黃衡宇,李菁.蛇足石杉生態(tài)適應(yīng)性研究Ⅰ莖葉解剖特征的比較[J].植物研究,2010(2):157-163.

[19]魯潤龍,周忠澤.藥用植物蛇足石杉的生物學(xué)特性[J].中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)學(xué)報,1999,29(1):118-121.

[20]孫遠(yuǎn)明,余紅英.HPLC法測定蛇足石杉中石杉堿甲含量[J].中草藥,2002,33(12):1078-1080.

[21]李俊.從蛇足石杉中提取石杉堿甲的工藝及中試試驗研究[D].吉首:吉首大學(xué),2012:2.

[22]魯翠濤,梅興國,鐘凡.千層塔植物莖葉中黃酮類物質(zhì)的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2002(3):27-29.

(責(zé)任編輯 薛 榮)

AnatomicalstructureandhistochemicallocalizationofHuperziaserrata

LU Jingwei1, CHEN Shenchao1, FENG Xiaoyan1, ZHOU Jiangjun1,ZHANG Xiaodan2, QI Zhechen2, HOU Zhuoni2, Lü Hongfei1,2

(1.CollegeofChemistryandLifeSciences,ZhejiangNormalUniversity,JinhuaZhejiang321004,China; 2.SchoolofLifeSciences,ZhejiangSci-TechUniversity,HangzhouZhejiang310018,China)

The paraffin sections were used to study the characteristics of morphological and anatomic structure; an improved dragendorff reagents (bismuth potassium iodide reagent) was used to locate the alkaloid in root, stem and leaf ofHuperziaserrata; the ferric chloride reagent was used to locate the flavonoid in root, stem and leaf ofH.serrata. The results showed that the color reaction and special crystal deposition sites indicated that the alkaloid was located in the stele xylem and parenchyma of root and stem, and mesophyll and its intercellular space of leaf. The alkaloid content in stem was almost equal to that in root, which was in general higher than that in leaf. The flavonoid was located in mesophyll and its intercellular space of leaf, the stele phloem of root and stem. The flavonoid content in stem was almost equal to that in root, which was in general lower than that in leaf. The alkaloid and flavonoid contents were obviously different among the different organs of the same species. The highest alkaloid content was in the stem and root, and the highest flavonoid content was found in the leaf based on these observation. The value of this study resided not only in indicating that different organs having different medicinal value, but also in providing theoretical basis of tissue culture and cultivation and the selection of medicinal parts forH.serrata.

Huperziaserrata; morphological and anatomic structure; histochemical localization; alkaloid; flavonoids

10.16218/j.issn.1001-5051.2015.04.015

2015-03-16；

：2015-03-26

浙江省科技特派員團隊項目(2012T2T223)

盧婧瑋(1990-)，女，河南濮陽人，碩士研究生.研究方向：資源植物學(xué).

呂洪飛.E-mail: luhongfei0164@163.com

R931.6

：A

：1001-5051(2015)04-0447-05