小鼠肝組織掃描電鏡樣本的制備及改良方法*

姚瑩華陳育堯呂志平

[文章編號(hào)] 1672-8270(2017)06-0165-03 [中圖分類號(hào)] R-332 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A

小鼠肝組織掃描電鏡樣本的制備及改良方法*

姚瑩華①陳育堯②呂志平②

目的：探討優(yōu)化小鼠肝組織掃描電鏡樣本的制備方法。方法：通過(guò)改良灌注固定的部位、優(yōu)化灌注材料及步驟、采用經(jīng)門靜脈灌注固定和改變固定流程等制備小鼠肝臟掃描電鏡樣本，并對(duì)比改良制備方法與常規(guī)制備方法的組織細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果。結(jié)果：改良后的樣本制備方法較好地保存了小鼠肝組織以及細(xì)胞的生活狀態(tài)，可清晰觀察肝臟組織及細(xì)胞的超微形態(tài)結(jié)構(gòu)，獲得了頗為理想的觀察效果，且操作簡(jiǎn)便，成功率高，優(yōu)于傳統(tǒng)制備方法。結(jié)論：經(jīng)門靜脈灌注固定制備小鼠掃描電鏡樣本是比較優(yōu)越的掃描電鏡制樣方法，具有一定應(yīng)用價(jià)值。

肝組織；掃描電鏡；樣本制備；改良方法

電子顯微鏡術(shù)的應(yīng)用使人們對(duì)肝臟的認(rèn)識(shí)從組織學(xué)水平上升到細(xì)胞器水平，并進(jìn)入分子生物學(xué)研究領(lǐng)域[1]。掃描電鏡可清晰地觀察物體表面的立體微細(xì)結(jié)構(gòu)及其形態(tài)學(xué)變化，從三維水平研究肝臟的亞微結(jié)構(gòu)，是現(xiàn)今一種較為常見和實(shí)用的形態(tài)學(xué)研究方法[2]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肝臟細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)只能在完整的肝組織或培養(yǎng)的細(xì)胞中使用電子顯微鏡進(jìn)行觀察，而理想的生物樣品應(yīng)如實(shí)反映其生理過(guò)程中的狀態(tài)，在高真空和強(qiáng)電子束的轟擊下保持穩(wěn)定，且亞微結(jié)構(gòu)清晰、無(wú)變形[3-4]。理想的生物樣品與樣品的制備技術(shù)密切相關(guān)，由于小鼠門靜脈短且壁薄，其樣品制備為一大技術(shù)難點(diǎn)。因此，本研究對(duì)小鼠肝組織掃描電子顯微鏡標(biāo)本的制備方法進(jìn)行改良。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

NIH小鼠，雄性，體重18～22 g，由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 儀器與試劑

(1)S-3000N型掃描電子顯微鏡(HITACHI，日本)；HPC-2型CO2臨界點(diǎn)干燥器(HITACHI，日本)。

(2)二甲胂酸鈉購(gòu)自Amresco公司；25%戊二醛(美國(guó)SIGMA公司)；1%四氧化鋨為進(jìn)口分裝(美國(guó)SIGMA公司)；24 G一次性靜脈留置針、一次性輸液器、一次性輸液瓶和T型連接管均由南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院提供。

1.3 緩沖液和固定液的配制

(1)0.1 mol/L的二甲胂酸鈉緩沖液(pH值為7.4)：二甲胂酸鈉4.28 g，0.2 NHCl 2.7 ml加蒸餾水至200 ml。

(2)1.5%戊二醛固定液(pH值為7.4)：0.2 mol/L的二甲胂酸鈉緩沖液50 ml，25%戊二醛6 ml，加蒸餾水至100 ml。

1.4 肝臟灌注固定

將緩沖液和固定液分別裝入輸液瓶中，連接輸液器和“T”形連接管，調(diào)節(jié)輸液器使其中無(wú)氣泡。①實(shí)驗(yàn)小鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰臥位固定，酒精棉球皮膚消毒，打開腹腔暴露門靜脈及下腔靜脈；②用彎型鑷分離門靜脈，取一定長(zhǎng)度4#絲線從分離的門靜脈下端穿過(guò)，打一個(gè)留有少許空隙的活結(jié)；③用清潔棉球壓迫于胃食管靜脈叢上端，使門靜脈充盈，用24 G一次性靜脈留置針從門靜脈主干遠(yuǎn)端刺入，待針尾部有回血時(shí)迅速抽出針芯，用鑷子拉緊預(yù)先打好的活結(jié)，再打一結(jié)將留置針與門靜脈固定，使之不能退出，然后將針尾部與緩沖液輸液器連接，打開調(diào)節(jié)閥，灌注緩沖液，調(diào)節(jié)灌流量至5～7 ml/ min；④迅速切斷下腔靜脈，使血液和緩沖液流出，并觀察血液流出情況和肝臟變化；⑤當(dāng)流出的血液逐漸由紅轉(zhuǎn)淡，肝臟發(fā)白時(shí)旋轉(zhuǎn)“T”形管，使之對(duì)準(zhǔn)固定液，開始灌注1.5%戊二醛，待肝臟變硬后，迅速切取肝組織，并置于冰上切塊取材，放置于1.5%戊二醛固定液中，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆肹5]。

1.5 掃描電鏡樣本的處理

樣品浸于戊二醛中固定3 h后，于4 ℃下用0.1 mol/L的二甲胂酸鈉緩沖液(pH值為7.4)反復(fù)漂洗數(shù)次，并將組織置于緩沖液中過(guò)夜。第2 d除去緩沖液，加入1%的鋨酸固定1 h，棄固定液，再用緩沖液反復(fù)漂洗5次，每次15 min。梯度乙醇脫水(50%、70%、90%、100%)3次，每次15 min，乙酸異戊酯置換2次，第1次5～10 min，第2次＞30 min。將置換后的組織取出放于濾紙上，待部分液體吸收，剪取適當(dāng)大小濾紙放于樣品干燥籠內(nèi)，并進(jìn)行標(biāo)記。組織放入標(biāo)記后的樣品干燥籠，封口后連籠移入CO2臨界點(diǎn)干燥器樣品杯內(nèi)，將蓋擰緊，以防漏氣。樣品干燥后取出，放于事先標(biāo)記的樣品袋中。光學(xué)顯微鏡下觀察樣本大體結(jié)構(gòu)，鏡下將大塊組織分離成不同不規(guī)則斷面的組織小塊，選取需要觀察的斷面，用導(dǎo)電膠粘合于樣本觀察板上，真空噴鍍金膜后置于掃描電子顯微鏡下觀察。

1.6 掃描電鏡樣本的觀察

使用低倍鏡找到每個(gè)標(biāo)本的匯管區(qū)，定位于匯管區(qū)周圍，觀察5個(gè)斜斷面肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)觀察倍數(shù)和焦距仔細(xì)觀察所要觀察的部位和細(xì)胞；然后在遠(yuǎn)離匯管區(qū)的部位找5個(gè)視野，觀察5個(gè)斜斷面。觀察肝細(xì)胞、肝血竇、間質(zhì)細(xì)胞以及肝內(nèi)血管和毛細(xì)小膽管的形態(tài)結(jié)構(gòu)[6]。

2 結(jié)果

通過(guò)經(jīng)門靜脈灌注固定方法制得的小鼠肝組織，掃描電鏡樣本表面結(jié)構(gòu)保持完整，無(wú)污染，無(wú)擠壓龜裂。在電鏡下觀察肝細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞及其窗孔結(jié)構(gòu)、其他間質(zhì)細(xì)胞、少量淋巴細(xì)胞和毛細(xì)膽管。肝細(xì)胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，肝細(xì)胞表面可見清晰的毛細(xì)小膽管結(jié)構(gòu)，部分肝細(xì)胞在斷裂過(guò)程中破裂，細(xì)胞器掉落。經(jīng)改良后采用經(jīng)門靜脈灌注固定小鼠肝組織，可見清晰的肝血竇及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞窗孔，個(gè)別血細(xì)胞和炎性細(xì)胞附著肝竇腔。而未經(jīng)改進(jìn)的灌注方法，鏡下肝細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)難以辨認(rèn)(如圖1所示)。

圖1 小鼠肝組織掃描電鏡樣本(×8.0 K)

3 討論

肝臟是全身代謝最為旺盛的器官，同時(shí)又是各種細(xì)胞器最有代表性的器官之一，機(jī)體各種疾病都會(huì)直接或者間接地影響肝細(xì)胞的亞微結(jié)構(gòu)[7]。病理檢查是反映肝臟病理學(xué)變化的最直接指標(biāo)，由于肝臟容易取得生理狀態(tài)下的樣品，肝臟活檢常成為臨床診斷的直接證據(jù)。肝臟是體內(nèi)重要的代謝和免疫器官，組織結(jié)構(gòu)致密，離體后迅速自溶，固定不及時(shí)將難以保持生活狀態(tài)下樣品原貌，細(xì)胞內(nèi)的微細(xì)變化即刻呈現(xiàn)電鏡假象。掃描電鏡要求觀察樣品結(jié)構(gòu)完整且清潔無(wú)雜物，但由于肝臟血流及代謝物豐富，血細(xì)胞與組織液等易沉積于肝組織內(nèi)表面，造成對(duì)電鏡圖像的錯(cuò)誤理解[8]。灌注壓升高，固定劑和緩沖液的滲透壓不正確，固定不足，并且固定后脫水和干燥的速度都是可能產(chǎn)生干擾超微結(jié)構(gòu)保存的人為因素[9-10]。因此，掃描電鏡樣本固定前應(yīng)做好表面清潔，且從標(biāo)本的取材到后續(xù)處理過(guò)程都應(yīng)盡量做到符合活體狀態(tài)下的生理?xiàng)l件，如緩沖液和固定液的離子濃度、pH值、滲透壓及溫度等[11]。

掃描電鏡不同于透射電鏡，組織塊過(guò)小不易形成自然斷裂層，從而影響觀察效果。而固定液滲透力有限，較大的組織塊所需滲透時(shí)間長(zhǎng)，單純浸泡于固定液中容易出現(xiàn)滲透不足導(dǎo)致組織細(xì)胞自溶，造成結(jié)構(gòu)的損壞。采用門靜脈灌注固定制備小鼠掃描電鏡樣本，通過(guò)血管灌注固定肝臟能夠及時(shí)地保存肝組織和細(xì)胞正常存活狀態(tài)，減少離體死亡后引起的自溶變化，為取材與修整爭(zhēng)取了時(shí)間。此外，能清潔樣品內(nèi)表面的血細(xì)胞及組織液體，使鏡下視野清晰，觀察效果良好。一般多采用插入心臟的全身灌注法，操作較簡(jiǎn)單。但肝臟則應(yīng)采用局部灌注法，經(jīng)門靜脈灌注能更快、更及時(shí)地固定正常存活狀態(tài)下的肝組織，且固定均勻，速度快，灌注效果優(yōu)于全身灌注。停止血液流動(dòng)后應(yīng)盡可能快地進(jìn)行固定，以防止由于組織細(xì)胞自溶而發(fā)生的超微結(jié)構(gòu)變化[12]。灌注時(shí)，由于灌注針頭非常容易從門靜脈管腔中滑脫，采用4#絲線將灌注針與門靜脈固定，有效的提高了灌注的成功率。以往灌注多采用金屬注射針頭，但其表面光滑，絲線結(jié)扎易滑脫，且小鼠的門靜脈管壁較薄，金屬針頭易造成管壁破損，導(dǎo)致灌注失敗或灌注不全。因此，采用24 G靜脈留置針，刺入門靜脈針尾有回血后退出金屬針芯，將留置針的套管和門靜脈用絲線結(jié)扎固定。經(jīng)反復(fù)驗(yàn)證，結(jié)扎穩(wěn)固，不會(huì)輕易發(fā)生位移、脫落。此外，灌注時(shí)應(yīng)注意下腔靜脈流出液情況，隨著流出血液顏色逐漸變淡，肝臟逐漸發(fā)白，表明灌注位置正確；若無(wú)液體流出或肝臟無(wú)明顯變化，則可能是針頭刺入過(guò)深，穿破門靜脈，或刺入位置不正確，應(yīng)及時(shí)停止灌注，重新調(diào)整針頭位置，直至肝臟變化，但調(diào)整應(yīng)盡量在短時(shí)間內(nèi)完成，以免發(fā)生組織自溶。肝臟變硬后可停止，取材速度要快，修整后放入固定液中于冰箱內(nèi)4 ℃保存。

灌注液的滲透壓，pH值應(yīng)與固定液一致，不同滲透壓會(huì)導(dǎo)致組織細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，最好用同種緩沖液配所需固定液。固定足夠時(shí)間后用緩沖液清洗組織塊，目的是除去固定液及組織表面的雜質(zhì)，清洗不足則樣品表面雜質(zhì)較多，影響鏡下觀察，可清洗4～6次，每次30 min，或放置于冰箱內(nèi)4 ℃保存12 h。換液過(guò)程中吸管應(yīng)盡量不觸碰組織，亦要避免樣品長(zhǎng)時(shí)間裸露在空氣中發(fā)生改變。組織脫水采用“乙醇梯度脫水法”，其脫水力度較丙酮緩和，根據(jù)樣品的大小而確定具體脫水時(shí)間，避免過(guò)度脫水造成組織收縮變化，每次15 min左右。干燥時(shí)采用“臨界點(diǎn)干燥法”，可減少組織細(xì)胞表面的張力，使樣品得到更好的保護(hù)。該制備方法較好的保存了肝組織以及細(xì)胞的生活狀態(tài)，獲得了頗為理想的觀察效果，優(yōu)于以往傳統(tǒng)制備方法，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

[1]杭振，蔡文琴.電子顯微鏡術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)的應(yīng)用[M].重慶：重慶出版社，1988：193.

[2]楊勇驥.實(shí)用生物醫(yī)學(xué)電子顯微鏡技術(shù)[M].上海：第二軍醫(yī)大學(xué)出版社，2003.

[3]Cogger VC，O'Reilly JN，Warren A，et al.A standardized method for the analysis of liver sinusoidal endothelial cells and their fenestrations by scanning electron microscopy[J].J Vis Exp，2015，30(98)：e52698.

[4]路菊，趙建華，郭喬楠，等.細(xì)胞與生物材料共培養(yǎng)的樣品掃描電鏡制備法[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，29(14)：1446-1447.

[5]姚瑩華.丹參多糖對(duì)急性肝損傷小鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的影響及保護(hù)作用的研究[D].廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2010.

[6]陶忠芬，可金星，黃文琪，等.樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)與掃描電鏡樣品制備[C].貴陽(yáng)：全國(guó)電子顯微學(xué)會(huì)議論文集，2005.

[7]王寶恩，張定鳳.現(xiàn)代肝臟病學(xué)[M]北京：科學(xué)出版社，2003.

[8]張景強(qiáng)，樸英杰，蔡?；I，等.生物電子顯微技術(shù)[M].廣州：中山大學(xué)出版社，1993：133.

[9]Fraser R，Bowler LM，Day WA，et al.High perfusion pressure damages the sieving ability of sinusoidal endothelium in rat livers[J].Br J Exp Pathol，1980，61(2)：222-228.

[10]Wisse E.An electron microscopic study of the fenestrated endothelial lining of rat liver sinusoids[J].J Ultrastruct Res，1970，31(1)：125-150.

[11]Wisse E，Braet F，Duimel H，et al.Fixation methods for electron microscopy of human and other liver[J].World J Gastroenterol，2010，16(23)：2851-2866.

[12]Vreuls C，Wisse E，Duimel H，et al.Jet-fixation：a novel method to improve microscopy of human liver needle biopsies[J].Hepatology，2014，59(2)：737-739.

Preparation of specimen about mouse liver tissue for scanning electron microscope and its improvement method/

YAO Ying-hua, CHEN Yu-yao, LV Zhi-ping//China Medical Equipment,2017,14(6):165-167.

Objective: To explore and optimize the preparation method of specimen about mouse liver tissue for scanning electron microscopy. Methods: The specimens of mouse liver using for scanning electron microscope were prepared through improving the fixed location of perfusion, optimizing material and procedure of perfusion, adopting fixation of perfusion via portal vein and changing the process of fixation and so on. And the results of morphological observation of histocyte were compared between the improved method and traditional method. Results: The improved preparation method could save the liver tissue and the living state of the cells in preferably situation. By using this method, the ultra-micro morphological structure of liver tissue and cell could be clearly observed and the ideal effect of observation could be achieved. Besides, its operation was simple and its success rate was high. Therefore, it was superior to traditional method. Conclusion: The preparation of specimen about the fixation of mouse liver tissue via perfusion of portal vein for scanning electron microscope is a superior method, which has certain applied value.

Liver tissue; Scanning electron microscopy; Specimen preparation; Improvement method

Shantou Hospital of TCM, Guangzhou University of Chinese Medicine, Shantou 515031, China.

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2017.06.045

[文章編號(hào)] 1672-8270(2017)06-0165-03 [中圖分類號(hào)] R-332 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A

姚瑩華,女,(1984- ),博士研究生，主治醫(yī)師。廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬汕頭中醫(yī)院科教科，從事消化系統(tǒng)疾病的中西醫(yī)臨床診治。

2017-03-23

國(guó)家自然科學(xué)基金(30973699)“肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)機(jī)制與肝主疏泄的相關(guān)性研究”

①?gòu)V州中醫(yī)藥大學(xué)附屬汕頭中醫(yī)院科教科 廣東 汕頭 515031

②南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院 廣東 廣州 510515