幽門螺桿菌重組熱休克蛋白60對(duì)U937細(xì)胞分泌TNF-α和IL-17的影響

張 珍，魏義花，杜鎮(zhèn)鎮(zhèn)，周秀芝(濱州醫(yī)學(xué)院：.病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室；.臨床學(xué)院，山東 濱州56603)

幽門螺桿菌是引起人類胃炎、消化道潰瘍及胃癌的重要病原體，是一種微需氧、彎曲狀的革蘭陰性桿菌[1]。幽門螺桿菌的致病能力與其菌體表面的熱休克蛋白60(hsp60)密切相關(guān)[2]，不同菌株的 hsp60氨基酸序列即GroEL蛋白相對(duì)保守、抗原性較強(qiáng)[3]，主要通過(guò)刺激單核-巨噬細(xì)胞或胃上皮細(xì)胞釋放 IL-1β、IL-8、TNF-α 等炎癥細(xì)胞因子加劇病情的發(fā)展[4]，但不同來(lái)源的幽門螺桿菌菌株及其hsp60對(duì)細(xì)胞因子分泌是否有差異鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)基因定點(diǎn)突變、蛋白表達(dá)等技術(shù)獲得了幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)株26695的hsp60(即非胃癌來(lái)源株)與胃癌來(lái)源株的重組熱休克蛋白(rhsp60)[5]，將不同濃度的2種蛋白與U937細(xì)胞共培養(yǎng)，在前期證實(shí)rhsp60可促進(jìn)IL-6的分泌的基礎(chǔ)上[6]，觀察其對(duì)U937細(xì)胞分泌TNF-α、IL-17的影響，旨在研究不同來(lái)源菌株的菌體成分感染與細(xì)胞因子表達(dá)水平的關(guān)系，進(jìn)一步明確幽門螺桿菌的致病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與細(xì)胞株 大腸桿菌BL21、幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC26695、人髓系白血病細(xì)胞系U937細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 rhsp60與hsp60蛋白(本實(shí)驗(yàn)室自制保存)，RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone生物制品公司)，TNF-α、IL-17 試劑盒(美國(guó) RD 公司)，佛波酯(PMA)(Sigma公司)。

1.1.3 儀器 生物安全柜(上海博迅實(shí)業(yè)公司)，全自動(dòng)高壓滅菌器(日本三洋電器公司)，倒置熒光顯微鏡IX70-142(日本奧林巴斯)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀、細(xì)胞培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 U937細(xì)胞的培養(yǎng)與PMA處理 將凍存的U937細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)傳代，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用預(yù)溫的RPMI-1640洗2次，懸于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度達(dá)每毫升1×109個(gè)，取濃度為1 μg/mL的PMA加入培養(yǎng)瓶中，使其終濃度為10 ng/mL，培養(yǎng)14 h以上換液，倒置顯微鏡下細(xì)胞由獨(dú)立的、懸浮的小圓形變?yōu)槌蓤F(tuán)的、貼壁的、形狀不規(guī)則的細(xì)胞[7]，繼續(xù)培養(yǎng)24 h即可分化成巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 ELISA檢測(cè)TNF-α和IL-17的分泌 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期已經(jīng)分化的U937細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)12 h棄上清液，用RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升2×106個(gè)接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分別加hsp60(hsp60 組)、rhsp60(rhsp60 組)，最終濃度調(diào)整為 50、100、200 μg/mL，12、18、24 h 分別收集上清液保存待測(cè)，以加等體積磷酸鹽緩沖液(PBS)的細(xì)胞培養(yǎng)組作為對(duì)照組。TNF-α、IL-17的檢測(cè)嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作，酶標(biāo)儀450 nm測(cè)定樣品光密度(OD)值，ELISA標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為20～320 pg/mL，由繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中TNF-α、IL-17含量。以上實(shí)驗(yàn)，不同濃度均采用3個(gè)復(fù)孔。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以±s表示，采用 t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 rhsp60與hsp60刺激U937細(xì)胞后TNF-α的分泌不同濃度的rhsp60、hsp60與U937細(xì)胞共培養(yǎng)，在12、18、24 h測(cè)得兩組TNF-α分泌量均明顯高于對(duì)照組，且同時(shí)間點(diǎn)、同濃度下rhsp60組明顯高于hsp60組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表 1。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α水平比較(±s，pg/mL)

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α水平比較(±s，pg/mL)

注：與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，aP＜0.05；與同濃度、同時(shí)間點(diǎn)hsp60組比較，bP＜0.05。

組別hsp60組50 μg/mL 100 μg/mL 200 μg/mL rhsp60組50 μg/mL 100 μg/mL 200 μg/mL對(duì)照組培養(yǎng)時(shí)間(h)12 18 24 97.02±6.25a 145.23±9.71a 194.23±11.30a 131.39±8.04ab 181.49±9.01ab 241.32±11.31ab 56.25±3.87 127.34±8.24a 184.23±7.05a 219.27±10.11a 150.27±9.77ab 201.12±11.72ab 267.03±9.64ab 68.43±5.01 141.25±11.20a 197.64±9.64a 231.23±8.11a 161.55±9.82ab 217.08±12.35ab 275.17±11.05ab 81.32±5.46

2.2 rhsp60與hsp60刺激U937細(xì)胞后IL-17的分泌不同時(shí)間點(diǎn)兩組IL-17分泌量均明顯高于對(duì)照組，且同時(shí)間點(diǎn)、同濃度下rhsp60組高于hsp60組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表 2。

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-17水平比較(±s，pg/mL)

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-17水平比較(±s，pg/mL)

注：與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，aP＜0.05；與同濃度、同時(shí)間點(diǎn)hsp60組比較，bP＜0.05。

組別hsp60組50 μg/mL 100 μg/mL 200 μg/mL rhsp60組50 μg/mL 100 μg/mL 200 μg/mL對(duì)照組培養(yǎng)時(shí)間(h)12 18 24 45.12±3.41a 57.28±4.97a 68.51±6.38a 58.42±4.87a 69.51±7.02a 79.83±6.37a 64.41±8.21a 74.07±7.30a 84.85±6.94a 57.34±4.84ab 69.49±5.07ab 83.32±5.68ab 40.25±3.76 78.86±6.31ab 83.32±6.02ab 99.03±7.95ab 51.33±4.32 85.55±5.90ab 91.11±7.54ab 107.17±8.35ab 58.17±6.45

3 討 論

前期通過(guò)對(duì)幽門螺桿菌胃癌來(lái)源與非胃癌來(lái)源菌株的熱休克蛋白hsp60全基因序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)2類菌株的基因序列在1398、1399位點(diǎn)上存在差異[8]，胃癌來(lái)源菌株為GC；非胃癌來(lái)源菌株為AG，與幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC26695相同[9]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)定點(diǎn)突變、PCR等技術(shù)使基因序列的1398、1399位點(diǎn)由AG突變?yōu)镚C，成功獲得了胃癌來(lái)源突變株的重組rhsp60基因片段，其相應(yīng)表達(dá)的編碼蛋白467位點(diǎn)也由非胃癌來(lái)源株的谷氨酸變?yōu)槲赴﹣?lái)源株的谷氨酰胺，氨基酸的變化可能會(huì)引起空間結(jié)構(gòu)改變進(jìn)而影響到熱休克蛋白的功能。在前期證實(shí)rhsp60可刺激U937分泌IL-6增多的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)顯示，rhsp60也可促進(jìn)TNF-α、IL-17的分泌，與標(biāo)準(zhǔn)菌株的hsp60在同時(shí)間點(diǎn)、同濃度相比，存在顯著差異，提示幽門螺桿菌熱休克蛋白在促炎性細(xì)胞因子的分泌上可能存在菌株的差異，不同菌株具有不同的毒力及致病性。

病原菌感染機(jī)體后，一些炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β等作為細(xì)胞間的信使分子，受到病原菌刺激后往往分泌增加，以較高的親和力與相應(yīng)的靶細(xì)胞表面受體結(jié)合，以增強(qiáng)抗感染效應(yīng)促進(jìn)炎癥發(fā)展[10]。其中TNF-α主要由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，具有介導(dǎo)炎性反應(yīng)、參與免疫及內(nèi)分泌調(diào)節(jié)等廣泛的生物學(xué)作用；IL-17也是一種促進(jìn)炎癥發(fā)生的較重要的可溶性因子，能促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生趨化因子使中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞迅速增多并刺激機(jī)體產(chǎn)生IL-1和前列腺素E2等，進(jìn)一步增強(qiáng)局部炎癥[11]。臨床資料也證實(shí)，幽門螺桿菌是大多數(shù)胃炎、胃與十二指腸潰瘍的病因，炎癥的增強(qiáng)有誘發(fā)癌變的可能，進(jìn)而導(dǎo)致嚴(yán)重后果[12]。因此，研究幽門螺桿菌不同的菌株或菌體成分在炎癥發(fā)展中的作用，并明確炎癥因子分泌的信號(hào)通路機(jī)制，有助于探討新的治療方法阻止炎癥的發(fā)展與癌變以促進(jìn)人類的健康。

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