念珠菌耐藥機制的研究進展

賀小圓 趙明峰

（天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院天津市第一中心醫(yī)院血液科，天津300192）

念珠菌耐藥機制的研究進展

賀小圓 趙明峰

（天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院天津市第一中心醫(yī)院血液科，天津300192）

近年來，真菌感染尤其是機會性真菌感染的發(fā)生率和病死率呈不斷上升的趨勢，這主要與真菌耐藥和抗真菌藥物品種有限有關(guān)。念珠菌是人體內(nèi)的重要條件致病真菌，其常見的耐藥機制包括靶酶的改變、靶位的缺乏、真菌細(xì)胞膜對藥物的通透性下降、多藥耐藥蛋白表達增高、固醇合成旁路下游的改變、生物膜的形成等，最新文獻報道分泌型天冬氨酸蛋白酶在念珠菌的耐藥形成中存在一定作用。該文就念珠菌感染的流行病學(xué)和念珠菌的耐藥機制兩個方面進行綜述。

念珠菌；真菌耐藥；耐藥機制；分泌型天冬氨酸蛋白酶

［Chin J Mycol，2015，10（1）：49?53］

真菌耐藥是描述真菌感染對抗真菌治療反應(yīng)不佳，以至抗真菌藥物對真菌感染的治療失敗。近年來，由于抗真菌藥物品種和臨床使用量的增多，以及藥物的選擇性壓力，致使耐藥真菌數(shù)量及種類迅速增加，不僅影響藥物的治療效果，而且呈現(xiàn)出交叉耐藥，尤其威脅免疫功能受損的患者，如艾滋病、血液病或者接受器官移植的患者。深入研究真菌的耐藥機制，減緩與克服其耐藥性的發(fā)展，成為國內(nèi)外研究的熱點?，F(xiàn)就念珠菌感染的流行病學(xué)和念珠菌的耐藥機制兩個方面進行綜述。

1 念珠菌感染的流行病學(xué)

近30 a來，真菌感染尤其是機會性真菌感染的發(fā)生率和病死率呈不斷上升的趨勢。其中，真菌血癥增多尤為明顯，導(dǎo)致住院時間延長和死亡率增高［1］。這主要與真菌耐藥和抗真菌藥品種有限有關(guān)［1］。念珠菌是人體內(nèi)的重要條件致病真菌，主要定植于皮膚和黏膜，如口腔、胃腸道、陰道等處，正常情況下不致病。當(dāng)機體免疫力下降時，如抗菌藥物、免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素等藥物的廣泛應(yīng)用，白細(xì)胞減少、腫瘤、HIV感染、糖尿病等疾病的發(fā)病率增加，體內(nèi)留置導(dǎo)管、吻合物、人工瓣膜等侵入性操作的大量使用，器官移植的大型開展，老年患者的增多［2?3］，可導(dǎo)致淺表性念珠菌病，甚至侵襲性念珠菌病。

目前，人類已發(fā)現(xiàn)至少有17種念珠菌可致機體感染，其中超過90%的念珠菌感染是由白念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌和克柔念珠菌引起［4］。念珠菌病最常見的病原體是白念珠菌。近年來，非白念珠菌如光滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌的發(fā)病率也明顯增高［5］。據(jù)文獻報道，非白念珠菌病占所有念珠菌病的35%～65%［2］。Tortorano等［6］對歐洲的念珠菌血癥進行了分析，發(fā)現(xiàn)50%以上是由白念珠菌引起，光滑念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌分別占14%、14%、7%。一項在北美洲23個醫(yī)療中心開展的涉及2 019例患者念珠菌血癥的樣本研究結(jié)果顯示，白念珠菌分離株占45.6%，而非白念珠菌占54.4%［7］。Cornistein等［8］對阿根廷的神經(jīng)學(xué)中心2006～2010年間的念珠菌流行病學(xué)進行研究，觀察到白念珠菌占所有臨床樣本的43.3%，而非白念珠菌占56.7%?？梢姡啄钪榫亲畛Ｒ姷闹虏⌒阅钪榫?，且非白念珠菌發(fā)病率也在不斷增高。

2 念珠菌的耐藥機制

目前，臨床用于治療念珠菌病的抗真菌藥物有唑類、多烯類、棘白菌素類、5?氟胞嘧啶等。研究表明，念珠菌對這些藥物均存在不同程度的耐藥現(xiàn)象，但各種藥物的耐藥機制有所不同。常見的耐藥機制包括靶酶的改變、靶位的缺乏、真菌細(xì)胞膜對藥物的通透性下降、多藥耐藥蛋白（MDR）表達增高、固醇合成旁路下游的改變、生物膜的形成等。目前有關(guān)念珠菌耐藥機制的研究已經(jīng)取得了重要進展，最新文獻報道分泌型天冬氨酸蛋白酶（Sap）在念珠菌的耐藥形成中存在一定作用。以下將對念珠菌這些可能的耐藥機制進行詳述。

2.1 靶酶的改變與念珠菌耐藥

抗真菌藥物通過與相應(yīng)的靶酶結(jié)合，發(fā)揮抗真菌作用，如唑類、棘白菌素類。當(dāng)靶酶發(fā)生改變后，抗真菌藥物無法與其進行有效的結(jié)合而產(chǎn)生真菌耐藥。以唑類為例，唑類靶酶是一種細(xì)胞色素P450氧化酶，即羊毛甾醇 14α?去甲基化酶（CYP51、ERG11基因編碼），藥物與靶酶結(jié)合，影響羊毛甾醇14α?甲基的羥基化反應(yīng)從而造成麥角甾醇合成減少以及一些甾醇前體化合物的增多。此外，羊毛固醇在14?還原酶的催化下生成無毒的14α?甲基糞固醇，后者在 Δ5，6?甾醇去飽和酶（ERG3編碼）作用下轉(zhuǎn)變毒性甾醇14α?甲基?3，6?二醇，缺乏麥角固醇和14α?甲基?3，6?二醇的堆積抑制了真菌的生長。當(dāng)靶酶CYP51發(fā)生突變或過量表達時，均可能產(chǎn)生真菌耐藥［3］。①靶酶CYP51過量表達，導(dǎo)致胞內(nèi)藥物相對不足，不能完全抑制靶酶活性，從而對唑類藥物耐藥。②靶酶CYP51基因突變導(dǎo)致了唑類藥物對其親和力降低。從臨床耐藥菌株發(fā)現(xiàn)的CYP51氨基酸變異和通過定點突變技術(shù)研究表明，Y132H變異能使CYP51對氟康唑和伊曲康唑的親和力分別下降1／4和1／2。類似的突變位點還有T315A、A149V、D153E、E165Y、S279F、G465S、R467K、S405F等。多位點組合變異能使親和力下降更明顯，如Y132H和S405F組合、Y132H和R467K組合。

此外，棘白菌素類藥物也是通過作用于靶酶發(fā)揮抗真菌作用。其作用機制是該類藥物與靶酶β?（1，3）?D?葡聚糖合酶 （GS）結(jié)合，干擾真菌細(xì)胞壁β?1，3?D?葡聚糖的合成，后者是真菌細(xì)胞壁的重要組成部分，維持著細(xì)胞壁剛性和完整性，葡聚糖合成受阻后導(dǎo)致真菌細(xì)胞滲透壓不穩(wěn)定，最終引起細(xì)胞溶解。哺乳動物細(xì)胞因缺乏細(xì)胞壁而不受其影響。棘白菌素類是一類新型抗真菌抗生素，主要包括卡泊芬凈、米卡芬凈、阿尼芬凈。其應(yīng)用時間相對較短，但近來美國和歐洲國家已經(jīng)報道了白念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、熱帶念珠菌的耐藥案例。GS含2個亞基：催化亞基（FKS1和FKS2編碼）和調(diào)節(jié)亞基 （Rho1p）［9］。目前認(rèn)為，棘白菌素類耐藥主要和FKS基因突變有關(guān)。白念珠菌、熱帶念珠菌和克柔念珠菌突變主要發(fā)生在FKS1，而光滑念珠菌可發(fā)生FKS1和FKS2突變［10］。FKS1基因是 GS的主要催化亞基，當(dāng)FKS1發(fā)生突變，其對棘白菌素類抗真菌藥物的耐受性提高 （高于敏感菌株的10倍以上），對臨床分離的耐白念珠菌菌株的檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KS1的突變主要集中在其HS區(qū)域，其相應(yīng)的氨基酸區(qū)域 在 641?649位 （HS1）和 1357?1364位（HS2），其中Ser645發(fā)生突變的頻率最高。Gar?cia?Effron等報道，光滑念珠菌Fks1p中632位的天冬氨酸置換成谷氨酸，和Fks2p中659位的苯丙氨酸置換成纈氨酸可導(dǎo)致棘白菌素類耐藥［11］。

2.2 靶位的缺乏與念珠菌耐藥

某些抗真菌藥物通過與真菌細(xì)胞相應(yīng)的靶位結(jié)合，產(chǎn)生抗真菌作用。當(dāng)靶位缺乏時，可導(dǎo)致真菌耐藥。此類耐藥機制以多烯類藥物為代表。

多烯類抗真菌藥物主要包括兩性霉素B（AmB）、制霉菌素。其特點是作用于細(xì)胞膜中含有固醇的真菌，多烯類抗真菌藥物通過其疏水的雙鍵與固醇結(jié)合形成甾醇一多烯復(fù)合物，使細(xì)胞膜脂質(zhì)層發(fā)生去極化，形成多孔狀，使K＋、Mg2＋等離子和基質(zhì)外泄而導(dǎo)致真菌死亡。此外還可通過氧化反應(yīng)進一步加重細(xì)胞膜氧化損傷從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。AmB已在臨床使用多年，有歐洲研究報道，大多數(shù)念珠菌對AmB敏感，然而少數(shù)念珠菌仍然對其存在耐藥現(xiàn)象。對耐藥株細(xì)胞膜進行分析，發(fā)現(xiàn)耐AmB的念珠菌細(xì)胞膜中的麥角甾醇含量較敏感株減少［12］。有研究認(rèn)為，使用唑類抗真菌藥物抑制麥角甾醇的生物合成，能致細(xì)胞膜中缺少AmB的結(jié)合位點，使真菌對AmB產(chǎn)生耐藥性。

2.3 細(xì)胞膜通透性下降與念珠菌耐藥

細(xì)胞膜的主要成分包括蛋白質(zhì)、糖類、磷脂和固醇等。細(xì)胞膜成分的改變可導(dǎo)致藥物的膜通透性降低，使得細(xì)胞攝取和蓄積的藥物量減少，從而不能有效抑制真菌生長，導(dǎo)致真菌耐藥。真菌細(xì)胞膜上磷脂及固醇組成發(fā)生變化，影響到細(xì)胞膜的流動性和不對稱性，導(dǎo)致對藥物的被動擴散和主動轉(zhuǎn)運功能下降，從而降低細(xì)胞內(nèi)抗真菌藥物濃度。Mansfield等［13］證實唑類通過不耗能的易化擴散被白念珠菌和其他致病真菌攝取，而且所有唑類被攝取的機制相同，都是由轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)。因此，轉(zhuǎn)運蛋白發(fā)生突變可導(dǎo)致唑類交叉耐藥。

2.4 多藥耐藥蛋白（MDR）與念珠菌耐藥

真菌細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度降低，除細(xì)胞膜對藥物的通透性下降外，還可由藥物外排增多引起。后者是由兩種多藥耐藥蛋白（MDR）介導(dǎo)［14］的耐藥機制。

MDR蛋白屬于外排泵轉(zhuǎn)運蛋白，包括ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子家族 （ATP?binding cassette transports，ABC）與主要易化子超家族（the major facilitator su?perfamily，MFS）。前者與念珠菌耐藥相關(guān)的外排泵編碼基因為CDR1和CDR2，后者與耐藥相關(guān)的基因為MDR。Cdr1p、Cdr2p增加藥物的外排，Mdr1p抑制攝入降低胞內(nèi)藥物濃度。但耐藥菌株對這兩種蛋白的上調(diào)不需同步進行。而且CDR和MDR分別表達時，念珠菌表現(xiàn)出的耐藥性所針對的藥物種類也有所差別。CDR針對的主要是脂溶性分子，大多數(shù)唑類藥物如伊曲康唑、酮康唑是脂溶性的。在耐藥念珠菌菌株中，CDRl基因的mRNA水平可增高5～8倍。Manoharlal等［15］發(fā)現(xiàn)唑類耐藥株CDR1 mRNA半衰期較敏感株長，還進一步證實了PAP1基因雜合性缺失與唑類耐藥株CDR1 mR?NA穩(wěn)定性的關(guān)系［16］。Cdr2p其氨基酸序列有84%與Cdr1p的氨基酸序列相同，但CDR2基因介導(dǎo)的耐藥水平低于CDRl基因。和CDR相比，對MDR的研究較少，目前認(rèn)為其主要針對水溶性分子如氟康唑。

此外，外排泵基因的表達受轉(zhuǎn)錄因子TAC1和MRR1的調(diào)控［14］。Coste等［17］報道純合子念珠菌菌株具體高活性的TAC1，高活性的TAC1導(dǎo)致CDR1和CDR2的高表達，可增強對氟康唑的耐藥。TAC1的高活性僅存在于純合子中，因此該基因雜合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）也與唑類耐藥有關(guān)［17］。此外，Morschh?user等通過對比3株高表達MDR1的白念珠菌臨床分離株和唑類敏感株，發(fā)現(xiàn)3株MRR1都上調(diào)［14］。

2.5 固醇合成旁路下游的改變與念珠菌耐藥

這種耐藥機制主要是針對唑類藥物產(chǎn)生的。唑類一方面通過結(jié)合靶酶抑制麥角固醇的合成，另一方面通過旁路將無毒的14α?甲基糞固醇轉(zhuǎn)變成毒性甾醇14α?甲基?3，6?二醇，后者由Δ5，6?甾醇去飽和酶催化。缺乏麥角固醇和14α?甲基?3，6?二醇的堆積共同抑制了真菌的生長。如果ERG3基因發(fā)生突變，不能產(chǎn)生有活性的Δ5，6?甾醇去飽和酶，使細(xì)胞內(nèi)累積的是14α?甲基糞固醇而不是14α?甲基?3，6?二醇，前者能部分替代麥角固醇的功能，維持真菌細(xì)胞生長，從而對唑類耐藥。另有報道，EFG1參與ERG3基因表達調(diào)節(jié)，EFG1發(fā)生突變后增加對唑類的敏感性［18］。

2.6 生物膜的形成與念珠菌耐藥

念珠菌細(xì)胞具有酵母相和菌絲相兩種狀態(tài)。酵母細(xì)胞在宿主體內(nèi)并不單獨存在，而總是聚集形成生物膜［2］。生物膜是指微生物分泌于細(xì)胞外的多糖蛋白復(fù)合物，將自身包裹其中于生物表面形成的膜狀物，實質(zhì)是細(xì)胞外基質(zhì)。其重要后果是使真菌對多種唑類藥物呈現(xiàn)高度耐藥性，敏感性下降幾十倍甚至幾百倍。生物膜形成所致的高度耐藥性可能與下列因素有關(guān)［19］：①膜內(nèi)真菌生長速率慢。②胞外聚合物基質(zhì)所形成的膜屏障作用。③表面誘導(dǎo)耐藥基因的表達。④膜表面甾醇代謝異常。⑤細(xì)胞的異質(zhì)性，大量菌絲細(xì)胞的存在。⑥上調(diào)外排泵基因。⑦膜內(nèi)存在持續(xù)程序細(xì)胞。

2.7 分泌型天冬氨酸蛋白酶（Sap）與念珠菌耐藥

分泌型天冬氨酸蛋白酶（Secreted aspartic pro?teinase，Sap）在1965年首次被描述，并被命名為念珠菌酸性蛋白酶，主要因其首次發(fā)現(xiàn)于念珠菌屬，且在酸性環(huán)境中具有最佳活性而得名。以往對其研究較多的是Sap與念珠菌致病性的關(guān)系，而Sil?va［2］等首次提出Sap在念珠菌耐藥形成中存在一定作用。

目前，Sap的研究主要集中在白念珠菌，其他非白念珠菌的研究較少。白念珠菌的Sap由10個SAP基因家族編碼，后者可分為6個亞家族：SAP1?3，SAP4?6，SAP7，SAP8，SAP9，SAP10［2］。念珠菌毒力相關(guān)因子包括黏附能力、生物膜形成能力、菌絲形成、表型轉(zhuǎn)換、溶血素、水溶酶的分泌等。其中最重要的毒力相關(guān)因子是水溶酶，而Sap被認(rèn)為是念珠菌最重要的水溶酶，與念珠菌黏附、侵襲和組織損傷有關(guān)?；驕y序表明，非致病念珠菌編碼Sap的基因通常較機會性致病菌少。可見，Sap在念珠菌的致病性中有重要作用。

文獻報道，感染氟康唑耐藥的白念珠菌患者，給予常規(guī)劑量的氟康唑治療，可導(dǎo)致患者發(fā)生持續(xù)性感染，主要是因為Sap的分泌增加。Wu等［20］對其研究發(fā)現(xiàn)，將白念珠菌分離株培養(yǎng)在亞抑制濃度的氟康唑中，表現(xiàn)為Sap產(chǎn)生增加，且和氟康唑耐藥性增高相關(guān)。該研究還觀察到，氟康唑敏感株表現(xiàn)為Sap活性下降，而耐藥株則表現(xiàn)為Sap活性增高，并取決于氟康唑的給藥劑量。此外，Costa等［21］報道唑類耐藥的分離株在唑類藥物存在的情況下Sap活性增高，而敏感株Sap活性無明顯增高。Kumar等也有相似報道，發(fā)現(xiàn)對兩性霉素B耐藥的念珠菌分離株比敏感株表現(xiàn)出更強的蛋白水解活性［22］。

最新文獻報道，暴露在亞抑制濃度的抗真菌藥物中，可促進耐藥株的形成，并伴有Sap分泌增加和蛋白水解活性增高［2］。Becker等［23］認(rèn)為念珠菌致病性與抗真菌藥物的耐藥之間存在一定關(guān)系。暴露在亞抑制濃度的抗真菌藥物中，可能刺激念珠菌毒力相關(guān)因子的表達 （如Sap），導(dǎo)致真菌致病性增強，從而產(chǎn)生耐藥。此外，Puri等［24］對白念珠菌研究報道，Sap通過水解Msb2黏蛋白，激活Cek1 MAPK信號途徑影響生物膜的形成。Sap抑制劑的使用或Sap突變可導(dǎo)致MAPK信號途徑受阻，伴有生物膜形成缺陷和毒力下降。所以，Sap也可能通過影響生物膜形成，間接導(dǎo)致真菌耐藥。目前關(guān)于SAP基因表達的研究較少，且主要集中在白念珠菌。Sap在真菌耐藥機制中的作用尚不明確，有待進一步研究。通過對Sap的深入研究，可能為真菌治療提供新的靶點和思路。

3 結(jié) 語

和細(xì)菌耐藥的發(fā)生率相比，念珠菌耐藥的發(fā)生率相當(dāng)?shù)?。念珠菌病不是傳染性疾病，因此，罕見發(fā)生患者間的耐藥傳播。此外，在酵母細(xì)胞中，耐藥機制也不能通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)移?？梢姡拐婢幍谋┞妒谦@得性耐藥形成的必備條件。真菌耐藥性的產(chǎn)生可能是上述單獨一種機制或者幾種機制共同作用的結(jié)果，還可能與其他一些因素有關(guān)，如細(xì)胞免疫低下或缺陷易導(dǎo)致耐藥菌株產(chǎn)生、藥物與機體感染狀況對真菌耐藥性有誘導(dǎo)作用，菌株的耐藥性可能經(jīng)遺傳獲得等。念珠菌病發(fā)病率的增高和治療的困難要求臨床醫(yī)生應(yīng)該更好地理解念珠菌的耐藥機制，合理規(guī)范地使用抗真菌藥。真菌耐藥性問題的解決將是一個長期和艱巨的任務(wù)。深入探討真菌的耐藥機制，將為真菌耐藥的治療提供新的線索和方向。

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The research progress on antifungal resistance mechanisms of Candida spp.

HE Xiao?yuan，ZHAO Ming?feng
（Department of Hematology，Tianjin First Central Hospital，Tianjin 300192，China）

In recent years，the incidence and mortality of fungal infection，especially the opportunistic fungal infection have been increasing.This is mainly associated with antifungal resistance and the restricted number of available antifungal drugs.Candida species are opportunistic fungi in human body.The common antifungal resistance mechanisms include the changes of the target enzyme，the lack of target site，the drug permeability decline of fungal cell membrane，the increased expression of multi?drug resistance protein，the change of cholesterol synthesis bypass，the biofilm formation and so on.The latest literature reports that secreted aspartic proteinases have a role in antifungal resistance of Candida spp.In this article，the epidemiology of Candida spp.infection and its possible antifun?gal resistance mechanisms are reviewed briefly.

Candida spp；antifungal resistance；resistance mechanisms；secreted aspartic proteinase

R 379.4

A

1673?3827（2015）10?0049?05

2014?05?20

［本文編輯］ 施 慧

天津市自然科學(xué)基金 （13JCYBJC23400），天津市衛(wèi)生局科技基金攻關(guān)項（13KG106）

賀小圓，女（漢族），碩士研究生在讀.E?mail：hexiaoyuan09＠126.com

趙明峰，E?mail：zmfzmf＠hotmail.com