黃連等中藥對多重耐藥性鮑曼不動桿菌的篩選研究①

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（1.右江民族醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，桂西微生物感染研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 百色 533000 E－mail：38673360＠qq.com；2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000；3.廣西百色市人民醫(yī)院，右江民族醫(yī)學(xué)院附屬西南醫(yī)院，廣西 百色 533000；4.右江民族醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西 百色 533000）

鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii，Ab）存在于正常人體的皮膚、呼吸道和泌尿道，也廣泛分布于自然界的水及土壤中，抵抗力強(qiáng)，干燥表面可以長期存活；定植率高，75%住院患者可發(fā)生定植，在危重病癥患者中感染率較高［1］。該菌是引起醫(yī)院感染的常見病原菌，為條件致病菌［2］。隨著抗生素的廣泛使用，近年來Ab感染呈持續(xù)上升趨勢，且呈泛耐藥狀態(tài)。美國疾病控制和預(yù)防中心（CDC）調(diào)查顯示：泛耐藥不動桿菌（PDR－Ab）從1994年9.4%上升到2007年的40.6%［3］。其泛耐藥問題已經(jīng)成為重癥監(jiān)護(hù)病房感染控制的難題，也是重癥感染患者重要的死因之一。國內(nèi)有報道［4］稱Ab患者總死亡率為24.0%。因此尋找新的抗菌藥物或藥物增效劑勢在必行。我國中草藥資源豐富，不少藥物具有抗菌作用［5］。本研究用黃連等中草藥對Ab進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，找出其對Ab的最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。

1 材料和方法

1.1 菌株 65株鮑曼不動桿菌是2014年2～12月右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院和百色市人民醫(yī)院臨床分離的菌株，標(biāo)本來源于痰液標(biāo)本、創(chuàng)傷分泌物、深靜脈導(dǎo)管、血標(biāo)本等。所有菌株經(jīng)VITEK微生物分析儀鑒定確認(rèn)。質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923，大腸埃希菌ATCC25922。

1.2 儀器和培養(yǎng)基 VITEK2compact全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)（法國，biomerierx.inc），AST－GN09藥敏卡，GN鑒定卡。水解酪蛋白（MH）瓊脂粉（杭州天和微生物有限公司）。天平（EEA，DT500A），電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），生物安全柜。質(zhì)控藥敏紙片（杭州天和微生物試劑有限公司）：慶大霉素（GEN），鏈霉素（STR），氯霉素（CHL），克林霉素（CLI）。

1.3 藥物 黃連、五味子、夏枯草等購自陜西昂盛生物醫(yī)藥科技有限公司。蘇鐵、鐵包金、木蝴蝶、馬蹄金、穿心草、高良姜、三葉酸全草由我院藥理學(xué)院潘勇老師提供。

1.4 方法

1.4.1 藥物制備 水提液的提?。狐S連100g，磨碎，加水1～2L，浸泡30min后煎煮，煮沸后文火煎30 min，過濾。藥渣加水0.5～1L，按上述方法進(jìn)行再次操作后，過濾藥液，合并2次濾液，用文火濃縮為100 ml，使藥液濃度為1∶1（每1ml藥液含生藥1g）。4℃保存?zhèn)溆茫?－7］。用同樣的方法制備夏枯草、三葉酸全草、五味子、蘇鐵、鐵包金、木蝴蝶、馬蹄金、高良姜、穿心草等水提液。醇提液：將黃連等藥品干燥粉碎，用6倍75%乙醇回流提取2次，減壓回收乙醇濃縮成1∶1的藥液待用［8］。用同樣的方法制備夏枯草、夏枯草、三葉酸全草、五味子、蘇鐵、鐵包金、木蝴蝶、馬蹄金、高良姜、穿心草的醇提液。大蒜提取液：新鮮剝皮的大蒜，取200g，首先用高錳酸鉀（1∶1 000）溶液浸泡1 h，然后用無菌蒸餾水洗滌2次，放置于無菌的研缽內(nèi)，搗成糊狀，按1∶1加入無菌蒸餾水，離心沉淀混合液，取上層清液（濃度為1g/ml）存放以備用。

1.4.2 K－B藥敏紙片法 將Ab接種于普通培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，用接種環(huán)挑取形態(tài)相似菌落4～5個，接種于5ml的MH肉湯中，37℃ 孵育2h，用生理鹽水配制成濃度為0.5麥?zhǔn)?比濁標(biāo)準(zhǔn)，約含1～2108CFU/ml的菌懸液。取高壓滅菌后的空白藥敏紙片，在無菌操作下，將空白藥敏紙片放入樣液中，浸泡1h，取上述的菌懸液用棉簽涂布于MH平板，再將含有樣液的紙片瀝水，微干后均勻鋪在含菌MH平板表面，37℃培養(yǎng)24h后觀察記錄結(jié)果。

1.4.3 瓊脂稀釋法測MIC 采用美國CLSI標(biāo)準(zhǔn)瓊脂稀釋法測定各種中藥提取液的MIC［9］?？咕幬餃y定濃度范圍為1～0.03125g/ml。各濃度的中藥提取液按1∶10比例分別加入經(jīng)高壓滅菌，并在45～50℃水浴中平衡的MH瓊脂中，充分混勻傾倒滅菌平皿，瓊脂厚度5～6mm。制備濃度相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管的菌懸液，再1∶10稀釋，用微量移液器吸取制備好菌液（約2μl）接種于瓊脂平板表面，每點(diǎn)菌數(shù)約為104CFU，形成直徑為5～8mm的菌斑。接種好后置37℃培養(yǎng)箱中24h觀察結(jié)果，以抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度為MIC。

2 結(jié)果

2.1 菌株分離結(jié)果 耐頭孢菌素和磺胺類、碳青霉烯類的Ab為22株，耐頭孢類、碳青霉烯類、P－內(nèi)酰胺酶抑制劑、磺胺類的Ab為20株；耐頭孢菌素、P－內(nèi)酰胺酶抑制劑、碳青霉烯類、喹諾酮類、磺胺類、氨基糖苷類的Ab菌株為23株。

2.2 各種中藥（K－B）藥敏紙片法結(jié)果 由表1、表2可以看到，黃連、木蝴蝶、馬蹄金水提液和醇提液對多重耐藥Ab敏感，蘇鐵、鐵包金、穿心草對多重耐藥Ab輕度敏感，夏枯草、三葉酸全草、五味子、高良姜水提液和醇提液對多重耐藥Ab均耐藥，大蒜對多重耐藥Ab耐藥。

表1 藥敏紙片法測水提各種中藥對不同耐藥類型Ab的影響

2.3 瓊脂稀釋法測MIC結(jié)果 黃連、木蝴蝶、馬蹄金水提液，MIC為1g/ml、0.5g/ml、0.5g/ml、1g/ml、1 g/ml、0.5g/ml，見表3。

3 討論

黃連是臨床常用大宗藥材之一，是傳統(tǒng)的抗菌抗病毒藥物，抗菌譜廣?，F(xiàn)代藥理研究表明［10］，黃連根莖中含有多種異喹啉類生物堿，其中小檗堿（Berberine，Ber）又名黃連素，為黃連的主要成分，含量約5%～8%，具有對熱不穩(wěn)定性，有極其廣泛的抗菌譜，對某些革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌具有一定的抑制作用。王育紅等［11］曾對56種金黃色葡萄球菌的體外抑菌實(shí)驗(yàn)用中藥的水煎劑，包括黃連等實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示所選用的中藥水煎劑對此26種金色葡萄球菌都有抑制作用。我們在此研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究黃連對Ab的作用。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃連的水提液和醇提液對Ab敏感，MIC為1g/ml；對不同類型的耐藥性Ab沒有明顯區(qū)別。馬蹄金為旋花科植物馬蹄金（Dichondra repens Forst）的全草，又名黃疸草。味苦、辛，性微寒，主入肺經(jīng)和胃經(jīng)，具有清熱解毒、利水、活血的功效。馬蹄金提取物對金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌等革蘭氏陽性致病球菌的抗菌作用較強(qiáng)；而對大腸桿菌、傷寒桿菌、變形桿菌、產(chǎn)氣桿菌等革蘭氏陰性桿菌作用較弱，主要為抑制作用［12］。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)馬提金的水提液和醇提液對Ab敏感，MIC為0.5g/ml，其對不同耐藥類型的Ab沒有明顯區(qū)別。木蝴蝶Semen.oroxyli為柴葳科木蝴蝶屬植物木蝴蝶Orocy－lumineicum（L.）Vent.（Big－nonia indica L.）的成熟種子。木蝴蝶性味苦、甘、涼，入肺、肝、胃經(jīng)。有清肺、利咽、止咳、舒肝和胃之功效。主治肺熱咳嗽、喉痹、音啞、肝胃氣痛、瘡口［13］。木蝴蝶種子含黃芩甙元（Baicalein）和白楊素（chrysin）。黃芩甙元具有抗炎、抗變態(tài)、利尿和利膽等作用［14］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明木蝴蝶的醇提液和水提液對Ab敏感，MIC為0.5g/ml，其對不同耐藥類型的Ab沒有明顯區(qū)別。

表2 藥敏紙片法測醇提各種中藥對不同耐藥類型Ab的影響

表3 瓊脂稀釋法測MIC結(jié)果 （單位：g/ml）

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