新一代測序數(shù)據(jù)的罕見遺傳變異關(guān)聯(lián)性統(tǒng)計(jì)方法*

曾 平 趙 楊 陳 峰△

新一代測序數(shù)據(jù)的罕見遺傳變異關(guān)聯(lián)性統(tǒng)計(jì)方法*

曾 平1,2趙 楊1陳 峰1△

通過在基因組水平上對成千上萬的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)進(jìn)行系統(tǒng)性檢測和分析，全基因組關(guān)聯(lián)性研究(genome-wide association study，GWAS)發(fā)現(xiàn)了一系列與人類復(fù)雜性狀和疾病(比如，身高、惡性腫瘤、糖尿病和高血壓)相關(guān)的常見遺傳變異位點(diǎn)[1-3]。這些發(fā)現(xiàn)為深入研究疾病的遺傳基礎(chǔ)、發(fā)展新的診斷技術(shù)和治療方法提供了全新的視角。

現(xiàn)階段GWAS的有效性主要取決于常見疾病常見變異(common disease common variant，CDCV)的假設(shè)[4]，即認(rèn)為復(fù)雜疾病是大量具有弱效應(yīng)的常見遺傳變異和環(huán)境因素的共同結(jié)果。受技術(shù)上的制約，目前的商業(yè)芯片只能精確地檢測最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)大于1%～5%的SNP(稱為常見變異)，而MAF<1%～5%的SNP(稱為罕見變異)分型被認(rèn)為是有問題的，通常在GWAS數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制階段就會被刪除掉[5-6]，因此無法研究罕見變異與疾病的關(guān)系。

盡管GWAS取得了成功，但是對許多復(fù)雜疾病而言，已發(fā)現(xiàn)的常見位點(diǎn)僅能解釋極少一部分的遺傳度，沒能取得預(yù)期的突破性進(jìn)展，這種現(xiàn)象被稱為遺傳缺失(missing heritability)[7-8]。雖然遺傳缺失的原因是多方面的(例如，關(guān)聯(lián)性統(tǒng)計(jì)分析方法效能低、大量弱效應(yīng)的SNP尚沒有被發(fā)現(xiàn)以及環(huán)境因素及其與基因的交互作用)，并且關(guān)于常見和罕見變異在復(fù)雜疾病中的遺傳模式也存在爭議[9]，但越來越多的科學(xué)研究表明罕見變異在復(fù)雜疾病的發(fā)生發(fā)展過程中同樣起著十分重要的作用，即所謂常見疾病簾見變異(common disease rave variant,CDRV)的假設(shè)[10-14]。最近的研究顯示罕見變異與復(fù)雜疾病之間的效應(yīng)往往高于常見變異[15]：常見變異的OR值多介于1.20～1.50，均值為1.36，而罕見變異的OR值一般都在2.00以上，均值為3.74。隨著下一代測序技術(shù)(next-generation sequencing technologies)的發(fā)展和應(yīng)用，科學(xué)家們已經(jīng)能夠在全基因組或全外顯子水平上進(jìn)行更高密度和更高精度的測序工作，能夠精確地檢測更低頻和罕見的遺傳位點(diǎn)[16]。許多研究顯示罕見變異對復(fù)雜疾病有實(shí)質(zhì)性的貢獻(xiàn)[14-15]，例如，位于ABCA1、APOA1、LCAT、APOA5、GCKR、LPL和APOB的罕見變異被發(fā)現(xiàn)與血漿中高密度脂蛋白水平有關(guān)[17-18]，位于ANGPTL4的罕見變異能夠顯著降低甘油三酯和升高高密度脂蛋白[19]，著名的Framingham心臟研究顯示，通過調(diào)節(jié)腎臟對鹽的代謝，位于SLC12A3、SLC12A1和KCNJ1的罕見變異能夠有效降低血壓[20]，此外一組罕見變異被證明與炎癥性腸病存在關(guān)聯(lián)[21]，最近的報(bào)道表明位于染色體8q24的罕見變異位點(diǎn)rs188140481是前列腺癌的高風(fēng)險(xiǎn)遺傳因子[22]。

這些最新的科學(xué)證據(jù)無疑表明罕見變異與復(fù)雜疾病密切相關(guān)，是遺傳缺失的重要原因之一[7-8,23]。然而，遺憾的是，罕見變異的關(guān)聯(lián)研究不但面臨著與常見變異相同的挑戰(zhàn)(比如，高維度、統(tǒng)計(jì)效能低和多重比較)，還具有更大的困難。從研究設(shè)計(jì)角度講，由于罕見變異的發(fā)生極其稀少，因此需要在更廣泛的人群中收集樣本，這將導(dǎo)致研究費(fèi)用和執(zhí)行難度增加；從統(tǒng)計(jì)方法角度講，即便是在大樣本的情況下，現(xiàn)有的用于常見變異的關(guān)聯(lián)分析方法對罕見變異的統(tǒng)計(jì)效能也很低或者根本不能使用[11,13,24-26]。

因此，發(fā)展高效靈活的罕見變異關(guān)聯(lián)分析方法不但有利于進(jìn)一步設(shè)計(jì)更加有效的GWAS研究，也是下一代測序工作的必然要求，更是當(dāng)前統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)和生物信息學(xué)面臨的迫切任務(wù)之一。過去幾年罕見遺傳變異關(guān)聯(lián)性分析方法迅速發(fā)展，本文主要對這些新出現(xiàn)的關(guān)聯(lián)性分析思維和統(tǒng)計(jì)方法做一個系統(tǒng)性的介紹，使應(yīng)用者了解這些方法背后的假設(shè)及其優(yōu)缺點(diǎn)。

罕見遺傳變異關(guān)聯(lián)性分析統(tǒng)計(jì)方法

設(shè)遺傳位點(diǎn)的基因型為aa、Aa和AA，其中a表示次等位基因。由于罕見遺傳變異的MAF很小，即對某個具體的罕見位點(diǎn)而言，在人群中其基因型基本上全是AA，只有極個別的個體(在小樣本研究中甚至可能沒有個體)表達(dá)為aa和Aa。這導(dǎo)致的后果是，罕見變異的關(guān)聯(lián)性分析無法像常見變異那樣基于單個位點(diǎn)進(jìn)行，如采用χ2檢驗(yàn)、簡單線性回歸或logistic回歸，或者單位點(diǎn)分析對罕見變異的檢驗(yàn)效能極低[13,24,27]。

最近統(tǒng)計(jì)學(xué)家們提出了專門針對罕見變異的關(guān)聯(lián)性分析方法，這些方法的基本策略是：針對一組而非單個位點(diǎn)進(jìn)行。當(dāng)對罕見遺傳位點(diǎn)無法進(jìn)行單位點(diǎn)分析或效能極低時，對一組罕見位點(diǎn)同時檢驗(yàn)是很自然的選擇。相對單個位點(diǎn)，基因是與疾病更加相關(guān)的功能單位，因此文獻(xiàn)中通常根據(jù)基因定義一組罕見遺傳變異。我們接下來介紹基于合并思想的檢驗(yàn)方法和基于隨機(jī)效應(yīng)方差成分的檢驗(yàn)方法，以及其他方法。

1.基于合并思想的方法

隊(duì)列等位基因合計(jì)檢驗(yàn)(cohort allelic sum test，CAST)[28]、聯(lián)合多元合并檢驗(yàn)(combined multivariate and collapsing test，CMC)[29]以及分組加權(quán)合計(jì)檢驗(yàn)(group-wise weighted sum test，GWST)[30]是三種常見的基于合并的方法，也是最早提出的罕見變異關(guān)聯(lián)性分析方法。

CAST根據(jù)一組位點(diǎn)中是否包含罕見SNP建立一個新的指示變量(假設(shè)為Z)：Z=1表示這組位點(diǎn)包含至少一個罕見SNP，Z=0表示不包含罕見位點(diǎn)，即都是常見變異；然后采用類似χ2的方法執(zhí)行關(guān)聯(lián)性分析。CMC同樣需要建立新的變量，但與CAST略有不同，在合并的過程中CMC計(jì)數(shù)這組罕見變異的個數(shù)而非僅僅是否包含罕見位點(diǎn)；然后將新的變量和常見變異一起執(zhí)行HotellingT2檢驗(yàn)。GWST在合并的過程中對每個罕見變異進(jìn)行加權(quán)后求和，權(quán)重和MAF有關(guān)，通常MAF越小，權(quán)重越大。

雖然在如何合并一組罕見變異及其權(quán)重選擇方面存在細(xì)微差別，但這些方法都基于樸素的思想：按照功能相近或物理位置相鄰的原則(如：同一基因或通路)，將某個區(qū)域內(nèi)的罕見變異合并成單個位點(diǎn)，然后對合并的位點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，因此統(tǒng)稱為負(fù)荷檢驗(yàn)[25,31]。其合理之處在于，實(shí)際中常常觀察到一組罕見變異共同與某種疾病有關(guān)，合并多個位點(diǎn)有利于關(guān)聯(lián)信號的富集和增強(qiáng)。事實(shí)上，負(fù)荷檢驗(yàn)基于如下的假設(shè)：該區(qū)域內(nèi)所有或絕大多數(shù)罕見變異為關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，并且對疾病或表型影響的效應(yīng)方向一致。然而這個假設(shè)存在明顯的問題：①一組罕見變異可能與疾病有關(guān)、也可能和疾病無關(guān)，即使有關(guān)也可能只有少數(shù)幾個是致病位點(diǎn)；②對一組罕見變異如何進(jìn)行合理合并目前觀點(diǎn)尚未統(tǒng)一；③更重要的是，致病位點(diǎn)有的可能具有保護(hù)作用，有的可能具有危險(xiǎn)作用?，F(xiàn)實(shí)中，我們基本上無法了解疾病的遺傳模式或只有十分有限的認(rèn)識，也就無法判斷是否所有罕見位點(diǎn)的效應(yīng)總是同方向的。因此，負(fù)荷檢驗(yàn)最大的缺點(diǎn)在于無法處理位點(diǎn)效應(yīng)方向性的問題，在異質(zhì)性效應(yīng)的情況下盲目進(jìn)行位點(diǎn)合并無疑稀釋了關(guān)聯(lián)信號，從而降低統(tǒng)計(jì)效能[25,27,32-34]。

Price等[35]提出的可變閾值方法(variable-threshold test，VT)和負(fù)荷方法類似，不同之處在于，VT采用一系列閾值而非選擇單個值(如0.01)來區(qū)分常見變異和罕見變異，針對每個閾值計(jì)算一個統(tǒng)計(jì)量，選擇其中最大者為最終假設(shè)檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量，最后采用permutation程序獲得對應(yīng)的P值。VT背后的假設(shè)在于，具有不同MAF的罕見遺傳位點(diǎn)可能對疾病的功能影響是不一樣的。其缺點(diǎn)在于，和負(fù)荷檢驗(yàn)一樣在效應(yīng)異質(zhì)時效能低，并且因?yàn)椴捎弥爻闃拥姆椒◤亩?jì)算量大。

Han和Pan[34]意識到負(fù)荷檢驗(yàn)在效應(yīng)方向不同時效能低的缺點(diǎn)，提出了一種基于數(shù)據(jù)的自適應(yīng)求和檢驗(yàn)方法(data adaptive sum test)。為克服效應(yīng)方向的問題，該方法對每個罕見位點(diǎn)與疾病之間的關(guān)系進(jìn)行回歸分析，通過回歸系數(shù)判斷該位點(diǎn)是具有正方向(符號為正)的影響還是負(fù)方向(符號為負(fù))的影響；如果某個回歸系數(shù)的P值小于α0(比如0.10)且符號為負(fù)，則對該位點(diǎn)進(jìn)行重新編碼：假設(shè)原來的基因型aa、Aa和AA分別賦值為2、1和0，則重新編碼為0、1和2；最后采用類似負(fù)荷檢驗(yàn)的方法進(jìn)行位點(diǎn)合并和執(zhí)行假設(shè)檢驗(yàn)。在這一過程中重新編碼會導(dǎo)致原始的無效假設(shè)分布失效，因此采用permutation程序獲得P值。該方法雖然在一定程度上克服了效應(yīng)方向性的問題，但是存在以下問題：①需要對單個位點(diǎn)進(jìn)行效應(yīng)估計(jì)和計(jì)算P值，然而如前所述在很多情況下，單位點(diǎn)罕見變異回歸分析很不穩(wěn)定或無法進(jìn)行[36]，因此獲得的估計(jì)結(jié)果將嚴(yán)重影響后續(xù)的分析；②如何合適地選擇α0及其敏感性尚不明確；③由于采用permutation程序?qū)⒃龃笥?jì)算量。

2.基于混合效應(yīng)模型方差成分的方法

從上可見，針對一組罕見變異的關(guān)聯(lián)性研究，恰當(dāng)?shù)靥幚砦稽c(diǎn)效應(yīng)的方向性無疑是至關(guān)重要的?；诜讲畛煞謾z驗(yàn)的提出正是出于這種認(rèn)識，與負(fù)荷檢驗(yàn)不同，方差成分檢驗(yàn)并不關(guān)注如何合并罕見變異，而是將一組罕見變異與疾病的關(guān)系看作服從正態(tài)分布的隨機(jī)效應(yīng)，通過檢驗(yàn)隨機(jī)效應(yīng)的方差成分來研究罕見變異與疾病之間的關(guān)聯(lián)，因此能夠有效地避免這個問題[37]。

(1)SKAT方法

Wu等[25]提出的SKAT(sequence kernel association test，SKAT)是一類非常有效的罕見變異關(guān)聯(lián)性分析方法。在線性混合效應(yīng)模型的框架下[38-40]，SKAT采用基于得分函數(shù)(score function)的方差成分檢驗(yàn)來研究罕見變異和疾病之間的關(guān)系，并通過核函數(shù)(kernel function)來量化個體間的遺傳相似性[41-47]。其優(yōu)勢在于，SKAT只需要估計(jì)H0(即一組罕見變異和疾病之間無關(guān)聯(lián)，等價(jià)于隨機(jī)效應(yīng)的方差成分為0)下的模型，此時混合效應(yīng)模型退化為一般的簡單線性模型或logistic回歸模型，因此SKAT在計(jì)算上很有效；在核機(jī)器學(xué)習(xí)(Kernel machine learning)的框架下，通過選擇和構(gòu)造不同的核函數(shù)，研究者能夠分析遺傳位點(diǎn)與疾病之間的復(fù)雜關(guān)聯(lián)(如非線性關(guān)系或位點(diǎn)間交互作用)；另外，能夠通過解析的方式獲得SKAT統(tǒng)計(jì)量的無效分布。最近，類似SKAT的思想被推廣到家系數(shù)據(jù)的罕見遺傳位點(diǎn)關(guān)聯(lián)性分析中[48-52]。

此外，Wu等[25]還證明Neale等[53]提出的C-alpha檢驗(yàn)實(shí)際上是SKAT檢驗(yàn)的一種特殊形式，即SKAT不包含協(xié)變量且表型為疾病狀態(tài)時(如病例-對照研究中反應(yīng)變量為0-1)的情形。

然而，SKAT也存在不足之處：①SKAT統(tǒng)計(jì)量越大并不意味這一組罕見變異的效應(yīng)越大，有可能是因?yàn)楹芏嗳醯男?yīng)[54]；②實(shí)際應(yīng)用中，遺傳學(xué)家和流行病學(xué)家不但關(guān)心罕見變異和疾病之間的P值，還更關(guān)心罕見變異和疾病之間的具體效應(yīng)大小[55-56]；換句話說，他們往往更希望獲得一個定量的指標(biāo)能夠反應(yīng)一組罕見變異對疾病的貢獻(xiàn)；但是，本質(zhì)上SKAT是一種得分檢驗(yàn)[25,40]，僅執(zhí)行假設(shè)檢驗(yàn)而不進(jìn)行參數(shù)估計(jì)，因此不能給出關(guān)于罕見變異對疾病貢獻(xiàn)或效應(yīng)的度量值，實(shí)際工作中無法通過SKAT評價(jià)多組罕見變異對疾病的相對重要性；③因?yàn)镾KAT得分檢驗(yàn)的本質(zhì)，在小樣本和顯著性檢驗(yàn)水平很低的情況下可能會導(dǎo)致保守的結(jié)果[25,57-59]。針對SKAT保守的結(jié)果，最近提出了一些改進(jìn)的措施，如采用數(shù)值調(diào)整或通過permutation和bootstrap方法校正[25,60]。但目前相應(yīng)的校正僅針對病例-對照資料，針對定量數(shù)據(jù)校正方法尚不能得到。

模擬研究顯示，當(dāng)至少大部分罕見變異為關(guān)聯(lián)位點(diǎn)且效應(yīng)方向一致時，負(fù)荷檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)效應(yīng)高于SKAT，但在只有少部分罕見位點(diǎn)為關(guān)聯(lián)位點(diǎn)以及效應(yīng)方向不一致時，SKAT具有明顯的優(yōu)勢。然而，在實(shí)際中無法得知疾病的遺傳模型，因此應(yīng)用中對負(fù)荷檢驗(yàn)和SKAT的最優(yōu)選擇將變得困難。為了解決這個問題，Lee等[60-61]提出在SKAT檢驗(yàn)中納入罕見變異關(guān)系結(jié)構(gòu)的相關(guān)矩陣，稱為SKAT-O(optimal sequence kernel association test)。該相關(guān)矩陣包含一個參數(shù)ρ，當(dāng)ρ=1時SKAT-O退化為負(fù)荷檢驗(yàn)，當(dāng)ρ=0時SKAT-O退化為一般的SKAT。

(2)MiST方法

與SKAT-O的策略不同，Sun等[57]提出的MiST方法(mixed effects score test)直接將在負(fù)荷檢驗(yàn)中合并的變量連同多個罕見變異一起納入統(tǒng)計(jì)模型，然后構(gòu)造兩個獨(dú)立得分檢驗(yàn)，分別檢驗(yàn)合并的變量和罕見變異的方差成分，最后通過Fisher或Tippett合并得到最終聯(lián)合檢驗(yàn)的P值。模擬研究顯示，MiST方法要優(yōu)于SKAT和SKAT-O以及負(fù)荷檢驗(yàn)。研究還發(fā)現(xiàn)，在通過單一的相關(guān)系數(shù)來衡量罕見變異關(guān)系結(jié)構(gòu)的做法(即SKAT-O中的思路)實(shí)際上并非是最優(yōu)的[57]，因?yàn)閷?shí)際單個參數(shù)基本上無法反應(yīng)罕見變異之間的復(fù)雜關(guān)系，這樣做反而會降低統(tǒng)計(jì)效能，即有時候SKAT的效能要高于SKAT-O[57]。

(3)GenRF模型

通過借用在空間統(tǒng)計(jì)中發(fā)展的隨機(jī)場理論(random field theory)，He等[58]和Li等[59]提出了一種新的罕見變異關(guān)聯(lián)分析方法，稱為遺傳隨機(jī)場(genetic random field，GenRF)模型。在GenRF模型中某個具體個體的遺傳表型被當(dāng)做隨機(jī)場在歐幾里得空間中隨機(jī)實(shí)現(xiàn)，并認(rèn)為受剩下其他所有個體的影響，這種影響通過一個非負(fù)的尺度參數(shù)來量化。因此對一組罕見變異關(guān)聯(lián)性的檢驗(yàn)就轉(zhuǎn)化為該尺度參數(shù)的檢驗(yàn)。Li等[59]認(rèn)為GenRF模型可看做一種特殊的Wald檢驗(yàn)。

(4)基于似然的推斷

如前文所述，在混合效應(yīng)模型的框架下罕見變異關(guān)聯(lián)性分析可以轉(zhuǎn)化為對方差成分的假設(shè)檢驗(yàn)。在統(tǒng)計(jì)推斷中，相對于得分檢驗(yàn)(如SKAT、SKAT-O或MiST方法)和Wald檢驗(yàn)(如GenRF模型)，似然比檢驗(yàn)(likelihood ratio test，LRT)和限制性似然比檢驗(yàn)(restricted likelihood ratio test，ReLRT)是另一類十分重要和流行的方法[3,62-65]?；诖耍琙eng等[55-56]最近提出采用LRT和ReLRT執(zhí)行罕見變異關(guān)聯(lián)性分析，LRT和ReLRT統(tǒng)計(jì)量建立在剖面似然函數(shù)(profile log-likelihood)之上，通過抽樣算法獲得統(tǒng)計(jì)量的無效假設(shè)分布[3,55-56]。

模擬研究顯示，LRT和ReLRT一致優(yōu)于SKAT，甚至在罕見變異效應(yīng)方向相同、當(dāng)樣本量比較大時其效能與SKAT-O和負(fù)荷檢驗(yàn)基本一致；此外，LRT和ReLRT還能提供反映一組罕見變異相對重要性的指示統(tǒng)計(jì)量[55-56]。然而，LRT和ReLRT的不足之處在于，要求同時估計(jì)H0和H1條件下的模型，并且依賴模擬算法計(jì)算P值，因此其速度相對較慢。為了提高LRT和ReLRT的計(jì)算速度，我們最近嘗試采用近似混合分布(mixture distribution)，研究顯示該近似分布能夠在維持其高統(tǒng)計(jì)效能的基礎(chǔ)上顯著提高計(jì)算速度。

3.其他方法

雖然近年來針對罕見變異關(guān)聯(lián)性分析的統(tǒng)計(jì)方法層出不窮；然而，在實(shí)際應(yīng)用中有些方法存在明顯的局限或其理論假設(shè)不現(xiàn)實(shí)。例如，Zhan和Xu[54]提出的自適應(yīng)嶺回歸(adaptive ridge regression)被驗(yàn)證不能有效控制I型錯誤，負(fù)荷檢驗(yàn)不能有效處理效應(yīng)方向的問題，Lin和Tang[36]提出的EREC方法以及其他方法如VT檢驗(yàn)[35]、Han和Pan自適應(yīng)檢驗(yàn)[34]、加權(quán)檢驗(yàn)[29]以及Liu和Leal提出的KBAC[67]都要求執(zhí)行permutation程序或Monte Carlo檢驗(yàn)，因此計(jì)算復(fù)雜?；贐ayes等級模型[68]的方法雖然顯示出好的性質(zhì)，但需要通過MCMC迭代抽樣以及評價(jià)Markov鏈?zhǔn)欠袷諗浚瑯泳哂杏?jì)算量大的缺點(diǎn)，實(shí)際應(yīng)用受限。此外，基于維度降低的策略如主成分法也受到重視，Luo等[69]比較了八種罕見變異關(guān)聯(lián)性分析方法(包括CMC、T2和主成分法等)，認(rèn)為功能主成分法(functional principal component analysis)具有較高的效能，但目前功能主成分法與SKAT、似然比檢驗(yàn)之間的相對效能尚不明確。

好的罕見遺傳變異關(guān)聯(lián)性分析統(tǒng)計(jì)方法應(yīng)該具備的特點(diǎn)

我們認(rèn)為一個好的罕見遺傳變異關(guān)聯(lián)性分析統(tǒng)計(jì)方法應(yīng)該具備一些優(yōu)良的性質(zhì)：①能夠有效處理罕見變異效應(yīng)方向性的問題，即需要對異質(zhì)效應(yīng)穩(wěn)健，這也是所有性質(zhì)中最為重要的；②能夠同時考慮協(xié)變量；因?yàn)殛P(guān)聯(lián)研究中可能存在其他協(xié)變量需要校正，如性別、年齡或暴露水平等；另一個重要的情況是人群分層(population stratification)，目前校正人群分層的常規(guī)做法是在分析中納入前幾位的主成分[70]，因此校正協(xié)變量也就變得異常重要[25-26,36]；③考慮到在全基因組或全外顯子規(guī)模上需要執(zhí)行成千上萬次的關(guān)聯(lián)分析，因此需要快速的計(jì)算；我們注意到，通過多核運(yùn)算或并行運(yùn)算等方式以及近似的方法能顯著提高計(jì)算速度；④能夠提供度量一組罕見變異和疾病之間效應(yīng)的客觀指標(biāo)，以及能夠分析疾病和遺傳位點(diǎn)之間的復(fù)雜關(guān)系的指標(biāo)。

事實(shí)上，上面提到的SKAT、MiST、GenRF以及LRT和ReLRT都具備上述大部分性質(zhì)。它們還具有共同的特點(diǎn)：將一組罕見變異關(guān)聯(lián)研究的問題轉(zhuǎn)化為對一個非負(fù)參數(shù)假設(shè)檢驗(yàn)的問題，避免了多元檢驗(yàn)存在的問題，如自由度消耗、多重共線性和效能低等，因此，在罕見變異個數(shù)比較多時仍然有效。

未來的方向

上述罕見變異檢驗(yàn)方法的統(tǒng)計(jì)效能表現(xiàn)主要取決于潛在的模型假設(shè)，總的罕見變異位點(diǎn)個數(shù)、位點(diǎn)效應(yīng)的方向、位點(diǎn)MAF和效應(yīng)之間的關(guān)系以及致病位點(diǎn)在所有位點(diǎn)中的比例。大量的經(jīng)驗(yàn)研究顯示[25-26,71-72]，已經(jīng)發(fā)展的罕見變異關(guān)聯(lián)性研究方法并沒有一種檢驗(yàn)在任何情況下都是最優(yōu)的，即任何情況下總具有最高的檢驗(yàn)效能，雖然有研究者宣傳他們獲得了最優(yōu)(optimal)的檢驗(yàn)方法[36,53,60-61]。

考慮到罕見變異和疾病之間的復(fù)雜關(guān)系，以及現(xiàn)有方法本身效能并不高，因此需要進(jìn)一步建立更加有效的關(guān)聯(lián)性分析方法和統(tǒng)計(jì)分析策略，合理聯(lián)合不同的檢驗(yàn)方法是一種有效的嘗試[57,60-61,73]，這些聯(lián)合檢驗(yàn)方法通常更加穩(wěn)健和高效。然而，也有研究顯示聯(lián)合檢驗(yàn)方法并不總是能夠提高統(tǒng)計(jì)效能[55,57]。

對若干個不同的測序數(shù)據(jù)執(zhí)行Meta分析也是提高統(tǒng)計(jì)效能的一個潛在手段[74-77]。然而，罕見變異Meta分析可能存在的問題包括致病的罕見遺傳位點(diǎn)通常出現(xiàn)在具體的某個人群，不同的人群可能并不共享相同的罕見致病位點(diǎn)[78]。

目前的罕見變異關(guān)聯(lián)性分析方法及其分析策略多主要集中于基因內(nèi)的罕見位點(diǎn)，而忽略常見位點(diǎn)。然而，大量的研究顯示致病遺傳位點(diǎn)的等位基因頻率分布廣范，既有罕見位點(diǎn)，也有低頻位點(diǎn)和常見位點(diǎn)。在實(shí)際應(yīng)用中，如果僅僅局限于罕見變異無疑會導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)效能低下，因此整合外源性信息(包括多平臺遺傳數(shù)據(jù)和環(huán)境數(shù)據(jù))以及聯(lián)合分析常見和罕見位點(diǎn)及其可能的交互作用是十分有必要的[37,79-81]，但相關(guān)的文獻(xiàn)目前還很有限。

雖然已有家系數(shù)據(jù)的罕見變異關(guān)聯(lián)性分析方法，但越來越多的GWAS研究為了了解遺傳因素和疾病的因果關(guān)系而采用隊(duì)列(cohort study)的方式執(zhí)行[82-83]，縱向數(shù)據(jù)(longitudinal data)本身的非獨(dú)立性會使得罕見變異關(guān)聯(lián)性分析變得更加復(fù)雜，因此迫切需要發(fā)展適合縱向測序數(shù)據(jù)的罕見變異關(guān)聯(lián)性統(tǒng)計(jì)方法。

[1]Hindorff L,Sethupathy P,Junkins H,et al.Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2009,106(23):9362-9367.

[2]Visscher P,Brown M,McCarthy M,et al.Five Years of GWAS Discovery.American Journal of Human Genetics,2012,90(1):7-24.

[3]Crainiceanu CM,Ruppert D.Likelihood ratio tests in linear mixed models with one variance component.Journal of the Royal Statistical Society:Series B(Statistical Methodology),2004,66(1):165-185.

[4]Reich DE,Lander ES.On the allelic spectrum of human disease.Trends in Genetics,2001,17(9):502-510.

[5]Hu Z,Shi Y,Mo X,et al.A genome-wide association study identifies two risk loci for congenital heart malformations in Han Chinese populations.Nature Genetics,2013,45(7):818-821.

[6]Wellcome Trust Case Control Consortium.Genome-wide association study of 14,000 cases of seven common diseases and 3,000 shared controls.Nature,2007,447(7145):661-678.

[7]Manolio T,Collins F,Cox N,et al.Finding the missing heritability of complex diseases.Nature,2009,461(7265):747-753.

[8]Eichler EE,Flint J,Gibson G,et al.Missing heritability and strategies for finding the underlying causes of complex disease.Nature Reviews Genetics,2010,11(6):446-450.

[9]Gibson G.Rare and common variants:twenty arguments.Nature reviews Genetics,2012,13(2):135-145.

[10]Pritchard JK.Are rare variants responsible for susceptibility to complex diseases? American Journal of Human Genetics,2001,69(1):124-137.

[11]Carvajal-Carmona LG.Challenges in the identification and use of rare disease-associated predisposition variants.Current Opinion in Genetics and Development,2010,20(3):277-281.

[12]Schork NJ,Murray SS,Frazer KA,et al.Common vs.rare allele hypotheses for complex diseases.Current Opinion in Genetics and Development,2009,19(3):212-219.

[13]Asimit J,Zeggini E.Rare variant association analysis methods for complex traits.Annual Review of Genetics,2010,44:293-308.

[14]Cirulli ET,Goldstein DB.Uncovering the roles of rare variants in common disease through whole-genome sequencing.Nature Reviews Genetics,2010,11(6):415-425.

[15]Bodmer W,Bonilla C.Common and rare variants in multifactorial susceptibility to common diseases.Nature Genetics,2008,40(6):695-701.

[16]Shendure J,Ji H.Next-generation DNA sequencing.Nature Biotechnology,2008,26(10):1135-1145.

[17]Cohen JC,Kiss RS,Pertsemlidis A,et al.Multiple Rare Alleles Contribute to Low Plasma Levels of HDL Cholesterol.Science,2004,305(5685):869-872.

[18]Johansen CT,Wang J,Lanktree MB,et al.Excess of rare variants in genes identified by genome-wide association study of hypertriglyceridemia.Nature Genetics,2010,42(8):684-687.

[19]Romeo S,Pennacchio LA,Fu Y,et al.Population-based resequencing of ANGPTL4 uncovers variations that reduce triglycerides and increase HDL.Nature Genetics,2007,39(4):513-516.

[20]Ji W,Foo J,O’Roak B,et al.Rare independent mutations in renal salt handling genes contribute to blood pressure variation.Nature Genetics,2008,40(1):592-599.

[21]Rivas M,Beaudoin M,Gardet A,et al.Deep resequencing of GWAS loci identifies independent rare variants associated with inflammatory bowel disease.Nature Genetics,2011,43(11):1066-1073.

[22]Gudmundsson J,Sulem P,Gudbjartsson DF,et al.A study based on whole-genome sequencing yields a rare variant at 8q24 associated with prostate cancer.Nature Genetics,2012,44(12):1326-1329.

[23]Maher B.Personal genomes:The case of the missing heritability.Nature,2008,456:18-21.

[24]Bansal V,Libiger O,Torkamani A,et al.Statistical analysis strategies for association studies involving rare variants.Nature Reviews Genetics,2010,11(11):773-785.

[25]Wu MC,Lee S,Cai T,et al.Rare-Variant Association Testing for Sequencing Data with the Sequence Kernel Association Test.American Journal of Human Genetics,2011,89(1):82-93.

[26]Derkach A,Lawless JF,Sun L.Pooled association tests for rare genetic variants:A review and some new results.Statistical Science,2014,29(2):302-321.

[27]Lange K,Papp JC,Sinsheimer JS,et al.Next-Generation Statistical Genetics:Modeling,Penalization,and Optimization in High-Dimensional Data.Annual Review of Statistics and Its Application,2014,1(1):279-300.

[28]Morgenthaler S,Thilly W.A strategy to discover genes that carry multi-allelic or mono-allelic risk for common diseases:a cohort allelic sums test(CAST).Mutation Research,2007,615(1-2):28-56.

[29]Li B,Leal S.Methods for detecting associations with rare variants for common diseases:application to analysis of sequence data.American Journal of Human Genetics,2008,83(3):311-321.

[30]Madsen BE,Browning SR.A Groupwise Association Test for Rare Mutations Using a Weighted Sum Statistic.PLoS Genetics,2009,5(2):e1000384.

[31]Ionita-Laza I,Buxbaum JD,Laird NM,et al.A New Testing Strategy to Identify Rare Variants with Either Risk or Protective Effect on Disease.PLoS Genetics,2011,7(2):e1001289.

[32]Logsdon BA,Dai JY,Auer PL,et al.A Variational Bayes Discrete Mixture Test for Rare Variant Association.Genetic Epidemiology,2014,38(1):21-30.

[33]Pan W,Shen X.Adaptive tests for association analysis of rare variants.Genetic Epidemiology,2011,35(5):381-388.

[34]Han F,Pan W.A data-adaptive sum test for disease association with multiple common or rare variants.Human Heredity,2010,70(1):42-54.

[35]Price AL,Kryukov GV,de Bakker PI,et al.Pooled association tests for rare variants in exon-resequencing studies.American Journal of Human Genetics,2010,86(6):832-838.

[36]Lin D,Tang Z.A General Framework for Detecting Disease Associations with Rare Variants in Sequencing Studies.American Journal of Human Genetics,2011,89(3):354-367.

[37]Lee S,Abecasis Goncalo R,Boehnke M,et al.Rare-Variant Association Analysis:Study Designs and Statistical Tests.American Journal of Human Genetics,2014,95(1):5-23.

[38]Laird NM,Ware JH.Random-effects models for longitudinal data.Biometrics,1982,38(4):963-974.

[39]Breslow N,Clayton D.Approximate inference in generalized linear mixed models.J Am Stat Assoc,1993,88(421):9-25.

[40]Lin X.Variance component testing in generalised linear models with random effects.Biometrika,1997,84(2):309-326.

[41]Schaid DJ.Genomic Similarity and Kernel Methods I:Advancements by Building on Mathematical and Statistical Foundations.Human Heredity,2010,70(2):109-131.

[42]Hofmann T,Sch?lkopf B,Smola AJ.Kernel methods in machine learning.Annals of Statistics,2008,36(3):1171-1220.

[43]Hastie T,Tibshirani R,Friedman J.The Elements of Statistical learning:Data Mining,Inference,and Prediction,2 nd edition.New York:Springer,2009.

[44]Cristianini N,Shawe-Taylor J.An introduction to support vector machines and other kernel-based learning methods.New York:Cambridge University Press,2000.

[45]Sch?lkopf B,Smola A.Learning with Kernels:Support Vector Machines,Regularization,Optimization,and Beyond.Cambridge:The MIT Press,2001.

[46]Shawe-Taylor J,Cristianini N.Kernel methods for pattern analysis.New York:Cambridge University Press,2004.

[47]G?nen M,Alpaydin E.Multiple kernel learning algorithms.Journal of Machine Learning Research,2011,12:2211-2268.

[48]Schifano ED,Epstein MP,Bielak LF,et al.SNP Set Association Analysis for Familial Data.Genetic Epidemiology,2012,36(8):797-810.

[49]Chen H,Meigs JB,Dupuis J.Sequence kernel association test for quantitative traits in family samples.Genetic Epidemiology,2013,37(2):196-204.

[50]Oualkacha K,Dastani Z,Li R,et al.Adjusted Sequence Kernel Association Test for Rare Variants Controlling for Cryptic and Family Relatedness.Genetic Epidemiology,2013,37(4):366-376.

[51]Svishcheva GR,Belonogova NM,Axenovich TI.FFBSKAT:Fast Family-Based Sequence Kernel Association Test.PLoS ONE,2014,9(6):e99407.

[52]Chen H,Malzahn D,Balliu B,et al.Testing Genetic Association With Rare and Common Variants in Family Data.Genetic Epidemiology,2014,38(S1):S37-S43.

[53]Neale BM,Rivas MA,Voight BF,et al.Testing for an Unusual Distribution of Rare Variants.PLoS Genetics,2011,7(3):e1001322.

[54]Zhan H,Xu S.Adaptive Ridge Regression for Rare Variant Detection.PLoS ONE,2012,7(8):e44173.

[55]Zeng P,Zhao Y,Liu J,et al.Likelihood Ratio Tests in Rare Variant Detection for Continuous Phenotypes.Annals of Human Genetics,2014,78(5):320-332.

[56]Zeng P,Zhao Y,Zhang L,et al.Rare Variants Detection with Kernel Machine Learning Based on Likelihood Ratio Test.PLoS ONE,2014,9(3):e93355.

[57]Sun J,Zheng Y,Hsu L.A Unified Mixed-Effects Model for Rare-Variant Association in Sequencing Studies.Genetic Epidemiology,2013,37(4):334-344.

[58]He Z,Zhang M,Zhan X,et al.Modeling and testing for joint association using a genetic random field model.Biometrics,2014,70(3):471-479.

[59]Li M,He Z,Zhang M,et al.A Generalized Genetic Random Field Method for the Genetic Association Analysis of Sequencing Data.Genetic Epidemiology,2014,38(3):242-253.

[60]Lee S,Emond MJ,Bamshad MJ,et al.Optimal Unified Approach for Rare-Variant Association Testing with Application to Small-Sample Case-Control Whole-Exome Sequencing Studies.American Journal of Human Genetics,2012,91(2):224-237.

[61]Lee S,Wu MC,Lin X.Optimal tests for rare variant effects in sequencing association studies.Biostatistics,2012,13(4):762-775.

[62]Self SG,Liang KY.Asymptotic Properties of Maximum Likelihood Estimators and Likelihood Ratio Tests under Nonstandard Conditions.J Roy Stat Soc,B,1987,82(398):605-610.

[63]Stram DO,Lee JW.Variance Components Testing in the Longitudinal Mixed Effects Model.Biometrics,1994,50(4):1171-1177.

[64]Liang KY,Self SG.On the Asymptotic Behaviour of the Pseudolikelihood Ratio Test Statistic.Journal of the Royal Statistical Society:Series B(Statistical Methodology),1996,58(4):785-796.

[65]Greven S,Crainiceanu CM,Küchenhoff H,et al.Restricted Likelihood Ratio Testing for Zero Variance Components in Linear Mixed Models.Journal of Computational and Graphical Statistics,2008,17(4):870-891.

[66]Lippert C,Xiang J,Horta D,et al.Greater power and computational efficiency for kernel-based association testing of sets of genetic variants.Bioinfor matics,2014,30(22):3206-3214.

[67]Liu D,Leal S.A novel adaptive method for the analysis of next-generation sequencing data to detect complex trait associating with rare variants due to gene main effects and interactions.PLoS Genetics,2010,6:e1001156.

[68]Yi N,Liu N,Zhi D,et al.Hierarchical Generalized Linear Models for Multiple Groups of Rare and Common Variants:Jointly Estimating Group and Individual-Variant Effects.PLoS Genetics,2011,7(12):e1002382.

[69]Luo L,Boerwinkle E,Xiong M.Association studies for next-generation sequencing.Genome Research,2011,21:1099 - 1108.

[70]Price AL,Patterson NJ,Plenge RM,et al.Principal components analysis corrects for stratification in genome-wide association studies.Nature Genetics,2006,38(8):904-909.

[71]Basu S,Pan W.Comparison of statistical tests for disease association with rare variants.Genetic Epidemiology,2011,35(7):606-619.

[72]Ladouceur M,Dastani Z,Aulchenko YS,et al.The Empirical Power of Rare Variant Association Methods:Results from Sanger Sequencing in 1,998 Individuals.PLoS Genetics,2012,8(2):e1002496.

[73]Derkach A,Lawless JF,Sun L.Robust and Powerful Tests for Rare Variants Using Fisher’s Method to Combine Evidence of Association From Two or More Complementary Tests.Genetic Epidemiology,2013,37(1):110-121.

[74]Evangelou E,Ioannidis JPA.Meta-analysis methods for genome-wide association studies and beyond.Nature reviews Genetics,2013,14(6):379-389.

[75]Hu YJ,Berndt SI,Gustafsson S,et al.Meta-analysis of gene-level associations for rare variants based on single-variant statistics.American Journal of Human Genetics,2013,93(2):236-248.

[76]Liu DJ,Peloso GM,Zhan X,et al.Meta-analysis of gene-level tests for rare variant association.Nature Genetics,2014,46(2):200-204.

[77]Lee S,Teslovich TM,Boehnke M,et al.General framework for meta-analysis of rare variants in sequencing association studies.American Journal of Human Genetics,2013,93(1):42-53.

[78]Moutsianas L,Morris AP.Methodology for the analysis of rare genetic variation in genome-wide association and re-sequencing studies of complex human traits.Brief Funct Genomics,2014.

[79]Wang X,Epstein MP,Tzeng J.Analysis of Gene-Gene Interactions Using Gene-Trait Similarity Regression.Human Heredity,2014,78(1):17-26.

[80]Larson NB,Schaid DJ.A Kernel Regression Approach to Gene-Gene Interaction Detection for Case-Control Studies.Genetic Epidemiology,2013,37(7):695-703.

[81]Ionita-Laza I,Lee S,Makarov V,et al.Sequence Kernel Association Tests for the Combined Effect of Rare and Common Variants.American Journal of Human Genetics,2013,92(6):841-853.

[82]Fan R,Zhang Y,Albert PS,et al.Longitudinal Association Analysis of Quantitative Traits.Genetic Epidemiology,2012,36(8):856-869.

[83]Furlotte NA,Eskin E,Eyheramendy S.Genome-Wide Association Mapping With Longitudinal Data.Genetic Epidemiology,2012,36(5):463-471.

(責(zé)任編輯：郭海強(qiáng))

*：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81473070，81373102，81402765)；國家統(tǒng)計(jì)局全國統(tǒng)計(jì)科學(xué)研究項(xiàng)目(2014LY112)；江蘇省教育廳高校哲學(xué)社會科學(xué)研究基金項(xiàng)目(2013SJD790032，2013SJB790059)；江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(CXLX13_574)；南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目和優(yōu)秀博士論文培育項(xiàng)目

1.南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院生物統(tǒng)計(jì)學(xué)系(210029)

2.徐州醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室(221004)

△通信作者：陳峰，E-mail：fengchen@njmu.edu.cn