軟腐菌識(shí)別侵染魔芋根部影響因子的研究

吳金平，矯振彪，陳磊夫，焦忠久，邱正明

摘要：魔芋（Amorphophallus Konjac）軟腐病頻發(fā)已成為制約魔芋種植業(yè)發(fā)展的瓶頸。目前對(duì)其病原、發(fā)病規(guī)律及防治方法等進(jìn)行了一些研究，加深了對(duì)魔芋軟腐病的認(rèn)識(shí)，取得了一定進(jìn)展，但對(duì)魔芋軟腐病的侵染和發(fā)病機(jī)制缺乏系統(tǒng)而深入的研究。通過(guò)測(cè)定軟腐菌（Pectobacterium carotovora subsp.carotovora）在魔芋根表吸附量和根部侵入量，研究不同溫度、pH、接種濃度、LPS和EPS對(duì)軟腐菌在魔芋苗根部吸附和侵入過(guò)程的影響。結(jié)果表明，軟腐菌在魔芋苗根部吸附侵入的最適溫度條件是30 ℃、pH 6.0，隨接種濃度增加吸附和侵入量增加;菌體LPS是魔芋軟腐歐文氏菌對(duì)寄主根表的吸附所不可缺少的成分，而EPS預(yù)處理對(duì)吸附侵入量影響較小。本研究明確不同外界因子（溫度、pH、接種濃度）和細(xì)菌識(shí)別子（EPS和LPS）在軟腐菌吸附識(shí)別魔芋根際中的作用，從源頭上了解軟腐菌對(duì)魔芋根系的侵染機(jī)制，為研究病害循環(huán)和制訂防治策略提供新的啟示，從根本上有效控制魔芋病害的發(fā)生，并為魔芋的抗病育種提供新思路。

關(guān)鍵詞：魔芋（Amorphophallus Konjac）;軟腐菌（Pectobacterium carotovora subsp.carotovora）;吸附;侵入

中圖分類(lèi)號(hào)：S792.39 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2014）23-5734-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.027

魔芋（Amorphophallus Konjac）是自然界中唯一高含葡甘聚糖的特種經(jīng)濟(jì)作物，其在食品、醫(yī)藥保健、工業(yè)材料等方面用途廣泛[1]。隨著加工產(chǎn)業(yè)的快速壯大，其種植面積也迅速擴(kuò)大，據(jù)2013年中國(guó)魔芋產(chǎn)業(yè)發(fā)展研討會(huì)統(tǒng)計(jì)，2013年全國(guó)魔芋種植面積已達(dá) 169.31 萬(wàn)畝。但在魔芋種植過(guò)程中，魔芋軟腐病病原為軟腐菌（Pectobacterium carotovora subsp.carotovora），一般減產(chǎn)20%～30%，嚴(yán)重的達(dá)80%，甚至絕收[2]。

自二十世紀(jì)八十年代發(fā)現(xiàn)魔芋軟腐病以來(lái)，對(duì)其病原、發(fā)病規(guī)律及防治方法等進(jìn)行了一些研究，加深了對(duì)軟腐病的認(rèn)識(shí)，取得了一定進(jìn)展，但對(duì)魔芋軟腐病的侵染和發(fā)病機(jī)制缺乏系統(tǒng)而深入的研究。很多學(xué)者根據(jù)軟腐病菌的侵染特性，認(rèn)為魔芋軟腐病病原菌是從自然孔口和傷口侵入。Wu等[3]研究發(fā)現(xiàn)，在魔芋軟腐病系統(tǒng)中，軟腐菌可以通過(guò)魔芋根系的吸附侵入，導(dǎo)致病害的發(fā)生。

病原細(xì)菌與寄主植物在根系的相互作用包括一系列的連續(xù)反應(yīng)，由接觸、吸附到定殖及其間的相互識(shí)別，然后侵人并潛伏，最后導(dǎo)致寄主發(fā)病[4]。因此，研究軟腐病如何識(shí)別、吸附、侵染根系的機(jī)理，對(duì)確定生產(chǎn)中防治重點(diǎn)有重要意義。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

Pectobacterium carotovora subsp.carotovora為湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所實(shí)驗(yàn)室保存（Genbank注冊(cè)號(hào)FJ463871）。魔芋組培苗由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所實(shí)驗(yàn)室提供，高度6～8 cm，生根15～20 d，根長(zhǎng)約2 cm。

1.2 ?試驗(yàn)方法

1.2.1 ?菌種制備 ?將供試菌株在NA培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)24 h，用無(wú)菌水配制成細(xì)菌懸浮液，稀釋平板計(jì)數(shù)，備用。

1.2.2 ?不同溫度條件下軟腐菌在魔芋根表吸附量和根部侵入量測(cè)定 取配好的濃度為6×107個(gè)/mL細(xì)菌懸浮液50 mL裝入250 mL培養(yǎng)瓶中，分別置于15、20、25、30、35℃的光照培養(yǎng)箱內(nèi)，待菌懸液的溫度與培養(yǎng)箱內(nèi)溫度一致后，將魔芋苗放入其中，根部完全浸沒(méi)到懸浮液中，每組處理3棵魔芋苗，在浸根接種后0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 h分別剪取幼根，測(cè)定不同溫度條件下軟腐菌根表吸附量和根部侵入量。設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均值，利用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.2.3 ?不同pH條件下軟腐菌在魔芋根表吸附量和根部侵入量測(cè)定 ?用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH將無(wú)菌水pH調(diào)節(jié)為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，分別配制成濃度為6×107個(gè)/mL的細(xì)菌懸浮液，然后取50 mL相應(yīng)值的細(xì)菌懸浮液放入250 mL培養(yǎng)瓶中，將魔芋苗放入其中，根部完全浸沒(méi)到懸浮液中，每組處理3棵魔芋苗，置于30 ℃的光照培養(yǎng)箱內(nèi)，在浸根接種后0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 h分別剪取幼根，測(cè)定不同pH條件下軟腐菌根表吸附量和根部侵入量。設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均值，利用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.2.4 ?不同接種濃度下軟腐菌在魔芋根表吸附量和根部侵入量測(cè)定 ?用無(wú)菌水分別配制濃度為6×104、6×105、6×106、6×107、6×108個(gè)/mL的細(xì)菌懸浮液，取50 mL相應(yīng)值的細(xì)菌懸浮液放入250 mL培養(yǎng)瓶中，將魔芋苗放入其中，根部完全浸沒(méi)到懸浮液中，每個(gè)處理3棵魔芋苗，置于30 ℃的光照培養(yǎng)箱內(nèi)，在浸根接種后0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 h分別剪取幼根，測(cè)定不同接種濃度條件下軟腐菌根表吸附量和根部侵入量。設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均值，利用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.2.5 ?LPS和EPS的吸附和抑制試驗(yàn) ?取6×108個(gè)/mL濃度細(xì)菌懸浮液1 mL加入1 000 mL NA液體培養(yǎng)基，在30 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)18 h，按Baker 等的酚水法提取LPS[5]。按Husain酒精沉淀法提取EPS[6]。參照董漢松等[7]的方法，用LPS和EPS分別對(duì)幼苗進(jìn)行浸根處理，以無(wú)菌水作為對(duì)照，30 ℃條件下，30 min 后用pH 7.0細(xì)菌懸浮液（6×108個(gè)/mL） 接種，以不做預(yù)處理的接種為對(duì)照。30 ℃ 測(cè)定幼苗接種1 h 和6 h 后軟腐菌對(duì)根表吸附量和根部侵入量。設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均值，利用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.2.6 ?EPS和LPS對(duì)菌體的吸附和抑制試驗(yàn) ?無(wú)EPS和無(wú)EPS及LPS菌體懸浮液制備參考董漢松等[7]的方法。分別用濃度為6×108個(gè)/mL無(wú)EPS及無(wú)EPS及LPS的細(xì)菌懸浮液處理魔芋苗，以未處理6×108個(gè)/mL的細(xì)菌懸浮液處理魔芋苗。30 ℃ 測(cè)定幼苗接種1 h 和6 h 后軟腐菌對(duì)根表吸附量和根部侵入量。設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均值，利用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.2.7 ?根表吸附量和根部侵入量測(cè)定方法及根表吸附量測(cè)定[8] ?每株每次剪取1條幼根，距離幼根末端約2 cm，將截取的根尖浸入5 mL無(wú)菌水中，滌蕩1 min后，取出根尖，用滅菌濾紙吸干外表水分，稱(chēng)質(zhì)量，用稀釋平板法統(tǒng)計(jì)懸浮液中的細(xì)菌數(shù)量，即為軟腐菌的根表吸附量。根部侵入量測(cè)定[8]：將稱(chēng)重后的根尖放入5 mL無(wú)菌水中，磨碎，用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)懸浮液中的細(xì)菌數(shù)量，即為軟腐菌的根部侵入量，計(jì)算公式為：吸附或侵入量（個(gè)/g鮮質(zhì)量）=細(xì)菌濃度（個(gè)/mL）×分離用水量（mL）/根質(zhì)量（g鮮質(zhì)量）。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?溫度對(duì)軟腐菌在魔芋苗根部吸附侵入的影響

由圖1和圖2可知，在整個(gè)溫度梯度中，隨溫度升高，根部吸附侵入量逐漸增高，當(dāng)溫度升至30 ℃時(shí)，根部吸附和侵入量最高，35 ℃時(shí)根部吸附和侵入量逐漸降低，這可能因?yàn)檐浉淖钸m生長(zhǎng)溫度為28 ℃，高溫抑制了病菌的生長(zhǎng)，所以根部吸附侵入量降低。在所有溫度梯度范圍內(nèi)，菌株的吸附侵入量都隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)。方差分析表明，不同溫度下軟腐菌在魔芋根部吸附侵入有極顯著差異（P<0.01）。

2.2 ?pH對(duì)軟腐菌在魔芋苗根部吸附侵入的影響

從圖3和圖4可以看出，pH 6.0時(shí)，魔芋苗根部吸附侵入軟腐病病量均最高，這可能是因?yàn)槟в筌浉钸m生長(zhǎng)pH為6.0～6.5。對(duì)在不同pH條件下的魔芋苗根部吸附侵入軟腐病病量進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，不同pH值條件下菌株在魔芋根部吸附侵入軟腐病量都具有極顯著影響（P=0.0001<0.01）。

2.3 ?不同接種濃度對(duì)軟腐菌在魔芋苗根部吸附侵入的影響

不同接種濃度條件下軟腐菌在魔芋苗根部吸附侵入量由圖5和圖6可知，隨著接種濃度的增加，軟腐菌吸附侵入量也增加，對(duì)菌株在不同接種濃度時(shí)的根部吸附侵入量進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，不同接種濃度下軟腐菌在魔芋根部吸附侵入量具有極顯著差異（P=0.0001<0.01）。

2.4 ?軟腐病菌LPS和EPS對(duì)病菌的吸附抑制效應(yīng)

LPS和EPS預(yù)處理魔芋根系對(duì)隨后接種菌吸附侵入量的影響如表1所示，LPS對(duì)軟腐菌的根表吸附和根部侵入都有一定的抑制作用，使其根表吸附量和根部侵入量都有不同程度的下降;但EPS對(duì)寄主根系預(yù)處理后，對(duì)接種菌并無(wú)明顯的吸附抑制或增強(qiáng)效應(yīng)。

2.5 ?洗去EPS及洗去EPS和LPS的菌體對(duì)魔芋根部的吸附侵入量

從表2可以看出，洗去EPS/LPS的軟腐菌菌體對(duì)魔芋根部的吸附侵入量比洗去EPS高，洗去EPS/LPS和洗去 EPS的軟腐菌菌體對(duì)魔芋根部的吸附侵入量比菌液處理的低。

3 ?小結(jié)與討論

軟腐菌體對(duì)魔芋根部的吸附侵入量隨時(shí)間的延長(zhǎng)菌量增加，本試驗(yàn)只做了6 h，主要是因?yàn)檐浉虏×軓?qiáng)，而實(shí)驗(yàn)材料為幼嫩的魔芋組培苗根部，8 h根部感覺(jué)有軟腐癥狀了，12 h整個(gè)根部軟腐。

軟腐菌體對(duì)魔芋根部的吸附侵入量的最適溫度為30 ℃，最適pH 6.0，這和魔芋軟腐病菌的生物學(xué)特性一致[9]。在其生長(zhǎng)最適條件下，吸附侵入能力最強(qiáng)。因此，在軟腐病綜合防治中，利用高山氣候或者遮陰作為套種，降低溫度，通過(guò)調(diào)節(jié)種植地土壤pH，可以有效減慢軟腐病菌的侵染速度，減輕病害危害。但隨著時(shí)間的推移，魔芋的根系可對(duì)病菌發(fā)生富集作用，使病菌種群數(shù)量增高而達(dá)到侵人所需的量。由于根系的富集作用，軟腐菌隨時(shí)間的延長(zhǎng)菌量增加而達(dá)到侵入所需的量[10]。因此，以上綜合防治只能延緩病害的發(fā)生，并不能解決病害問(wèn)題。

通過(guò)LPS和EPS預(yù)處理魔芋根系對(duì)隨后接種菌吸附侵入量的影響研究可以看出，用LPS處理吸附侵入量都有所降低，而EPS預(yù)處理對(duì)吸附侵入量影響較小，菌體LPS是魔芋軟腐歐文氏菌對(duì)寄主根表的吸附所不可缺少的成分。鑒于LPS在軟腐病菌體接觸識(shí)別魔芋根系所表現(xiàn)出來(lái)的抑制作用，以從化合物直接利用和基因工程菌株利用途徑進(jìn)行軟腐病防治，如可借分子遺傳學(xué)方法把接觸識(shí)別改造為病害控制所用，或獲得病菌吸附缺陷型工程菌株，病菌LPS作為congon的作用，從理論上講，一旦施于根表生態(tài)，可以占據(jù)識(shí)別位點(diǎn)而阻止病菌侵人，但這取決于在根表的分布特性、產(chǎn)生和施用技術(shù)及經(jīng)濟(jì)效益等多因素。

通過(guò)本研究，明確不同外界因子（溫度、pH、接種濃度）和細(xì)菌識(shí)別因子（EPS和LPS）在軟腐菌吸附識(shí)別魔芋根際中的作用，從源頭上了解軟腐菌對(duì)魔芋根系的侵染機(jī)制，為研究病害循環(huán)和制訂防治策略提供新的啟示，為有效控制魔芋病害的發(fā)生和魔芋的抗病育種提供新思路。

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