高產(chǎn)DHA裂壺藻突變株的選育

呂小義，付杰，尹佳，田華，陳濤，何東平*

（1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢430023；2.中國科學(xué)院武漢病毒研究所，湖北武漢430071）

高產(chǎn)DHA裂壺藻突變株的選育

呂小義1，付杰1，尹佳1，田華1，陳濤2，何東平1*

（1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢430023；2.中國科學(xué)院武漢病毒研究所，湖北武漢430071）

利用60Co-γ射線輻照誘變裂壺藻（Schizochytrium limacinum）ATCC20888，以平板生長情況、生物量、含油率和二十二碳六稀酸（DHA）產(chǎn)量為綜合指標(biāo)，最終選育出一株高產(chǎn)突變株，命名為1.6-7-1，其搖瓶發(fā)酵生物量為47.37 g/L，油脂含量為31.41%，DHA產(chǎn)量為5.65 g/L，且DHA產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高了約40%，經(jīng)連續(xù)5代發(fā)酵培養(yǎng)，其遺傳性能穩(wěn)定。

60Co-γ射線；裂壺藻；二十二碳六烯酸

自世界衛(wèi)生組織正式推薦嬰幼兒生長發(fā)育的早期階段要及時補充二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA），其就以其獨特的生理功能愈發(fā)成為人們關(guān)注的焦點[1-3]。近年來，DHA行業(yè)迅猛發(fā)展，產(chǎn)量逐年上升。因此開發(fā)高效低廉的DHA生產(chǎn)工藝不僅有助于改善目前DHA研發(fā)生產(chǎn)現(xiàn)狀，更可以推廣至其他多不飽和脂肪酸類產(chǎn)品的開發(fā)[4-7]。

DHA俗稱腦黃金，是一種對人體非常重要的多不飽和脂肪酸，因其含有6個不飽和烯鍵的特有結(jié)構(gòu)，使它具有獨特的生理功能和經(jīng)濟價值，對人類健康有著特殊的作用和影響[8-9]。

裂壺藻（Schizochytrium limacinum）又稱裂殖壺菌，是一類富含DHA的海洋藻類，因其生長速度快、易于培養(yǎng)、細(xì)胞內(nèi)脂肪酸組成簡單易于提純等優(yōu)勢，被認(rèn)為是一種極具潛力的DHA新來源[10-13]。

美國Martek公司在微生物發(fā)酵生產(chǎn)DHA領(lǐng)域進行了深入研究，將裂壺藻發(fā)酵生物量提高至200 g/L，DHA產(chǎn)量提升至40 g/L，居世界領(lǐng)先水平。近年來國內(nèi)高校對裂壺藻發(fā)酵產(chǎn)DHA也開展了研究，并取得一定進展，但產(chǎn)量和質(zhì)量均較國外尚有一定差距，不能夠滿足巨大的市場需求。

本研究以裂壺藻（Schizochytrium limacinum）ATCC 20888為出發(fā)菌株，利用60Co-γ射線對其進行輻照誘變，篩選出最優(yōu)突變株[14]，用以改善生長培養(yǎng)條件，增加生物量，累積較多的油脂和DHA，用以達到工業(yè)生產(chǎn)的目的[15-17]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

裂壺藻（Schizochytrium limacinum）ATCC20888：廣東微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

平板與斜面培養(yǎng)基：葡萄糖50 g/L，谷氨酸鈉30 g/L，酵母膏6 g/L，NaCl 8 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO46 g/L，金屬離子混合液2 mL。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖85 g/L，谷氨酸鈉60 g/L，酵母膏6 g/L，NaCl 20 g/L，KH2PO46 g/L，MgSO422 g/L，Na2SO40.3 g/L，金屬離子混合液2 mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖75 g/L，谷氨酸鈉15 g/L、酵母膏6g/L、NaCl2.4g/L，KH2PO44.8g/L，MgSO46g/L，KCl0.4g/L，金屬離子混合液2.8 mL。

1.1.3 化學(xué)試劑

葡萄糖、碳酸氫鈉、硫酸鈉：天津博迪化工股份有限公司；酵母膏：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；磷酸二氫鉀：天津凱通化學(xué)試劑有限公司；堿性蛋白酶（20萬U/g）、纖維素酶（5萬U/g）：江蘇銳陽生物科技有限公司；實驗所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 7890A氣相色譜儀：安捷倫科技（中國）有限公司；SPX-150C恒溫恒濕箱、9070MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-1F單人雙面凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；YM75立式壓力蒸汽滅菌器：上海三申醫(yī)療器械有限公司；RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；HYQ-150S全溫?fù)u床：武漢匯誠生物科技有限公司；GZX-XB-K-25血球計數(shù)板：鹽城市榮康玻璃儀器有限公司；60Co-γ輻照源：湖北省農(nóng)科院輻照中心。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將菌種轉(zhuǎn)接至富集培基上，于26℃條件下恒溫靜置培養(yǎng)2～3 d。菌種經(jīng)富集后，在分離平板上劃線分離，26℃恒溫培養(yǎng)，經(jīng)多次分離獲得裂壺藻單菌落菌株。挑選純的單菌落作為活化種子轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)。

1.3.2 種子培養(yǎng)

從平板中純的單菌落處挑取一環(huán)，轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基中，置于搖床上26℃、180 r/min條件下培養(yǎng)48 h。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)

將種子液按10%的接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，26℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)4～5 d。

1.3.4 制備待誘變懸浮液

從活化后的裂壺藻種子中挑選出菌落較大、較純，生長較快的進行鏡檢，選擇細(xì)胞較大，特征典型的經(jīng)種子培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)期。離心去除上清液，用無菌生理鹽水制成懸浮液，血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度在107～109CFU/mL，待誘變處理。

1.3.560Co-γ輻照誘變

取12支滅菌過的試管，每管分別裝入上述懸浮液5 mL。每3個為一組，共分為4組，在湖北省農(nóng)科院輻照中心進行60Co-γ射線輻照，各組劑量分別為0.4 kGy、0.8 kGy、1.2 kGy、1.6 kGy，剩下的原懸浮液作為對照組。菌株致死率計算公式如下：

式中：A為未經(jīng)誘變平板上的菌落數(shù)，CFU；B為經(jīng)過誘變后平板上的菌落數(shù)，CFU。

1.3.6 突變株的篩選

經(jīng)過誘變處理的懸浮液經(jīng)適量稀釋平板涂布，26℃培養(yǎng)3 d，觀察菌落長勢、大小并記錄菌落數(shù)。挑選形態(tài)大，表面光滑的單菌落進行初篩，然后對初篩得到的菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中復(fù)篩，26℃、180 r/min培養(yǎng)5 d，檢測其生物量、油脂含量、DHA產(chǎn)量，保存產(chǎn)量較高的菌種。

1.3.7 突變株遺傳穩(wěn)定性測試

將復(fù)篩得到的突變株連續(xù)傳至5代，再對其進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，測定生物量、含油量和DHA產(chǎn)量并與初代進行比較，觀察其遺產(chǎn)穩(wěn)定性。

1.3.8 生物量的測定

裂壺藻的生物量以收集的菌體細(xì)胞干質(zhì)量計。取一定體積的培養(yǎng)液裝入預(yù)先稱質(zhì)量的離心管中，5 000 r/min離心20 min，沉淀用蒸餾水清洗3次，置于干燥箱中，60℃條件下烘干至質(zhì)量恒定，稱質(zhì)量。生物量的計算公式如下：

1.3.9 油脂的提取及DHA含量測定

藻油的提取：將離心洗滌得到的藻泥與水按料液比1∶1（g∶mL）混合，用堿性蛋白酶0.5%和纖維素酶0.025%在60℃條件下酶解6 h，真空冷凍干燥至質(zhì)量恒定，研磨成藻粉，用乙醚索氏抽提至菌體至無色，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)殘留溶劑，置于烘箱干燥至兩次質(zhì)量變化＜0.2 mg，計算油脂質(zhì)量。油脂產(chǎn)量及含油率的計算公式如下：

DHA含量檢測：取0.1 g藻油，加1 mL苯-石油醚體積比為1∶1的混合溶劑，再加1 mL 0.4 mol/L的KOH-CH3OH溶液，搖勻，在室溫條件下靜置8～10 min，然后加蒸餾水使醚層升至瓶頸部，待液層澄清后，經(jīng)氣相色譜分析得到DHA相對含量。DHA產(chǎn)量計算公式如下：

DHA產(chǎn)量（g/L）=油脂產(chǎn)量（g/L）×DHA含量（%）

1.3.10 氣相色譜分析條件

色譜柱：Agilent SP-2560（100 m×25 μm，0.2 μm）；升溫程序：100℃保持4 min，以3℃/min升溫至230℃，保持20 min，載氣（N2）流速25 mL/min，壓力2.4 kPa，進樣量1 μL；分流比15∶1。

2 結(jié)果與分析

2.160Co-γ射線輻照對裂壺藻ATCC20888的致死效應(yīng)

裂壺藻ATCC20888經(jīng)過不同劑量的輻照處理后，劑量與裂壺藻致死率之間的關(guān)系如圖1所示。由圖1可知，不同劑量對ATCC20888菌株均有致死效應(yīng)，且致死率與60Co-γ射線輻照劑量在一定范圍內(nèi)成正相關(guān)，劑量越大，菌株致死率越高。當(dāng)輻照劑量為0.8kGy時，致死率為98.76%，輻射劑量為1.6 kGy時，致死率為99.985%。

2.2 初篩

挑取4個輻照處理組中直徑較大的菌落，每組選20個，共80個單菌落，每個菌落劃2個平板，共160個平板。置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d。

在以上160個平板中挑選生長快速、無污染、單菌落多且直徑大的平板，在其中挑選出40個單菌落平板劃線，分別命名為0.4-1～0.4-10、0.8-1～0.8-10、1.2-1～1.2-10、1.6-1～1.6-10置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d。通過比較菌落大小，形狀、顏色、透明度、鏡檢細(xì)胞大小、污染度、生物學(xué)特征等指標(biāo)，篩選出24單株。其中包括0.4 kGy 4株，0.8 kGy 6株，1.2 kGy 5株，1.6 kGy 9株。

將以上挑選出的24單株各取一環(huán)接入裝有5 mL液體培養(yǎng)基的試管中，每株接入3管，共72個試管，置于搖床上，26℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)7 d后進行涂片、蘇丹黑B染色、顯微鏡鏡檢。根據(jù)污染與否、細(xì)胞大小、培養(yǎng)液澄清度、油脂積累量等綜合指標(biāo)篩選出較好的24株，其中包括0.4 kGy處理組4株，0.8 kGy處理組6株，1.2 kGy處理組4株，1.6 kGy處理組10株。準(zhǔn)備復(fù)篩。

2.3 搖瓶復(fù)篩

2.3.1 第一輪復(fù)篩

將初篩得到的24株突變菌株和1株出發(fā)株分三個批次分別經(jīng)種子培養(yǎng)后，以10%接種量轉(zhuǎn)接于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，置于搖床上，在26℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)5 d。放瓶后每株分別取樣進行涂片和蘇丹黑B染色鏡檢。每株菌株的發(fā)酵液在40～55℃條件下烘干至質(zhì)量恒定，測定干質(zhì)量。其結(jié)果見表1。

由表1可知，經(jīng)誘變后的24株突變株與出發(fā)株相比，其平均生物量大部分都有小幅度提升。根據(jù)24株突變株的生長發(fā)育情況、蘇丹黑B染色鏡檢結(jié)果及生物量等指標(biāo)，與出發(fā)株相比篩選出較好的7株（0.4-7-2、0.4-9-1、0.8-6-2、1.2-5-1、1.6-1-1、1.6-7-1、1.6-9-3）進行下一輪的篩選。

2.3.2 第二輪復(fù)篩

將上輪篩選出的7株突變株與出發(fā)菌株經(jīng)種子培養(yǎng)、搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)5 d，取樣涂片和蘇丹黑B染色鏡檢、以生物量、油脂含量、DHA產(chǎn)量為指標(biāo)篩選最優(yōu)突變株。結(jié)果（表2）可知，1.6 kGy劑量下有2株突變株其DHA產(chǎn)量超過5 g/L，可以猜想高劑量的輻照強度對正突變有利。經(jīng)各項指標(biāo)比較分析，選出3株較優(yōu)菌株分別為0.8-6-2、1.6-7-1、1.6-9-3。

2.3.3 第三輪復(fù)篩

第三輪復(fù)篩結(jié)果見表3。由表3可知，突變株1.6-7-1其各項指標(biāo)都優(yōu)于出發(fā)株和其他突變株。經(jīng)過幾輪篩選，選出最優(yōu)突變株1.6-7-1，其生物量為47.37 g/L，DHA產(chǎn)量為5.65 g/L。

2.4 突變株遺產(chǎn)穩(wěn)定性實驗

經(jīng)過初篩復(fù)篩選出的正突變株1.6-7-1，經(jīng)過5代連續(xù)轉(zhuǎn)接后進行發(fā)酵培養(yǎng)，比較每代菌株發(fā)酵5 d后生物量、油脂產(chǎn)量、DHA產(chǎn)量，結(jié)果見表4。由表4可知，該突變株遺產(chǎn)性能較為穩(wěn)定，其油脂產(chǎn)量均有大幅度提升，證明了輻照誘變的可行性和科學(xué)性。

2.5 脂肪酸組成分析

將1.6-7-1突變株經(jīng)發(fā)酵所產(chǎn)的藻油進行氣相色譜分析，結(jié)果見表5。由表5可知，裂壺藻脂肪酸組成主要為C16∶0和C22∶6n-3，其中二十二碳六烯酸（DNA）的含量達到了39.92%，表明1.6-7-1突變株經(jīng)發(fā)酵所產(chǎn)的藻油是DNA的良好來源。并且其脂肪酸組成簡單，利于提純。

3 結(jié)論

本實驗利用60Co-γ射線在1.6 kGy的輻射劑量下誘變，最終篩選得到了一株命名為1.6-7-1的高產(chǎn)DHA的裂壺藻突變株，其平均DHA產(chǎn)量為比出發(fā)株提高了約40%，其藻油脂肪酸組成簡單，利于提純，具有良好的商業(yè)前景，在以后的研究中可采取復(fù)合誘變或者基因重組的方法，同時優(yōu)化培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件，有望進一步提高DHA產(chǎn)量，縮小商業(yè)成本。

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Lü Xiaoyi1,FU Jie1,YIN Jia1,TIAN Hua1,CHEN Tao2,HE Dongping1*
(1.College of Food Science and Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China; 2.Wuhan Institute of Virology,Chinese Academy of Sciences,Wuhan 430071,China)

Schizochytrium limacinumATCC20888 was mutated by60Co-γ ray irradiation.Using flat growth condition,biomass,oil content and docosahexaenoic acid(DHA)yield as comprehensive indexes,a mutant strain 1.6-7-1 with high DHA yield was screened.The biomass of the strain was 47.37 g/L,oil content was 31.41%,and DHA yield was 5.65 g/L,which was increased by about 40%than the original strain.After five consecutive generationsoffermentation,itsgenetic stabilitykeptwell.

60Co-γ ray;Schizochytrium limacinum;docosahexaenoic acid

Q933

A

0254-5071（2015）04-0106-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.024

2015-03-24

國家糧食局糧食公益性行業(yè)科研專項（201313012-03）

呂小義（1991-），男，碩士研究生，研究方向為微生物油脂。

*通訊作者：何東平（1957-），男，教授，博士，研究方向為糧食、油脂及植物蛋白。