偽狂犬病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立

田 青，鄭 浩，童 武，劉 飛，梁 超，曹艷云，鄭旭晨，童光志，李國(guó)新

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

·研究論文·

偽狂犬病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立

田 青，鄭 浩，童 武，劉 飛，梁 超，曹艷云，鄭旭晨，童光志，李國(guó)新

根據(jù)偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，RV）gB基因保守序列，設(shè)計(jì)合成一套特異引物和TaqMan探針，建立了一種快速、敏感和特異的檢測(cè)偽狂犬病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。該方法可檢測(cè)到相當(dāng)于10 copies/μL的病毒DNA，比常規(guī)PCR檢測(cè)方法高約100倍，敏感性較強(qiáng)；該方法檢驗(yàn)豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬圓環(huán)病毒2型呈現(xiàn)陰性結(jié)果，特異性強(qiáng)；變異系數(shù)小于1%，具有良好的重復(fù)性。本研究建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法為臨床上對(duì)偽狂犬病毒的檢測(cè)和定量奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

偽狂犬病毒；gB基因；熒光定量PCR

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

偽狂犬病是由偽狂犬病毒（Pseudorabies virus, PRV）感染家畜或野生動(dòng)物引起的一種以發(fā)熱、奇癢、呼吸和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀為特征的急性傳染病[1,2]。豬是唯一的自然宿主，是病毒的長(zhǎng)期貯存和排出者，在偽狂犬病的傳播中起著重要的作用[3]。該病毒可感染各個(gè)年齡段的豬，主要引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎，哺乳仔豬高死亡率及種豬不育。成年豬感染PRV后多呈隱性感染，但可長(zhǎng)期攜帶病毒。出

現(xiàn)臨床癥狀的耐過豬也能成為病毒的攜帶者，成為傳染源，從而增加PRV的防治難度[4]。隨著規(guī)?；B(yǎng)豬的不斷發(fā)展和強(qiáng)毒株的出現(xiàn)，豬群中不斷增大的養(yǎng)殖壓力給PRV的傳播提供了理想的條件，使得偽狂犬病的發(fā)生和流行日趨嚴(yán)重，現(xiàn)在已有40多個(gè)國(guó)家報(bào)道40多種動(dòng)物感染PRV[3]。我國(guó)已有24個(gè)省市報(bào)道發(fā)生偽狂犬病[5]。自2011年以來，我國(guó)很多偽狂犬疫苗免疫豬場(chǎng)爆發(fā)了一種疑似偽狂犬的疫病，母豬產(chǎn)弱仔、死胎或流產(chǎn)，仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀及死亡等[6]。研究證實(shí)該疫病由PRV變異株引起，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[7-10]。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR將常規(guī)PCR與熒光檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)[11]，并且操作簡(jiǎn)便，用時(shí)短，污染少，通過分析軟件可自動(dòng)定量分析，結(jié)果更為準(zhǔn)確直觀，適用于大批量的病毒定性和定量的檢測(cè)，已逐漸成為病原體檢測(cè)的重要方法[12]。

gB是豬PRV的重要囊膜蛋白之一，是皰疹病毒中具有高度保守性的蛋白[13]，在病毒入侵和細(xì)胞間傳播過程中不可或缺，主要促進(jìn)細(xì)胞膜與病毒囊膜融合，并能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[14]。本研究選擇PRV經(jīng)典株和新出現(xiàn)的變異株gB基因均保守的區(qū)域?yàn)榘行蛄?，設(shè)計(jì)并合成一套引物和探針，建立了一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，為偽狂犬病毒的診斷和研究提供了一種簡(jiǎn)便、快速、高效的檢測(cè)方法。

1 材料和方法

1.1 病毒和細(xì)胞偽狂犬病毒SC株是早年分離的強(qiáng)毒株[15]；偽狂犬病毒JS-2012株是2012年分離的變異株[8]；豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus virus type 2，PCV2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）HuN4株、Vero細(xì)胞等均由本研究室保存。

1.2 試劑和儀器質(zhì)粒提取試劑盒QIAprep Spin Miniprep Kit、RNA提取試劑盒QIAamp Viral RNA Mini Kit購(gòu)自QIAGEN公司；DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScript RT Master Mix、pMD18-T Vector Cloning Kit、LA Taq with GC Buffer、Premix Ex Taq、dNTP、DNA Marker均購(gòu)自TaKaRa公司；DNA提取試劑盒TIANamp Virus DNA/RNA Kit、感受態(tài)細(xì)胞TOP10購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)自Gibco公司；Mastercycler ep realplex熒光定量PCR儀為Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.3 樣品處理及核酸提取采集的血液室溫靜置析出血清后，1500×g離心10 min，收集血清。鼻拭子和肛拭子均分別加入1000 μL PBS，渦旋振蕩15 s后，8600×g離心1 min，收集上清。病毒DNA的提取按照DNA提取試劑盒TIANamp Virus DNA/ RNA Kit說明書操作，最后使用60 μL的去離子水溶解，-20℃保存。

1.4 引物和探針的設(shè)計(jì)參照GenBank中PRV gB基因的序列（登錄號(hào)：JF797217、JF797218、JF797219、JQ809328、JQ809329、JQ809330、KC981239和NC006151）以及由本研究室分離保存的變異株JS-2012的gB基因序列，利用DNAStar Lasergene v7.1軟件進(jìn)行同源性分析，找出gB基因的保守區(qū)，利用Beacon Designer 7軟件設(shè)計(jì)出一套特異引物和TaqMan探針。上游引物gB-F：5'-ACCTTGTGGTTGTTG-3'；下游引物gB-R：5'-CATCTACTACAAGAACG-3'；探針gB-Probe：FAM-5'-AGACGCACTTGCCG-3'-BHQ1。探針的5'端選擇FAM作為報(bào)告基團(tuán)，3'端選擇BHQ1為淬滅基團(tuán)，擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為180 bp。引物及探針由大連寶生物工程有限公司合成。

1.5 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的制備使用上述gB上、下游引物，以PRV DNA為模板進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系（50 μL）：2×GC Buffer II 25 μL、2.5 mmol/L dNTP Mixture 8 μL、上下游引物（10 pmol/μL）各1 μL、DNA模板2 μL、滅菌ddH2O 12.5 μL、LATaq（5U/L）0.5 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，

35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)物回收后連接至pMD18-T載體，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到TOP10感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)。使用含Amp的LB平板進(jìn)行篩選，挑菌培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒DNA，進(jìn)行PCR鑒定。對(duì)PCR鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序正確的質(zhì)粒測(cè)定濃度，根據(jù)阿伏加德羅常數(shù)將濃度換算為拷貝數(shù)，10倍系列稀釋于-20℃保存。

1.6 反應(yīng)條件的優(yōu)化矩陣法優(yōu)化引物和探針的濃度，將引物和探針濃度分別稀釋至0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 pmol/μL，并將退火溫度在56℃～58℃范圍內(nèi)以1℃為間距遞增進(jìn)行配比篩選，以獲得最低的Ct值和相對(duì)較高的熒光增加值，從而確定熒光定量PCR反應(yīng)的最優(yōu)條件。

1.7 特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn)使用本試驗(yàn)建立的熒光定量PCR方法對(duì)豬偽狂犬病毒（PRV JS-2012株和SC株）、豬瘟病毒（CSFV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV HuN4株）的DNA或cDNA進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證該檢測(cè)方法的特異性；對(duì)10倍系列稀釋的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)直至該方法不能檢出，并同時(shí)與常規(guī)PCR方法（方法1.5）的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，以驗(yàn)證該檢測(cè)方法的敏感性；對(duì)5個(gè)不同濃度的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)檢測(cè)4次，統(tǒng)計(jì)同一濃度陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品不同重復(fù)的Ct值，并計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)，以驗(yàn)證該檢測(cè)方法的重復(fù)性。

1.8 臨床樣品檢測(cè)分別采集8頭PRV感染豬的鼻拭子、肛拭子、血清共24份樣品，使用建立的熒光定量PCR對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，并同時(shí)與常規(guī)PCR方法（方法1.5）進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的制備以gB-F、gB-R為引物，陽(yáng)性PRV DNA為模板擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物約為180 bp，與預(yù)期大小一致。PCR產(chǎn)物回收后連接pMD18-T載體，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到TOP10感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)。在含有Amp的LB平板上可見大量菌落生長(zhǎng)，挑菌培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒DNA，進(jìn)行PCR鑒定。將PCR鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與目的片段序列完全一致。測(cè)定重組質(zhì)粒濃度后換算成拷貝數(shù)為4.7×1010copies/μL，進(jìn)行10倍系列稀釋后于-20℃保存。

2.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化通過對(duì)不同濃度探針和引物的組合，經(jīng)過多次重復(fù)后，結(jié)果顯示當(dāng)探針濃度為0.2 pmol/μL，引物濃度為0.3 pmol/μL且退火溫度為60℃時(shí)，能夠獲得最低的Ct值和相對(duì)較高的熒光增加值。此時(shí)，反應(yīng)體系（20 μL）：Premix Ex Taq10 μL、上下游引物（10 pmol/μL）各0.6 μL、探針（10 pmol/μL）0.4 μL、DNA模板2 μL、滅菌ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性 5 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。

2.3 特異性試驗(yàn)使用優(yōu)化好的反應(yīng)體系和條件對(duì)本研究室保存的PRV（JS-2012株和SC株）、CSFV、PCV2、PRRSV（HuN4株）同時(shí)進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示只有PRV呈陽(yáng)性，CSFV、PCV2、PRRSV均無典型擴(kuò)增曲線，無模板陰性對(duì)照也未出現(xiàn)擴(kuò)增（圖1）。

2.4 敏感性試驗(yàn)使用優(yōu)化好的反應(yīng)體系和條件對(duì)10倍系列稀釋的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)直至不能檢出，結(jié)果顯示當(dāng)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品濃度為10 copies/μL時(shí)Ct值仍在38以內(nèi)，即本試驗(yàn)建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法最低能夠檢測(cè)到10 copies/μL的病毒（圖2）。通過與常規(guī)PCR方法進(jìn)行比較，熒光定量PCR靈敏度比常規(guī)PCR高約100倍。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)使用優(yōu)化好的反應(yīng)體系和條件對(duì)4.7×103～4.7×107copies/μL的5個(gè)不同濃度的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)檢測(cè)4次，比較同一濃度不同重復(fù)的Ct值，并計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)。結(jié)果顯示，同一濃度不同重復(fù)的Ct值標(biāo)準(zhǔn)差為0.02～0.2，變異系數(shù)為0.08%～0.66%，說明本研究建立的熒光定量PCR具有很好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2.6 臨床樣品檢測(cè)使用建立的熒光定量PCR和常規(guī)PCR對(duì)PRV變異株感染豬的臨床樣品同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。在24份樣品中，普通PCR檢出7份陽(yáng)性樣品，熒光定量PCR不僅檢出普通PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品，而且檢出5份普通PCR檢測(cè)為陰性的樣品，顯

示出很好的靈敏度（表1）。

3 討論

隨著規(guī)?；B(yǎng)豬的不斷發(fā)展以及新流行毒株變異株的出現(xiàn)，PRV的發(fā)生和流行日趨嚴(yán)重，不斷危害著我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，我國(guó)很多規(guī)模化豬場(chǎng)的PRV野毒呈陽(yáng)性，很多中小規(guī)模的豬場(chǎng)和小養(yǎng)殖場(chǎng)感染情況更為糟糕，這樣使得本病的控制變得更加復(fù)雜。偽狂犬病的防控需要綜合措施，對(duì)于健康豬場(chǎng)應(yīng)嚴(yán)格做好規(guī)范引種，保護(hù)易感豬群，封閉化管理，健全規(guī)章制度等工作；對(duì)于發(fā)病豬場(chǎng)，發(fā)病動(dòng)物應(yīng)及時(shí)隔離、治療和淘汰，未發(fā)病動(dòng)物應(yīng)采取緊急免疫接種措施，還要加強(qiáng)消毒措施和改善飼養(yǎng)管理。其中，對(duì)PRV進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的診斷，尤其是對(duì)目前較為流行的豬PRV變異株的診斷是及其重要的。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR主要分為SYBR熒光染料法和TaqMan熒光探針法，后者具有更好的特異性[16]。因此，本試驗(yàn)采用TaqMan探針法熒光定量PCR技術(shù)建立了PRV的快速檢測(cè)技術(shù)。PRV基因組為雙股線性DNA，約為150 kb，含有至少70個(gè)基因。我們選取皰疹病毒成員中最為保守的糖蛋白基因gB基因作為檢測(cè)的靶基因，通過序列的比對(duì)，選擇了PRV經(jīng)典株和變異株均保守的區(qū)域來設(shè)計(jì)探針和引物。此外，由于PRV基因組GC含量高達(dá)73%以上，導(dǎo)致整個(gè)基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜，局部的二級(jí)結(jié)構(gòu)經(jīng)常影響PCR擴(kuò)增，同時(shí)也增加了引物和探針的設(shè)計(jì)難度。為了避免這個(gè)問題，我們?cè)趃B基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)探針和引物時(shí)，盡量保障它們有相近的GC和AT含量。通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了一種可定量檢測(cè)豬PRV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，經(jīng)驗(yàn)證該方法特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好，并且檢測(cè)時(shí)間短、速度快。因此，本試驗(yàn)建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法可用于PRV經(jīng)典毒株或變異毒株的檢測(cè)和定量。

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DEVELOPMENT OF REAL-TIME FLURESCENCE QUANTITATIVE PCR FOR DETECTION OF PSEUDORABIES VIRUS

TIAN Qing, ZHENG Hao, TONG Wu, LIU Fei, LIANG Chao, CAO Yan-yun, ZHENG Xu-chen, TONG Guang-zhi, LI Guo-xin
(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241,China)

Real-time f uorescence quantitative PCR (qPCR) assay was developed using a pair of primers and a TaqMan probe that were designed according to the sequences of the gB gene of Pseudorabies virus (PRV). This qPCR assay allowed for rapid, sensitive and specif c detection of PRV DNA. The detection limit was as low as 10 copies/μL viral DNA, which was 100 times more sensitive than the conventional PCR. There was no cross-reactivity with other related viruses, such as Classical swine fever virus (CSFV), Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and Porcine circovirus type 2 (PCV2), indicating that the assay was highly specif c to PRV. The distributions with a coeff cient of variation to be less than 1% showed that the assay had good reproducibility. Therefore, the qPCR assay was a valuable tool for rapid detection and quantif cation of PRV.

Pseudorabies virus; gB gene; real-time PCR

S852.659.5

A

1674-6422（2015）03-0001-06

2015-03-20

上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（142R1448900）；上海市科技農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（滬農(nóng)科攻字（2015）第1-7號(hào)）；公益性·行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201203039）；中央科研究院所公益性基礎(chǔ)科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（2012JB02）；國(guó)家生豬現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-36）

田青，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

李國(guó)新，E-mail: guoxinli@shvri.ac.cn