嗜熱鏈球菌關(guān)鍵生產(chǎn)特性分子水平的研究進(jìn)展

趙春雨，崔艷華，曲曉軍，俞婷，張春玲

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，哈爾濱150090；2.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱150010）

0 引言

嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）是最具經(jīng)濟(jì)價值的同型發(fā)酵乳酸菌之一，是公認(rèn)的益生菌，對維持人體胃腸道微生態(tài)平衡，改善乳糖不耐癥，提高機(jī)體免疫力有積極功效，在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用于酸奶、瑞士干酪等發(fā)酵乳品生產(chǎn)[1-2]。

嗜熱鏈球菌菌株的產(chǎn)酸、代謝乳糖、抗噬菌體、宿主防御能力、快速生長能力、合成胞外多糖（EPS）、產(chǎn)細(xì)菌素及風(fēng)味物質(zhì)等特性，直接關(guān)系到發(fā)酵乳品的品質(zhì)特性，其中以胞外多糖合成和產(chǎn)酸能力最為重要[2]。研究發(fā)現(xiàn)，不同菌株間，存在著產(chǎn)酸、乳糖代謝、適應(yīng)環(huán)境脅迫能力、胞外多糖與細(xì)菌素合成能力等明顯的差異[3-9]。當(dāng)前，嗜熱鏈球菌的研究，大多集中于基于表型特性的菌株篩選和不同生境中菌株遺傳多樣性分析，而對于不同菌株間重要生產(chǎn)特性的分子水平研究甚少，具體機(jī)理機(jī)制更鮮有報道。本文就當(dāng)前嗜熱鏈球菌關(guān)鍵生產(chǎn)特性分子水平研究的概況作以簡介，旨在為該方向研究提供參考。

1 基因組學(xué)

大量乳酸菌，尤其是嗜熱鏈球菌不同菌株基因組序列信息的公布，加速了嗜熱鏈球菌在分子水平上的研究。當(dāng)前已完成了10余株嗜熱鏈球菌的全基因組測序，主要為乳源性菌株，包括LMG18311、LMD-9和CNRZ1066菌株（NCBI登錄號CP000023.1、CP000419.1和 CP000024.1，均來自酸奶）；MN-ZLW-002菌株（NCBI登錄號CP003499.1，分離于中國傳統(tǒng)發(fā)酵乳）；ND03菌株（NCBI登錄號CP002340.1，來自青海自然發(fā)酵牦牛乳）；JIM8232菌株（NCBI登錄號FR875178.1，分離于牛奶且產(chǎn)黃色素）；ASCC 1275菌株（NCBI登錄號CP006819，高產(chǎn)胞外多糖）[10-15]。近期分離于山羊奶的TH1435和TH1436菌株（NCBI登錄號 AYSG00000000、AYTT00000000），來自印度干酪的MTH17CL396和M17PTZA496（NCBI登錄號AZJS00000000、AZJT00000000）菌株的全基因組序列也已完成[16-17]。同時CNCM I-1630、DGDD7710、MTCC5460、MTCC5461、DGCC7710等多個菌株正處于基因組測序中。多個菌株基因組序列的公布，為在分子水平上闡述該菌生理及代謝機(jī)制，加速優(yōu)良菌種的選育和改造，提高發(fā)酵食品工業(yè)化控制水平，奠定了理論基礎(chǔ)；并為從基因水平上揭示不同菌株之間生產(chǎn)特性差異的機(jī)制，提供了理論依據(jù)和實驗參考。

2 關(guān)鍵發(fā)酵特性分子水平

乳源性S.thermophilus菌株具有合成胞外多糖、分解蛋白、產(chǎn)酸、酸耐受性、合成細(xì)菌素、利用乳糖、產(chǎn)甲酸和葉酸、天然和適應(yīng)性免疫、抗噬菌體、生長快速等共同的特性[4,18]。這些共性對于S.thermophilus作為乳品發(fā)酵劑應(yīng)用于乳發(fā)酵過程至關(guān)重要。菌株為了適應(yīng)不同的環(huán)境，其基因組不斷的進(jìn)化，形成了各自獨特的基因組成和特殊的相應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)，進(jìn)而菌株也呈現(xiàn)出不同的發(fā)酵特性。

研究者對分離于乳品的47株S.thermophilus，比較基因組雜交分析，研究發(fā)現(xiàn)，不同菌株基因組的核心基因具有較大差異，差異基因主要包括細(xì)菌素合成、胞外多糖生物合成、肽代謝、噬菌體抗性等相關(guān)基因[18]?；蛩睫D(zhuǎn)移和自然競爭共同作用使得S.thermophilus在乳環(huán)境中的進(jìn)化得以完成。在進(jìn)化過程中，部分碳水化合物代謝基因、毒力基因等基因，在穩(wěn)定的乳環(huán)境中逐漸退化和消失[6,19]。在Streptococcus屬中，開放讀碼框架組的功能基因分布分析表明，S.thermophilus LMG18311、LMD-9和CNRZ1066菌株形成了明顯的功能簇，專門適應(yīng)營養(yǎng)豐富的乳環(huán)境[19]。

同時，蛋白分解能力、氮代謝、糖利用和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，在菌株適應(yīng)乳環(huán)境的過程中，起到了關(guān)鍵作用[4,6,18]。這種進(jìn)化導(dǎo)致了菌株多樣的代謝活性[3-9]。

2.1 胞外多糖合成多樣性

當(dāng)前，在S.thermophilus已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了15種胞外多糖合成基因簇和67種糖基轉(zhuǎn)移酶[7,15]。eps基因簇多樣性可能直接影響了菌株產(chǎn)胞外多糖的能力。

分離于傳統(tǒng)發(fā)酵乳品的S.thermophilus MNZLW-002菌株具有顯著的產(chǎn)胞外多糖能力，并表現(xiàn)出良好的發(fā)酵性能[14]。研究發(fā)現(xiàn)，MN-ZLW-002中的胞外多糖合成（eps）基因簇與其他菌株中的eps基因簇不盡相同。MN-ZLW-002菌株的eps基因簇，由20,358 bp組成，含有25個開放讀碼框（Open Reading Frame,ORF），其中epsA、epsB、epsC和epsE等四個基因為胞外多糖合成相關(guān)的保守基因。有趣的是，該菌eps基因簇中含有9個轉(zhuǎn)座酶基因，是目前發(fā)現(xiàn)的含有最多轉(zhuǎn)座酶基因的S.thermophilus eps基因簇[10-15]。推測該基因簇可能是通過種間基因水平轉(zhuǎn)移獲得的。

近來基因組分析發(fā)現(xiàn)，具有高產(chǎn)胞外多糖性能的ASCC 1275菌株，與其他已測序的S.thermophilus菌株（LMD-9、 CNRZ1066、 LMG 18311、 ND03、MN-ZLW-002）相比，含有獨特的胞外多糖生物合成系統(tǒng)，具有高度保守的胞外多糖生物合成調(diào)控基因epsA-epsB，但是eps基因簇的組成與其他菌株較為不同。在其eps基因簇中有2對基因，即eps1C-eps1D和eps2C-eps2D，決定著EPS鏈的長度。同時表明該菌株可以生產(chǎn)不同分子量的胞外多糖。同時該菌具有更有效的蛋白分解系統(tǒng)及更為復(fù)雜的壓力反應(yīng)系統(tǒng)。ASCC 1275菌株含有4個獨立的CRISPR/Cas后天免疫系統(tǒng)，該系統(tǒng)用于消滅外來的噬菌體。該菌株是當(dāng)前發(fā)現(xiàn)的含有該系統(tǒng)最多的S.thermophilus菌株。這一特性是該菌株在工業(yè)生產(chǎn)上發(fā)揮效能的有力保障[10-12,14-15]。

2.2 風(fēng)味多樣性

在乳制品發(fā)酵過程中，乳酸菌對于風(fēng)味物質(zhì)的形成起到了關(guān)鍵作用。在乳中風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì)主要來自酪蛋白，同時也來自脂肪酸和糖類。乳酸菌的蛋白酶系統(tǒng)將酪蛋白降解成氨基酸，后者被胞內(nèi)酶作用轉(zhuǎn)化成醇類、醛類、酯類等物質(zhì)，從而形成乳品特有的風(fēng)味[20]。

由蛋白分解產(chǎn)生的游離的氨基酸，通過氨基酸途徑，轉(zhuǎn)化成多樣的風(fēng)味物質(zhì)。支鏈氨基酸（纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸）、芳香族氨基酸（酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸）、含硫氨基酸（甲硫氨酸、半胱氨酸）是風(fēng)味物質(zhì)的主要氨基酸來源。這些氨基酸主要通過轉(zhuǎn)氨和脫氨途徑，轉(zhuǎn)化成風(fēng)味物質(zhì)[20-23]。轉(zhuǎn)氨途徑中，氨基酸在氨基轉(zhuǎn)移酶的作用下，轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的α-酮酸，α-酮酸進(jìn)而轉(zhuǎn)成醛、醇和酯等重要的芳香物質(zhì)。研究表明支鏈氨基酸、芳香族氨基酸和甲硫氨酸經(jīng)轉(zhuǎn)氨途徑代謝。

嗜熱鏈球菌的CNRZ1066、LMG18311和LMD-9菌株，全基因組分析表明，α-酮酸轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵途徑—氧化脫羧途徑的ptb、buk、bkdDABC的同源基因位于嗜熱鏈球菌染色體的不同位置上，而非位于同一個操縱子上。當(dāng)前已研究證實嗜熱鏈球菌菌株具有這些酶的活性[24]。大多數(shù)嗜熱鏈球菌菌株生長在基本培養(yǎng)基中，沒有對氨基酸（包括含硫氨基酸）的需求，表明其含有氨基酸生物合成的全部途徑[25]?；蚪M分析也證實了這一點。該菌基因組中含有絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶（CysE）、半胱氨酸合成酶（CysK）、胱硫醚-β-合成酶（CBS）、S-甲基轉(zhuǎn)移酶MetH和MetE等一系列氨基酸生物合成的相關(guān)酶[10-11,20]。有趣的是，嗜熱鏈球菌基因組中含有2個CysE，而大多數(shù)乳桿菌中不含該酶。該酶可催化絲氨酸生成o-乙酰基-L-絲氨酸，后者在CysK作用下，生成半胱氨酸，進(jìn)而形成二甲基硫醚等重要的芳香物質(zhì)[20]。

2.3 細(xì)菌素合成多樣性

當(dāng)前，已經(jīng)對嗜熱鏈球菌的抗菌性和抗菌譜展開了較為廣泛的研究。研究表明，該菌有的菌株產(chǎn)生細(xì)菌素，并且抗菌譜存在差異。嗜熱鏈球菌產(chǎn)生的細(xì)菌素thermophilins可以抑制病原菌和腐敗細(xì)菌，例如李斯特菌（Listeria monocytogenes）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）等。許多細(xì)菌素已經(jīng)被純化、測序和功能驗證[9,26-30]。研究發(fā)現(xiàn)，由thmA和thmB基因編碼的二肽細(xì)菌素thermophilin 13，以及tepA基因編碼的羊毛硫抗菌肽thermophilin 1277，表現(xiàn)出廣譜的抗菌能力[26,29]。

2.4 蛋白酶多樣性

在發(fā)酵乳的生產(chǎn)過程中，由于牛乳中游離氨基酸的含量較低，從而限制了乳酸菌的生長，因此乳酸菌發(fā)酵劑菌株必須將酪蛋白降解為肽類和氨基酸，以滿足其快速生長對含氮源的需求。蛋白水解系統(tǒng)為細(xì)胞提供生長所需的基本的氨基酸，同時影響著發(fā)酵乳品的感官特性和風(fēng)味[30]。乳酸菌的蛋白水解系統(tǒng)主要含有三個組分：（1）胞外蛋白酶，將酪蛋白降解成寡肽；（2）肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，將肽運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞中；（3）胞內(nèi)肽酶，將肽降解成更短的肽和氨基酸[31]。酪蛋白中含有豐富的脯氨酸，因此乳酸菌含有大量的脯氨酸肽酶[32-33]。

當(dāng)前，在乳酸菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了5種類型的胞外蛋白酶，包括PrtP（Lactococcus lactis、Lactobacillus paracasei）、PrtH（Lactobacillus helveticus）、PrtR（Lactobacillus rhamnosus）、PrtS（S.thermophilus）、PrtB（Lactobacillu delbrueckii ssp.bulgaricus）[30]。不同乳酸菌蛋白水解活性存在明顯差異，例如與 L.delbrueckii ssp.bulgaricus、L.acidophilus、Bixdobacterium spp.相比，S.thermophilus具有更高的二肽酶活性[34-35]。同時，同一菌種的不同菌株之間蛋白水解活性也表現(xiàn)出較大差異[6,36-37]。Galia等人研究發(fā)現(xiàn)，在30個供試的S.thermophilus菌株中，12個株菌具有胞外酶活性（PrtS+），3株表現(xiàn)出微弱胞外酶活性（PrtS+/-），而15株菌無胞外酶活性（PrtS-）[6]。有趣的是，PrtS-菌株卻含有編碼PrtS的基因，因此推測可能由于prtS調(diào)節(jié)的變化，而導(dǎo)致了菌株缺乏蛋白水解能力。同時研究表明，具有高度酸化能力的菌株，均為PrtS+菌株。絕大多數(shù)PrtS+菌株在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化中，關(guān)系密切。采用16S-23S rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)測序分析表明，具有高度酸化能力和蛋白水解能力的菌株，均為II-ITS型[6]。

3 結(jié)束語

嗜熱鏈球菌合成胞外多糖、產(chǎn)細(xì)菌素、蛋白酶及風(fēng)味物質(zhì)等重要生產(chǎn)特性，與發(fā)酵乳品質(zhì)密切相關(guān)。不同菌株之間存在著生產(chǎn)特性的明顯差異，解析生產(chǎn)特性差異的機(jī)制，將為加快優(yōu)良菌株的選育和改造、加速優(yōu)良發(fā)酵劑生產(chǎn)、提高發(fā)酵食品工業(yè)化控制水平提供理論依據(jù)。近年來，基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)中研究新方法和新技術(shù)手段的出現(xiàn)，將加快這一進(jìn)程。

[1]ADOLFSSON O,MEYDANI S N,RUSSELL R M.Yogurt and gut function [J].American Journal of Clinical Nutrition,2004,80：245-256.

[2]IYER R,TOMAR S K,MAHESWARI T U,et al.Streptococcus thermophilus strains：multifunctional lactic acid bacteria[J].International Dairy Journal,2010,20：133-141.

[3]VANINGELGEM F,ZAMFIR M,MOZZI F,et al.Biodiversity of exopolysaccharides produced by Streptococcus thermophilus strains is reflected in their production and their molecular and functional characteristics[J].Applied and Environmental Microbiology,2004,70（2）：900-912.

[4]HOLS P,HANCY F,FONTAINE L,et al.New insights in the molecular biology and physiology of Streptococcus thermophilus revealed by comparative genomics[J].FEMS Microbiology Reviews,2005,29,435-463.

[5]ZOTTA T,RICCIARDI A,CIOCIA F,et al.Diversity of stress responses in dairy thermophilic streptococci[J].International Journal of Food Microbiology,2008,124：34-42.

[6]GALIA W,PERRIN C,GENAY M.Variability and molecular typing of Streptococcus thermophilus strains displaying different proteolytic and acidifying properties[J].International Dairy Journal,2009,19：89-95.

[7]DE VUYST L,WECKX S,RAVYTS F,et al.New insights into the exopolysaccharide production of Streptococcus thermophilus[J].International Dairy Journal,2011,21：586-591.

[8]MICLO L,ROUX é,GENAY M,et al.Variability of hydrolysis of β -, αs1-,and αs2-Caseins by 10 strains of Streptococcus thermophilus and resulting bioactive peptides[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2012,60：554-565.

[9]ROSSI F,MARZOTTO M,CREMONESE S,et al.Diversity of Streptococcus thermophilus in bacteriocin production；inhibitory spectrum and occurrence of thermophilin genes[J].Food Microbiology,2013,35,27-33.

[10]BOLOTIN A,QUINQUIS B,RENAULT P,et al.Complete sequence and comparative genome analysis of the dairy bacterium Streptococcusthermophilus[J].Nature Biotechnology,2004,22 （12）：1554-1558.

[11]MAKAROVA K,SLESAREVB A,WOLFA Y,et al.Comparative genomics of the lactic acid bacteria[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2006,103（42）：15611-15616.

[12]SUN Z,CHEN X,WANG J,et al.Complete genome sequence of Streptococcus thermophilus strain ND03[J].Journal of Bacteriology,2011,193（3）：793-794.

[13]DELORME C,BARTHOLINI C,LURASCHI M,et al.Complete genome sequence of the pigmented Streptococcus thermophilus strain JIM8232[J].Journal of Bacteriology,2011,193（19）：5581-5582.

[14]KANG X,LING N,SUN G,et al.Complete genome sequence of Streptococcus thermophilus strain MN-ZLW-002[J].Journal of Bacteriology,2012,194（16）：4428-4429.

[15]WU Q L,TUN H M,LEUNG F C C,et al.Genomic insights into high exopolysaccharide-producing dairy starter bacterium Streptococcus thermophilus ASCC 1275[J].Scientific Reports,2014,4：4974.

[16]TREU L,VENDRAMIN V,BOVO B,et al.Genome sequences of Streptococcus thermophilus strains MTH17CL396 and M17PTZA496 from Fontina,an Italian PDO cheese[J].Genome Announcements,2014,2（1）：e00067-14.

[17]TREU L,VENDRAMIN V,BOVO B,et al.Whole-genome sequences of Streptococcus thermophilus strains TH1435 and TH1436,isolated from raw goat milk[J].Genome Announcements,2014,2（1）：e01129-13.

[18]RASMUSSEN T B,DANIELSEN M,VALINA O,et al.Streptococcus thermophilus core genome：comparative genome hybridization study of 47 strains[J].Applied and Environmental Microbiology,2008,74（15）：4703-4710.

[19]GOH Y J,GOIN C,O'FLAHERTY S,et al.Specialized adaptation of a lactic acid bacterium to the milk environment：the comparative genomics of Streptococcus thermophilus LMD-9[J].Microbial Cell Factories,2011,10（Suppl 1）：S22.

[20]LIU M J,NAUTA A,FRANCKE C,et al.Comparative genomics of enzymes in flavor-forming pathways from amino acids in lactic acid bacteria.Applied and Environmental Microbiology,2008,74（15）：4590-4600.

[21]YVON M,RIJNEN L.Cheese flavour formation by amino acid catabolism[J].International Dairy Journal,2001,11（4）：185-201.

[22]SMIT G,SMIT B A,ENGELS W J M.Flavour formation by lactic acid bacteria and biochemical flavour profiling of cheese products[J].FEMS Microbiology Reviews,2005,29（3）：591-610.

[23]ARD? Y.Flavour formation by amino acid catabolism[J].Biotechnology Advances,2006,24（2）：238-242.

[24]HELINCK S,LE BARS D,MOREAU D,et al.Ability of thermophilic lactic acid bacteria to produce aroma compounds from amino acids[J].Applied and Environmental Microbiology,2004,70（7）：3855-3861.

[25]LETORT C,JUILLARD V.Development of a minimal chemically defined medium for the exponential growth of Streptococcus thermophilus[J].Journal of Applied Microbiology,2001,91（6）：1023-1029.

[26]MARCISET O,JERONIMUS-STRATINGH M C,MOLLET B,et al.Thermophilin 13,a nontypical antilisterial poration complex bacteriocin,that functions without a receptor[J].Journal of Biological Chemistry,1997,272（22）：14277-14284.

[27]FONTAINE L,HOLS P.The inhibitory spectrum of thermophilin 9 from Streptococcus thermophilus LMD-9 depends on the production of multiple peptides and the activity of BlpGSt,a thiol-disulfide oxidase[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74（4）：1102-1110.

[28]MATHOT A G,BELIARD E,THUAULT D.Streptococcus thermophilus 580 produces a bacteriocin potentially suitable for inhibition of Clostridium tyrobutyricum in hard cheese[J].Journal of Dairy Science,2003,86（10）：3068-3074.

[29]KABUKI T,UENISHI H,SETO Y,et al.A unique lantibiotic,thermophilin 1277,containing a disulfide bridge and two thioether bridges[J].Journal of Applied Microbiology,2009,106（3）：853-862.

[30]SAVIJOKI K,INGMER H,VARMANEN P.Proteolytic systems of lactic acid bacteria[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2006,71（4）：394-406.

[31]CHRISTENSEN J E,DUDLEY E G,PEDERSON J A,et al.Peptidases and amino acid catabolism in lactic acid bacteria[J].Antonie Van Leeuwenhoek,1999,76（1）：217-246.

[32]KIM Y K,YAGUCHI M,ROSE D.Isolation and amino acid composition of para-kappa-casein[J].Journal of Dairy Science,1969,52（3）：316-320.

[33]STEWART A F,BONSING J,BEATTIE C W,et al.Complete nucleotide sequences of bovine alpha S2-and beta-casein cDNAs：comparisons with related sequences in other species[J].Molecular Biology and Evolution,1987,4（3）：231-241.

[34]SHIHATA A,SHAH NP.Proteolytic profiles of yogurt and probiotic bacteria[J].International Dairy Journal,2000,10：401-408.

[35]LIU MJ,BAYJANOV JR,RENCKENS B,et al.The proteolytic system of lactic acid bacteria revisited：a genomic comparison[J].BMC Genomics,2010,11：36.

[36]SETTACHAIMONGKON S,NOUT MJR,FERNANDES ECA,et al.Influence of different proteolytic strains of Streptococcus thermophilus in co-culture with Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus on the metabolite profile of set-yoghurt[J].International Journal of Food Microbiology,2014,177,29-36.

[37]CHANG OK,PERRIN C,GALIA W,et al.Release of the cell-envelope protease PrtS in the growth medium of Streptococcus thermophilus 4F44[J].International Dairy Journal,2012,23,91-98.