雞球蟲病的免疫預防研究進展

康桂英

（內蒙古民族大學動物科學技術學院,內蒙古通遼 028000）

雞球蟲病的免疫預防研究進展

康桂英

（內蒙古民族大學動物科學技術學院,內蒙古通遼 028000）

雞球蟲病是由一種或多種球蟲引起，對養(yǎng)雞業(yè)危害比較嚴重的腸道寄生蟲病。該病多發(fā)于15～50日齡的雛雞，發(fā)病率與死亡率都極高。成年雞多為帶蟲者，對其生產能力有一定的影響。據(jù)報道，英國每年由于雞球蟲病造成的損失約為4 200萬英鎊；美國每年由于雞球蟲病造成的直接或間接經(jīng)濟損失高達20～30億美元。目前，該病已被美國列為對禽類危害最嚴重的五大傳染病之一。隨著球蟲病的藥物防治成本不斷提高、藥物殘留問題和耐藥蟲株的出現(xiàn)，研究者們將防治雞球蟲病的重點由藥物防治逐漸轉移到免疫預防，用疫苗免疫球蟲病將成為球蟲病防治的發(fā)展趨勢，人們所用的疫苗有強毒苗，弱毒苗、基因工程苗和單克隆抗體。

1 強毒苗

強毒苗就是指利用自然界分離的強毒蟲株制備的疫苗。常用的制備方法是收集自然發(fā)生雞球蟲病的病雞糞便中的混合卵囊，然后，再用單卵囊分離法把不同種類的艾美耳球蟲分離出來并增殖，加入適當?shù)姆€(wěn)定劑，然后再按一定的比例混合制成強毒活苗?；蛟谑占涯乙院螅环蛛x卵囊，而是使用混合卵囊來制備強毒蟲苗。目前，世界上的雞球蟲強毒疫苗有美國生產的“Coccivac”，加拿大的“Immucox”。我國也有一些教學和科研單位研究出強毒疫苗，其效果與進口疫苗相仿。中國農業(yè)大學寄生蟲研究組曾用由5種雞艾美耳球蟲和懸浮劑制成的疫苗對肉仔雞進行免疫接種，結果顯示接種后雞無不良反應，接種6周后能抵抗20萬混合孢子化卵囊的攻擊。陳明勇[1]用幼嫩艾美耳球蟲強毒苗長期低水平的免疫雞后，雞體能產生一定的免疫保護。

雞在低劑量感染強毒苗時不會出現(xiàn)病理現(xiàn)象，但是，卵囊會留在雞體內進行生長繁殖，并且伴有新的卵囊排出體外，排出體外的卵囊混合在雞的生活環(huán)境中，雞再接觸時又一次感染，通過這樣的幾次感染免疫后，雞就能夠得到較好的免疫保護。盡管強毒苗能誘使雞發(fā)生免疫應答從而產生免疫保護，但由于強毒苗的毒性較強，所以，容易引發(fā)雞群發(fā)生雞球蟲病。其次，由于接種疫苗，有可能給沒有球蟲病的雞群帶來強毒的球蟲，引發(fā)球蟲病。由于以上這些缺點，人們又開始把研究目標放在了弱毒苗上。

2 弱毒苗

制備弱毒苗采用毒性致弱的卵囊。自然界能分離到弱毒蟲株的情況尚未見到報道，一般都是通過人工方法使毒株的毒力減弱，使其對宿主的危害降低，但是，能使宿主產生足夠的免疫力從而達到免疫的效果。目前，人工制備弱毒苗的方法有：雞胚傳代致弱、早熟選育、理化處理及細胞培養(yǎng)等。

2.1 雞胚傳代致弱

用雞胚培養(yǎng)球蟲子孢子，球蟲子孢子在雞胚尿囊膜上連續(xù)生長幾代后，其致病力下降，但其免疫原性不變，用這樣的球蟲制備疫苗稱之為雞胚傳代致弱蟲苗。Long等[2]首次用柔嫩艾美耳球蟲培養(yǎng)出雞胚致弱蟲株，其致病力低于親本株，同時也能使宿主產生免疫，抵抗強毒的攻擊。雞胚傳代致弱疫苗的免疫力也相對較穩(wěn)定，例如，樊生超等[3]將柔嫩艾美耳球蟲雞胚適應株連續(xù)回雞6代仍然沒有返祖現(xiàn)象，致病性依舊較低，沒有威脅。樊玉娟[4]在對柔嫩艾美耳球蟲的生物學特性研究發(fā)現(xiàn)，致弱后的卵囊在致病力、繁殖能力較原始株有所減弱，免疫原性保持良好。但球蟲的免疫原性會受傳代次數(shù)的影響，傳代次數(shù)增多，球蟲的免疫原性會減弱甚至消失，而且雞胚適應株回歸雞連續(xù)傳代一定次數(shù)后，有可能出現(xiàn)致病性恢復的現(xiàn)象。此外，巨型艾美耳球蟲、堆型艾美耳球蟲和早熟艾美耳球蟲不能使用雞胚傳代方法致弱。

2.2 早熟選育

早熟選育篩選蟲苗的過程是將自然界分離的蟲株通過雞體連續(xù)傳代，篩選出早熟蟲株。致弱蟲株與親代相比，生活史周期大大縮短，產出的卵囊量也減少了，致病力降低，但是免疫原性仍然保持良好。McDonald等[5]研制的巨型艾美耳球蟲早熟系，潛伏期從120 h減少到107 h，致病能力和繁殖能力都比親本代有所降低；史宗勇等[6]對毒害艾美耳球蟲早熟株的致病性和繁殖力進行測定，測定結果顯示裂殖階段裂殖次數(shù)減少，時間縮短，裂殖子數(shù)量減少，從而導致繁殖能力下降，繼而致病力降低。段家樹等[7]采用早熟選育的方法，成功研制了單價柔嫩艾美耳球蟲弱毒。國內外研究者應用這種選育方法已經(jīng)成功研制出了柔嫩艾美耳球蟲，堆型艾美耳球蟲和巨型艾美耳球蟲的早熟苗，其致病力低，免疫原性和親代相仿。研究者們通過實驗證實所有球蟲都可以通過這種方法來致弱。

2.3 理化處理

就是通過物理和化學方法對球蟲卵囊進行處理，使其致病力降低。常用的方法有冷凍、加熱、輻射，化學誘變劑等。吳兆敏等[8]證明了用化學誘導劑NTG處理后的柔嫩艾美耳球蟲免疫小雞后，雛雞可以獲得保護性免疫，球蟲毒力下降的同時其繁殖能力也有所下降。很多人懷疑輻射致弱并不是真的致弱，而是減少了活卵囊的數(shù)量。Jenkins等[9]經(jīng)過免疫組化研究證明，卵囊被輻射減毒致弱后，卵囊的裂殖階段停止，沒有繼續(xù)發(fā)育。這個研究結果否定了人們對輻射致弱的本質的懷疑。

2.4 細胞培養(yǎng)

Zhang等[10]將柔嫩艾美耳球蟲用雞腎細胞培養(yǎng)，球蟲經(jīng)過雞腎細胞與雞體交替?zhèn)鞔?4代以后，將原代球蟲F0和第14代球蟲F14分別免疫試驗雞，結果顯示，兩種球蟲都能使雞體產生免疫反應，F(xiàn)14的致病性和死亡率都有所降低。其主要原因是由于F1～F14與F0代相比出現(xiàn)了一些質的變化，這個變化是多個卵囊可以同時寄生在一個原代雞腎細胞內。在多重感染的細胞周圍，人們還發(fā)現(xiàn)了一些正常的細胞，這表明不同的宿主細胞對裂殖子的易感性不同。

3 基因工程苗

致弱蟲株制備出的活苗多次接種回歸雞體后會不會出現(xiàn)返祖現(xiàn)象，這是一個令人擔憂的問題，所以研究者開始關注基因工程疫苗。

3.1 重組蛋白疫苗

將雞球蟲的抗原基因與表達載體重組，將重組子轉入細菌或細胞中進行高效表達，收集并純化表達的球蟲抗原蛋白，利用這些蛋白制備的疫苗即重組蛋白疫苗。徐占云等[11]截取了柔嫩艾美耳球蟲的一部分抗原基因λMzp5-7，使其與載體重組后將其在大腸桿菌中表達形成重組抗原。將重組抗原免疫雛雞，實驗結果顯示柔嫩艾美耳球蟲λMzp5-7的重組抗原能使雛雞產生免疫應答反應。彭昊等[12]在對巨型艾美耳球蟲重組蛋白Gam82-Y的免疫原性研究實驗中指出，Gam82-Y重組抗原能減少卵囊的排除，具有一定的免疫作用。李安興等[13]成功克隆出柔嫩艾美耳球蟲北京株重要抗原SO7基因，并在大腸桿菌中表達，用該重組抗原免疫雞后，雞能得到部分保護力。潘曉婷等[14]用柔嫩艾美耳球蟲BJ株的EtMIC和ta4兩種基因的表達產物免疫雞后，用柔嫩艾美耳球蟲攻擊免疫后的雞，結果發(fā)現(xiàn)免疫雞對柔嫩艾美耳球蟲具有一定的免疫力。

3.2 核酸疫苗

核酸疫苗也稱基因疫苗，就是將雞球蟲保護性抗原基因克隆到質粒載體中，然后導入宿主體內，利用宿主的表達系統(tǒng)表達抗原蛋白，宿主細胞產生對該蛋白的免疫應答。例如Song K D等[15]將柔嫩艾美耳球蟲的3-1EcDNA基因克隆到質粒pBK-CMV中，形成一個表達性的質粒載體Pmp-13，對一日齡的雞進行皮下注射或者肌肉注射免疫，攻毒后卵囊產出減少，結果表明能產生一定的免疫力。李文超等[16]使用其構建的柔嫩艾美耳球蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑基因核酸疫苗對雛雞進行了免疫，通過結果顯示該核酸疫苗對雞柔嫩艾美耳球蟲感染具有一定的保護作用。大量實驗證明，核酸疫苗能激發(fā)機體產生劇烈的CTL反應，而雞球蟲免疫主要以細胞免疫為主，所以核酸疫苗在球蟲免疫方面有很大的優(yōu)勢。吳紹強[17]使用MTT法進行淋巴細胞轉化實驗來檢測PCT核酸疫苗的細胞免疫水平，結果發(fā)現(xiàn)，核酸疫苗PCT能很好地誘導機體產生細胞免疫反應。

3.3 活載體疫苗

在雞的保護性免疫中，免疫細胞，尤其是T淋巴細胞，巨噬細胞和NK細胞起著重要的作用，所以，常采用合適的載體研制活載體疫苗，這樣可以模擬抗原在雞體內的遞增過程，從而誘導細胞產生免疫應答，同時提高疫苗的保護能力。已用做雞球蟲活載體疫苗的載體有禽痘病毒、鼠傷寒沙門氏菌和火雞皰疹病毒等。杜愛芳等[18]使用減毒沙門氏菌為載體傳遞雞球蟲DNA疫苗的實驗結果也證明了攜帶柔嫩艾美耳球蟲5401基因的重組菌能誘導機體產生抗體，也能顯著增強淋巴細胞的增殖水平。用鼠傷寒沙門氏菌重組的抗原，經(jīng)口免疫能延長抗原在雞體內腸道中的作用時間；用禽痘病毒和火雞皰疹病毒重組的抗原，能誘導部分細胞和體液的免疫反應。

4 單克隆抗體

自單克隆抗體被成功的制備出來，這項技術就發(fā)揮了重要的作用，成為疾病診斷、治療、預防領域中不可或缺的一項技術。國內已建立起培育針對堆型艾美耳球蟲的單克隆細胞株。在國內，王承民等[19]利用雜交瘤技術，將堆型艾美耳球蟲的子孢子可溶性抗原免疫的小鼠脾細胞和骨髓瘤細胞融合，再通過間接ELISA方法篩選，得到能產生能對堆型艾美耳球蟲子孢子特異性抗體的細胞株5B4和5G7。單克隆技術效果很明顯，但是還存在很多問題。雖然單克隆抗體的特異性很強，但是它在體內代謝迅速，數(shù)量過少則不能發(fā)揮其免疫特異性，有時部分抗體在體內不能完全發(fā)揮其凝集活性。此外，制備單克隆抗體的技術很煩瑣又費時間，篩選的抗體只能保持天然抗體的活性，有些優(yōu)良抗體基因很容易在傳代中丟失。在制備單克隆抗體時我們要結合基因工程，來彌補在雜交瘤細胞技術和本質上的不足，使單克隆抗體技術更加完善。

[1] 陳明勇.雞柔嫩艾美耳球蟲的免疫預防研究[D].中國農業(yè)大學，1997.

[2] LONG P L，ROSE M E.Immunity to coccidiosis：Effect of serum antibodies on cell invasion by sporozoites of Eimeria in vitro [J]. Parasitology，1972，（65）：4372-4451.

[3] 樊生超，姚惠娟.艾美耳球蟲弱毒蟲株的返祖性[J].上海農業(yè)學報，1996，12（4）：63-65.

[4] 樊玉娟.毒害艾美耳球蟲和柔嫩艾美耳球蟲雞胚傳代研究[D].新疆農業(yè)大學，2009.

[5] MCDONALD V，SHIRLEY M W，BELLATT I M A.Eimeria maxima：characteristics of attenuated lines obtained by selection for precocious development in the chicken [J].Experiment Parasitology，1986，61（2）：1922-2001

[6] 史宗勇，趙建，史新濤，等.毒害艾美耳球蟲早熟株致病性與繁殖力的研究[N].農學學報，2011，（5）：46-50.

[7] 段家樹，程金科，趙樹英.雞球蟲病疫苗免疫防治縱橫談（上）[J].當代畜牧，1994，（1）：22-51.

[8] 吳兆敏，蔣麗霞，戴一洪，等.NTG處理柔嫩艾美耳雞球蟲誘導雛雞保護性免疫的研究[J].中國畜禽傳染病，1991，（5）：142-161.

[9] JENKINS M C，SEFERIAN P C，AUGUSTINE P C，et al.Protective immunity against coccidiosis elicited by radiation-attenuated Eimeria maxima sporozoites that are incapable of asexual development[J].Avian Disease，1993，（37）：74-82.

[10] JianfeiZhang，EricWilson，ShiguangYang，等.經(jīng)細胞培養(yǎng)與雞體交替?zhèn)鞔蓝蛳x原代雞腎細胞適應株[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，1998，23（1）：45-47.

[11] 徐占云，秦睿玲，李繼連，等.柔嫩艾美耳球蟲λMzp5-7重組抗原的免疫原性研究[J].河北北方學院學報（自然科學版），2006，22（3）：47-50.

[12] 彭昊，許金俊，劉丹丹.巨型艾美球蟲重組蛋白Gam82-Y和重組質粒pcDNA- gam82的免疫保護效果研究[J].中國預防獸醫(yī)學報，2011，（9），33（9）：12-14.

[13] 李安興，蔣金書.柔嫩艾美耳球蟲BJ株SO7基因在大腸桿菌中的表達[J].畜牧獸醫(yī)學報，2000，31（5）：469-474.

[14] 潘曉亮，丁熙成.TA4和EtMIC2表達產物免疫后對感染柔嫩艾美耳球蟲雞增重和盲腸卵囊數(shù)的影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2002，（8）：6-7.

[15] Song K D，Lillehoj H S，Choi K D.A DNA vaccine encoding a conserved Eimeria protein induces protective immunity against live Eimeria acervulina challenge[J].Vaccine，2000，19（2-3）：243-252.

[16] 李文超，顧有方，杜玲，等.柔嫩艾美耳球蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑基因核酸 疫苗的免疫保護效果[J].中國生物制品學雜志，2013（06），26（4）：452-455.

[17] 吳紹強.雞球蟲核酸疫苗的研究[D].中國農業(yè)大學，2003.

[18] 杜愛芳，王素華，胡松華，等.減毒沙門氏菌為載體傳遞雞球蟲DNA疫苗的安全性、穩(wěn)定性與免疫原性[J].中國獸醫(yī)學報，2006，26（2）：147-150.

[19] 王承民，秦建華，趙月蘭，等.堆型艾美耳球蟲單克隆抗體細胞株的建立[J].中國獸醫(yī)學報，2004，24（1）：26-28.

康桂英（1976-），女，內蒙古涼城人，碩士，主要從事寄生蟲及寄生蟲病的研究。

項目來源：內蒙古民族大學科學研究基金資助項目（項目編號：NMD1215）