DNA甲基化/去甲基化與哺乳動(dòng)物胚胎的體外發(fā)育

蘇文龍，李璐，曹慧，倪俊卿，馬亞賓，李俊杰，3*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北保定071000；2.河北省畜牧良種工作站，河北石家莊050061；3.河北省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，河北保定071000）

DNA甲基化/去甲基化與哺乳動(dòng)物胚胎的體外發(fā)育

蘇文龍1，李璐1，曹慧1，倪俊卿2，馬亞賓2，李俊杰1，3*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北保定071000；2.河北省畜牧良種工作站，河北石家莊050061；3.河北省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，河北保定071000）

DNA甲基化及去甲基化是哺乳動(dòng)物表觀遺傳修飾的主要方式之一，與哺乳動(dòng)物胚胎的發(fā)育密切相關(guān)。因此深入研究DNA甲基化與去甲基化的發(fā)生機(jī)制，對(duì)于改善早期胚胎的發(fā)育具有重要意義。本文對(duì)哺乳動(dòng)物胚胎早期發(fā)育過程中的DNA甲基化動(dòng)態(tài)修飾進(jìn)行了綜述。

DNA甲基化；DNA去甲基化；胚胎；體外發(fā)育

DNA甲基化/去甲基化與哺乳動(dòng)物胚胎的發(fā)育密切相關(guān)，其可通過基因沉默、印跡清除和重建、X染色體失活等方式作用于胚胎發(fā)育。大量研究證實(shí)，胚胎的早期發(fā)育階段是DNA甲基化水平變化最強(qiáng)烈的階段之一，如在此期間發(fā)生DNA甲基化的異常，則會(huì)導(dǎo)致胚胎的死亡及出生后各種遺傳病的發(fā)生。研究表明，DNA甲基化水平過高很可能是其體外發(fā)育能力和質(zhì)量低下的重要原因［1-3］?？梢姡珼NA甲基化修飾在胚胎發(fā)育過程中起著重要的作用。本文對(duì)此加以綜述，以便于深入探討DNA甲基化/去甲基化與胚胎體外發(fā)育的關(guān)聯(lián)機(jī)制。

1 DNA甲基化

DNA甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（Dnmts）的作用下，將S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到DNA特定核苷酸堿基上的過程。在哺乳動(dòng)物中，DNA甲基化修飾主要發(fā)生在CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基上，形成5-甲基胞嘧啶（5-mC），在基因組中呈不均勻分布。通常將基因組中CpG二核苷酸豐富的區(qū)域稱為CpG島，這些CpG島主要分布在基因的5′端，如啟動(dòng)子區(qū)域、非翻譯區(qū)及第一外顯子區(qū)域。DNA甲基化與基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，甲基化程度越高，基因的表達(dá)程度越低。其機(jī)制當(dāng)胞嘧啶被甲基化后，5-mC則突出至DNA雙螺旋大溝中，從而干擾了轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合；甲基化CpG島可與序列特異性甲基化連接蛋白或甲基化CpG結(jié)合蛋白結(jié)合，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子不能與基因形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物［4］，致使基因不能轉(zhuǎn)錄。

Dnmts家族是與DNA甲基化修飾密切相關(guān)的酶類，目前認(rèn)為，Dnmts家族包括Dnmt1、Dnmt2、Dnmt3a、Dnmt3b和Dnmt3L，在小鼠中，從受精卵原核期到1-細(xì)胞期，Dnmt1低濃度分布于胞質(zhì)中，從2-細(xì)胞開始，散布于整個(gè)細(xì)胞［5］。Dnmt1對(duì)于胚胎的早期發(fā)育是必要的，負(fù)責(zé)維持印跡基因的甲基化模式，其缺乏或者過量均會(huì)導(dǎo)致胚胎的死亡［6］。另外，胚胎形成過程中，在許多種基因序列中可通過Dnmt3a和Dnmt3b催化發(fā)生全新甲基化，Dnmt3a-/-小鼠在出生4周后死亡，Dnmt3b-/-小鼠在出生前死亡［7］?？梢?，Dnmts在早期胚胎發(fā)育中是不可或缺的。

2 DNA去甲基化

DNA去甲基化是指5-甲基胞嘧啶（5-mC）被胞嘧啶代替的過程，可分為主動(dòng)去甲基化與被動(dòng)去甲基化。被動(dòng)去甲基化常見于細(xì)胞分裂S期，DNA復(fù)制時(shí)維持性甲基轉(zhuǎn)移酶類失活，進(jìn)而導(dǎo)致新合成的DNA鏈未被甲基化。主動(dòng)去甲基化則是在相關(guān)酶的作用下，將甲基基團(tuán)移去的過程。在哺乳動(dòng)物的個(gè)體發(fā)育中，配子發(fā)生和早期胚胎的發(fā)育期均涉及了基因組范圍的主動(dòng)去甲基化反應(yīng)［8］。但哺乳動(dòng)物中引起DNA主動(dòng)去甲基化的酶及相關(guān)機(jī)制尚存在爭(zhēng)論。綜合起來，主要有以下幾種潛在機(jī)制：①存在切除5-mC的DNA轉(zhuǎn)葡糖基酶，切除5-mC產(chǎn)生脫嘌呤嘧啶位點(diǎn)（AP位點(diǎn)），進(jìn)而啟動(dòng)堿基切除修復(fù)途徑，用胞嘧啶C取代5-mC，最終完成DNA的去甲基化。研究發(fā)現(xiàn)，一些從Hela細(xì)胞核抽提物中純化的酶可以通過DNA轉(zhuǎn)葡糖基酶機(jī)制起始DNA的去甲基化［9］。②存在特異性識(shí)別5-mC的脫氨酶，通過脫氨作用將5-mC轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶，形成G/T錯(cuò)配。進(jìn)而由識(shí)別G/ T錯(cuò)配的糖苷酶啟動(dòng)堿基切除修復(fù)途徑，完成DNA的去甲基化。③通過核苷酸切除修復(fù)（NER）途徑切除含有5-mC的一段DNA，并用含有未修飾胞嘧啶的同樣序列進(jìn)行替換，進(jìn)而完成DNA的去甲基化。④通過氧化作用完成DNA去甲基化。Tahiliani等［10］發(fā)現(xiàn)，DNA雙加氧酶Tet1蛋白在體外可以將5-甲基胞嘧啶氧化成5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC），最終轉(zhuǎn)化成非甲基化的胞嘧啶。⑤通過水解作用由氫原子取代甲基基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)DNA去甲基化。

3 DNA甲基化與胚胎發(fā)育

在哺乳動(dòng)物的個(gè)體發(fā)育中，從受精至著床前的早期胚胎發(fā)育期DNA甲基化譜式經(jīng)歷了一次大規(guī)模的重編程過程［8］。受精后會(huì)經(jīng)歷一次整個(gè)基因組范圍內(nèi)的DNA去甲基化事件，然后依據(jù)動(dòng)物種類不同，在胚胎發(fā)育的某一時(shí)期（大部分在桑椹胚或囊胚期）會(huì)發(fā)生一次全基因組范圍內(nèi)的DNA重新甲基化。DNA甲基化通過作用于基因（尤其是印記基因）的表達(dá)來影響早期胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育。受精后的DNA甲基化變化對(duì)哺乳動(dòng)物早期胚胎的發(fā)育起著決定性作用［1］。

3.1 體外受精（IVF）胚胎發(fā)育過程中DNA甲基化的動(dòng)態(tài)變化哺乳動(dòng)物成熟的精子和卵母細(xì)胞的基因組均是高度甲基化的，受精后二者發(fā)生了廣泛的去甲基化和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的重構(gòu)，從而使精子和卵母細(xì)胞DNA上截然不同的遺傳外標(biāo)記被重塑成了一種胚胎模式。研究發(fā)現(xiàn)，受精后6～8 h小鼠雄原核會(huì)快速發(fā)生DNA主動(dòng)的去甲基化［11］；與之相比，雌原核的去甲基化則是逐步、被動(dòng)和DNA復(fù)制依賴性的，并且發(fā)生于受精卵第一次DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂后，這與細(xì)胞核中維持DNA甲基化水平的酶——Dnmtl的丟失有關(guān)。在小鼠、大鼠、豬、牛和人類的受精卵中，均存在雄原核快速主動(dòng)去甲基化的過程［12］，但在綿羊、山羊和兔受精卵中未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象，這可能是不同物種間的差異造成的。

隨后受精卵發(fā)生卵裂，同時(shí)繼續(xù)發(fā)生DNA去甲基化。小鼠體外受精胚胎DNA甲基化水平從2-細(xì)胞逐步降低一直持續(xù)到桑椹胚階段；牛受精卵基因組首先發(fā)生主動(dòng)去甲基化，之后甲基化水平進(jìn)一步下降直到8-細(xì)胞期［2］。綿羊體外受精胚胎從2-細(xì)胞期到4-細(xì)胞期，甲基化水平?jīng)]有明顯下降，8-細(xì)胞期呈現(xiàn)明顯的低甲基化狀態(tài)［13］；豬的去甲基化過程發(fā)生于受精后至4-細(xì)胞階段［1］；人類體外受精胚胎在桑椹胚階段甲基化水平降至最低［14］。

附植前胚胎發(fā)生重新甲基化的時(shí)間因動(dòng)物種類不同而存在差異，小鼠胚胎的重新甲基化開始于囊胚階段，而牛16-細(xì)胞期時(shí)甲基化水平開始上升［2］，豬的重新甲基化起始于8-細(xì)胞時(shí)期［9］，綿羊桑椹胚時(shí)甲基化水平明顯上升［13］，人體外受精胚胎重新甲基化通常起始于早期囊胚［14］。

在囊胚階段，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（inner cell mass，ICM）將發(fā)育成不同的組織和器官，其特異的甲基化模式，對(duì)于植入后胚胎的發(fā)育是至關(guān)重要的。對(duì)不同動(dòng)物早期胚胎甲基化模式研究發(fā)現(xiàn)，小鼠、牛、綿羊的囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞DNA甲基化水平明顯高于滋養(yǎng)層細(xì)胞［2-3］，但在人［14］、恒河猴［15］、兔［16］的囊胚中，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞DNA甲基化水平低于滋養(yǎng)層細(xì)胞。這種現(xiàn)象存在的原因，一方面可能是因?yàn)樵缙谂咛NA甲基化模式存在物種間差異。另一方面可能是因?yàn)榕咛サ捏w外培養(yǎng)條件對(duì)早期胚胎DNA甲基化水平造成的影響［1］。

3.2 核移植胚胎體外發(fā)育過程中DNA甲基化動(dòng)態(tài)變化核移植胚胎的生產(chǎn)需將一個(gè)已分化的、高甲基化水平的體細(xì)胞反分化恢復(fù)全能性，在此過程中供體體細(xì)胞去甲基化顯得尤為重要，另外在核移植胚胎發(fā)育過程中其DNA甲基化水平也發(fā)生了一系列動(dòng)態(tài)變化，因此核移植胚胎的發(fā)育也與DNA甲基化密切相關(guān)。大量研究證實(shí)，核移植胚胎的低生產(chǎn)效率、高死亡率和高流產(chǎn)率與其在不同發(fā)育階段表現(xiàn)出異常的DNA甲基化模式密切相關(guān)［1-3］。利用間接免疫熒光染色方法已經(jīng)在小鼠、牛、綿羊、豬、恒河猴等物種上檢測(cè)不同發(fā)育階段的核移植胚胎與體外受精胚胎的DNA甲基化水平之間的差異，與體外受精胚胎相比，核移植胚胎的多個(gè)發(fā)育階段均表現(xiàn)出較高的DNA甲基化水平［1-3］。

在牛的核移植早期胚胎中觀察到了不完全的去甲基化事件。Dean等［2］發(fā)現(xiàn)，牛核移植胚胎在1-細(xì)胞期出現(xiàn)主動(dòng)性的去甲基化，但隨后并沒有發(fā)生被動(dòng)性去甲基化，反而在4～8-細(xì)胞期出現(xiàn)從頭甲基化，致使?？芭咂诼蚜亚虻募谆癄顟B(tài)與供核細(xì)胞（成纖維細(xì)胞）相似。其原因可能是體細(xì)胞核中的Dnmtl仍然存在于核移植胚胎中，阻止發(fā)生被動(dòng)的去甲基化。Beaujean等［3］發(fā)現(xiàn)，其2～8-細(xì)胞期的核移植胚胎中染色體的形態(tài)特征與供體細(xì)胞相似，并表現(xiàn)過高的甲基化水平。囊胚中內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞甲基化水平高于滋養(yǎng)層細(xì)胞，但核移植囊胚中滋養(yǎng)層細(xì)胞甲基化水平顯著高于體內(nèi)胚滋養(yǎng)層。Deshmukh等［1］實(shí)驗(yàn)表明，豬核移植胚胎中1-細(xì)胞、2-細(xì)胞、4-細(xì)胞階段甲基化水平顯著高于體內(nèi)胚胎相應(yīng)階段，但從4-細(xì)胞到8-細(xì)胞階段甲基化水平顯著下降，8-細(xì)胞階段甲基化水平達(dá)到最低；早期囊胚和晚期囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞甲基化水平均沒有顯著差異，但顯著高于8-細(xì)胞階段胚胎。

以上研究表明，大多數(shù)哺乳動(dòng)物核移植胚胎在植入前呈過度甲基化狀態(tài)，導(dǎo)致了核移植重構(gòu)胚重新編程順序的紊亂，這可能是導(dǎo)致核移植胚胎發(fā)育能力低下的主要原因之一。故在體細(xì)胞核移植過程中，核移植胚胎附植前建立正確的甲基化模式對(duì)于克隆動(dòng)物正常發(fā)育是必須的。因此，通過何種方法使附植前核移植胚胎甲基化水平趨于正常，從而達(dá)到提高核移植胚胎發(fā)育效率，已成為科學(xué)研究的熱點(diǎn)。

4 DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑在胚胎發(fā)育過程中的應(yīng)用

在體細(xì)胞核移植實(shí)驗(yàn)中要求供體細(xì)胞從分化狀態(tài)轉(zhuǎn)變成具有支持胚胎發(fā)育能力的全能性細(xì)胞，這就需要重新思考怎樣在體外降低細(xì)胞基因組DNA的甲基化程度，從而提高供體細(xì)胞、重構(gòu)胚的重編程效率，恢復(fù)細(xì)胞的全能性狀態(tài)。這對(duì)提高核移植獲得的重構(gòu)胚的發(fā)育潛能，提高克隆效率，具有重要的意義。因此，通過抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性，阻斷DNA的高度甲基化來降低體細(xì)胞及核移植重構(gòu)胚甲基化程度的思路已經(jīng)越來越多地受到重視，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑逐漸用于核移植重構(gòu)胚的重編程，從而提高核移植效率。以甲基轉(zhuǎn)移酶為靶點(diǎn)的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為核苷類和非核苷類兩大類。其中核苷類甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑主要有阿扎胞苷（5-azacitidine）、5-氮-2′-脫氧胞苷（5-aza-dC）、折布拉林（zebularine）、法扎拉濱（fazarabine）等。而目前在體細(xì)胞核移植中應(yīng)用最多的是5-氮-2′-脫氧胞苷。

4.1 5-氮-2′-脫氧胞苷在核移植中的應(yīng)用利用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-dC處理供體細(xì)胞，能有效降低其甲基化水平。李俊杰等［17］研究表明，用濃度為0.01 μmol/L的5-aza-dC處理體細(xì)胞和融合后的重構(gòu)胚，能夠提高山羊體細(xì)胞核移植胚胎囊胚率。Huan等［18］研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，用25 nmol/L的5-aza-dC處理重構(gòu)胚24 h，能夠顯著提高豬囊胚率。但是也有研究表明供體細(xì)胞經(jīng)5-aza-dC處理后能降低甲基化水平，但是并不能提高核移植胚胎的發(fā)育率。同一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑在不同動(dòng)物核移植中去得到完全不同的結(jié)果，除了物種的差異外，很大程度上可能是因?yàn)樵撍幬锞哂械亩靖弊饔?。多?xiàng)研究證實(shí)，5-aza-dC本身有一定的毒性，Chai等［19］報(bào)道，5-aza-dC具有細(xì)胞毒性和致突變效應(yīng)。并且在水溶液中的半衰期短，影響了這些藥物的遞送。雖然5-aza-dC在一定程度上可以提高核移植效率，但是由于其具有一定的毒性從而影響了使用效果。

4.2 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑Zebularine在體細(xì)胞核移植中應(yīng)用的研究與5-aza-dC相比，另一核苷類甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑Zebularine擁有更低的毒性，和更高的穩(wěn)定性，半衰期也較長(zhǎng)，在中性水溶液中非常穩(wěn)定。Cheng等［20］研究發(fā)現(xiàn)，zebularine對(duì)Dnmts的抑制表現(xiàn)出很高的選擇性。因此，zebularine也可以應(yīng)用到體細(xì)胞核移植中，降低供體細(xì)胞和核移植重構(gòu)胚的甲基化水平，從而提高核移植效率。Diao等［21］實(shí)驗(yàn)表明，分別用經(jīng)過5 nmol/L的5-aza-dC，zebularine處理的供體細(xì)胞進(jìn)行核移植后，囊胚率顯著高于對(duì)照組，并且zebularine的處理效果優(yōu)于5-aza-dC的處理效果。Saha等［22］研究表明，使用濃度為5 nmol/L的5-aza-d C和zebularine處理核移植重構(gòu)胚，zebularine組的囊胚率顯著高于5-aza-dC實(shí)驗(yàn)組的囊胚率。因此，在核移植胚胎生產(chǎn)中，zebularine是比5-aza-dC更好的選擇。

綜上所述，哺乳動(dòng)物胚胎的發(fā)育過程中，DNA甲基化修飾發(fā)揮著重要的作用，但是關(guān)于DNA甲基化的啟動(dòng)機(jī)制和作用機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展尤其是熒光實(shí)時(shí)定量PCR、基因芯片的應(yīng)用，將拓寬對(duì)DNA甲基化在胚胎發(fā)育中作用的認(rèn)識(shí)。同時(shí)，深入研究體細(xì)胞和卵母細(xì)胞的DNA甲基化修飾，選擇合適的去甲基化藥物利于完善生物重編程機(jī)制，對(duì)改善動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)和輔助生殖技術(shù)將具有重要意義。

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Relationship between DNA Methylation/Demethylation and the in vitro Development of Mammalian Embryos

SU Wen-long1,LI Lu1,CAO Hui1,NI Jun-qing2,MA Ya-bin2,LI Jun-jie1,3*
（1.College of Animal Science and Technology,College of Veterinary Medicine,Agricultural University of Hebei, Hebei Baoding 071000,China；2.The Hebei Provincial Station for Livestock Varieties Producing and Spreading, Shijiazhuang 050061,China；3.Research Center of Cattle and Sheep Embryo Engineering Technique of Hebei,Hebei Baoding 071000,China）

DNA methyla tion/demethylation,one of the chief ways of epigenetic modification,is closely related to the mammalian embryo development.Therefore,making further research for the mechanism of DNA methylation/ demethylationhas important significance for improving the development of early embryos.This paper summarizes the dynamic modification of DNA methylation during the development of mammalian embryos.

DNA methylation；DNA demethylation；embryo；in vitro development

S814.2

A

0258-7033（2015）09-0068-04

2014-05-09；

2014-07-04

河北省自然科學(xué)基金（C2014204119）；河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系奶牛產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助

蘇文龍（1988-），男，河南焦作人，在讀碩士研究生，主要從事動(dòng)物繁殖調(diào)控研究，E-mail：suwenlong198865@163.com

*通訊作者：李俊杰，男，博士，教授，E-mail：lijunjie816@163.com