MMP-8在不同轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細胞株的差異性表達及其對肝癌細胞遷移侵襲的影響

陳軍澤，覃貴慧，駱　敏，陽　潔(.廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科，.廣西醫(yī)科大學藥學院藥理學教研室，廣西南寧　5300)

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MMP-8在不同轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細胞株的差異性表達及其對肝癌細胞遷移侵襲的影響

陳軍澤1，覃貴慧2，駱敏2，陽潔2
(1.廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科，2.廣西醫(yī)科大學藥學院藥理學教研室，廣西南寧530021)

The differential expression of matrix metalloproteinase-8 in human hepatocellular carcinoma cell lines with different metastatic potential and its influence on invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma cell lines

CHEN Jun-ze1，QIN Gui-hui2，LUO-Min2，YANG-Jie2(1.Dept of Hepatobiliary Surgery，Affiliated Cancer Hospital，Guangxi Medical University，2.Dept of Pharmacology，School of Pharmacy，Guangxi Medical University，Nanning Guangxi，530021，China)

網(wǎng)絡出版時間:2015－6－5 11:22網(wǎng)絡出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150605.1122.031.html

E-mail:455622006@ qq.com;

陽潔(1978－)，女，博士，副教授，碩士生導師，研究方向:腫瘤藥理學，通訊作者，Tel: 0771-5350258，E-mail: yanglz2005@126.com

基質(zhì)金屬蛋白酶-8(matrix metalloproteinases-8，MMP-8)屬于基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)家族，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，MMP-8在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中具有雙重作用，在不同的腫瘤中，既可促進腫瘤的進展，又可抑制腫瘤的進展［1］。但目前，MMP-8與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系尚不清楚。本研究通過觀察不同轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細胞株的MMP-8表達情況，以及過表達MMP-8對肝癌細胞遷移侵襲的影響，以期為尋找抑制肝癌轉(zhuǎn)移侵襲的分子靶點提供新的實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料實驗所用細胞株均購自美國ATCC，pcDNA3.1-MMP-8重組質(zhì)粒由中國廣州賽業(yè)生物科技有限公司構(gòu)建并測序證實;兔抗人MMP-8及β-actin一抗、HRP標記的羊抗兔二抗均購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及篩選細胞株用含胎牛血清、青霉素及鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。按文獻方法［2］構(gòu)建人MMP-8表達載體并用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染低表達MMP-8人肝癌細胞株，72 h后，以G418篩選穩(wěn)定過表達MMP-8的陽性克隆，Western blot鑒定轉(zhuǎn)染后MMP-8過表達效率。

1.2.2 MMP-8 mRNA及蛋白表達水平檢測提取各組細胞的總RNA和蛋白質(zhì)，按照試劑說明書進行RT-PCR及Western blot實驗。擴增MMP-8的上游引物: 5'-GACGCTTCCATTTCTGCT-3，下游引物: 5'-TAGTGCCATTCTTCCTTG-3'。內(nèi)參GAPDH的上游引物: 5'-GTCGGAGTCAACGGATTTGG-3'，下游引物: 5'-AAAAGCAGCCCTGGTGACC-3'。分別以GAPDH、β-actin為內(nèi)參對MMP-8條帶進行灰度分析。

1.2.3劃痕、侵襲實驗檢測細胞遷移能力按文獻方法［3］進行劃痕、侵襲實驗檢測細胞株遷移侵襲能力，用遷移率代表細胞遷移愈合能力。遷移距離=原劃痕寬度－現(xiàn)劃痕寬度，遷移率/% =(原劃痕寬度－現(xiàn)劃痕寬度/原劃痕寬度)×100%。相對侵襲率/% =處理組侵襲細胞數(shù)/對照組侵襲細胞數(shù)×100%。

2　結(jié)果

2.1正常人肝細胞株及不同轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細胞株中MMP-8的mRNA和蛋白表達情況結(jié)果顯示，MMP-8的mRNA及蛋白在正常人肝細胞株及不同轉(zhuǎn)移潛能的四株肝癌細胞中均有表達，且高轉(zhuǎn)移潛能的SK-Hep1、HCCLM3的MMP-8 mRNA及蛋白表達水平較正常人肝細胞株HL7702及低轉(zhuǎn)移潛能的HepG2、SMMC-7721的MMP-8 mRNA及蛋白表達水平明顯增高(P＜0. 01)。而HepG2、SMMC-7721與HL7702的MMP-8 mRNA及蛋白表達水平差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0. 05)。

2.2過表達MMP-8對人肝癌細胞株遷移、侵襲能力的影響結(jié)果顯示，SK-Hep1、HCCLM3比HepG2、SMMC-7721的遷移侵襲能力更強(P＜0. 01)，而SK-Hep1與HCCLM3、以及HepG2與SMMC-7721的遷移能力差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0. 05)。MMP-8過表達后，HepG2-MMP-8組及SMMC-7721-MMP-8組細胞的遷移、侵襲能力均比HepG2-vector組及SMMC-7721-vector組細胞明顯增強(P＜0. 01)，而HepG2-vector組及SMMC-7721-vector組和相應的野生組的遷移、侵襲能力差異均沒有統(tǒng)計學意義(P＞0. 05)。

3　討論

MMP-8與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。近年的研究表明，MMP-8在腫瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移中具有雙重作用。Korpi等［4］發(fā)現(xiàn)，MMP-8表達與改善舌癌患者生存呈正相關(guān)，且MMP-8缺失小鼠比野生型小鼠的舌癌發(fā)生率明顯增高;而Stadlmann等［5］報道，MMP-8在人卵巢癌組織中高表達，能明顯增強卵巢癌細胞的侵襲潛能。此外，血清MMP-8水平低的肝癌患者總生存率明顯高于血清MMP-8水平高的肝癌患者，提示血清MMP-8水平可作為預測肝癌預后的一個指標［6］。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，MMP-8在高轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細胞SK-Hep1、HCCLM3中高表達，在正常人肝細胞HL7702及低轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細胞HepG2、SMMC-7721中低表達，且MMP-8的表達水平與肝癌細胞的遷移及侵襲能力呈正相關(guān)。過表達MMP-8能明顯增強低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細胞HepG2 和SMMC-7721的遷移及侵襲能力。這些結(jié)果提示，MMP-8表達水平與肝癌細胞的遷移侵襲潛能呈正相關(guān)，MMP-8可促進肝癌細胞的惡性進展。

近期研究發(fā)現(xiàn)，許多MMPs能誘導腫瘤細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，從而促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。例如，MMP-2、-3、-7、-9、-13、-14可分別誘導黑色素瘤、纖維肉瘤、肺腺癌細胞等腫瘤細胞發(fā)生EMT、減少粘附，增加遷移和侵襲能力［7-8］。因此，我們推測，MMP-8促進肝癌細胞遷移侵襲的機制可能也與誘導肝癌細胞的EMT轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。

綜上所述，我們的研究證實了MMP-8在高轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細胞中高表達，并能促進肝癌細胞的遷移和侵襲。但MMP-8促進肝癌細胞侵襲遷移的機制，以及能否真正成為肝癌的藥物干預靶點及獨立的預后指標還需要進一步的研究證實。

參考文獻:

［1］Dejonckheere E，Vandenbroucke R E，Libert C.Matrix metalloproteinase 8 has a central role in inflammatory disorders and cancer progression［J］.Cytokine Growth Factor Rev，2011，22(2): 73－81.

［2］Siller-Lopez F，Garcia-Banuelos J，Hasty K A，et al.Truncated active matrix metalloproteinase-8 gene expression in HepG2 cells is active against native type I collagen［J］.J Hepatol，2000，33(5): 758－63.

［3］楊云，董琳，黃圣旺，等.硫化氫下調(diào)MMP-9的表達抑制肝癌HepG2細胞的遷移［J］.中國藥理學通報，2013，29(12): 1676－9.

［3］Yang Y，Dong L，Huang S W，et al.Hydrogen sulfide downregulates MMP-9 expression and inhibits migration of HepG2 cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29(12):1676－9.

［4］Korpi J T，Kervinen V，Maklin H，et al.Collagenase-2(matrix metalloproteinase-8)plays a protective role in tongue cancer［J］.Br J Cancer，2008.98(4):766－75.

［5］Stadlmann S，Pollheimer J，Moser P L，et al.Cytokine-regulated expression of collagenase-2(MMP-8)is involved in the progression of ovarian cancer［J］.Eur J Cancer，2003，39(17): 2499－505.

［6］Lempinen M，Lyytinen I，Nordin A，et al.Prognostic value of serum MMP-8，-9 and TIMP-1 in patients with hepatocellular carcinoma［J］.Ann Med，2013，45(7):482－7.

［7］Egeblad M，Werb Z.New functions for the matrix metalloproteinases in cancer progression［J］.Nat Rev Cancer，2002，2(3): 161 －74.

［8］McGuire J K，Li Q，Parks W C.Matrilysin(matrix metalloproteinase-7)mediates E-cadherin ectodomain shedding in injured lung epithelium［J］.Am J Pathol，2003，162(6):1831－43.

中國圖書分類號: R345.9; R73-37; R735.702.2; R977.3

關(guān)鍵詞:基質(zhì)金屬蛋白酶-8;肝癌細胞;遷移;侵襲;轉(zhuǎn)染;逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應;蛋白免疫印跡

Key words:matrix metalloproteinase-8; hepatocellular carcinoma cell lines; migration; invasion; transfection; RT-PCR; Western blot

基金項目:廣西自然科學基金青年基金項目(No 2012GXNSFBA053096)

作者簡介:陳軍澤(1988－)，男，碩士生，研究方向:腫瘤學，外科學，

收稿日期:2015－03－08，修回日期:2015－04－09

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978(2015)07－1035－02

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.07.031