柔嫩艾美耳球蟲(chóng)保護(hù)性抗原應(yīng)用研究進(jìn)展

周芳玉，王春鳳，楊桂連

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林省動(dòng)物微生態(tài)制劑工程研究中心，長(zhǎng)春130118)

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柔嫩艾美耳球蟲(chóng)保護(hù)性抗原應(yīng)用研究進(jìn)展

周芳玉，王春鳳，楊桂連*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林省動(dòng)物微生態(tài)制劑工程研究中心，長(zhǎng)春130118)

雞球蟲(chóng)病是一種重要的雞寄生蟲(chóng)病，長(zhǎng)期以來(lái)藥物防治成為抗球蟲(chóng)病的主要手段，但由于藥物的殘留和耐藥性等問(wèn)題，使得雞球蟲(chóng)病的免疫學(xué)研究受到廣泛關(guān)注。本文對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)不同發(fā)育階段重要的免疫保護(hù)性抗原研究進(jìn)行了綜述，旨在為雞球蟲(chóng)病的免疫防治提供新思路和參考。

雞球蟲(chóng)??；保護(hù)性抗原；免疫防治

雞球蟲(chóng)病是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的寄生蟲(chóng)病，主要是由艾美耳屬的9種球蟲(chóng)引起。雞只感染后導(dǎo)致大量腸上皮細(xì)胞受損而出血,產(chǎn)生血便,導(dǎo)致體重下降，飼料吸收率降低，嚴(yán)重時(shí)造成雞只大量死亡，給養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)不可估量的損失[1]。目前雞球蟲(chóng)病主要以化學(xué)藥物防治為主，但由于存在藥物耐受和殘留問(wèn)題，其應(yīng)用受到限制。由于疫苗防治雞球蟲(chóng)病具有潛在的優(yōu)越性，越來(lái)越多的研究人員將研究目標(biāo)轉(zhuǎn)移到了疫苗的研制。通過(guò)免疫蛋白組學(xué)方法，從基因水平向蛋白質(zhì)水平的深化，發(fā)現(xiàn)更多新的具有較強(qiáng)免疫原性和免疫保護(hù)性的球蟲(chóng)保護(hù)性抗原，為球蟲(chóng)疫苗今后發(fā)展的方向。本文對(duì)近年來(lái)雞球蟲(chóng)保護(hù)性抗原在球蟲(chóng)病免疫防治中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，旨在為雞球蟲(chóng)免疫預(yù)防提供參考。

1 柔嫩艾美耳球蟲(chóng)不同階段的保護(hù)性抗原蛋白

相關(guān)研究人員采用免疫蛋白組學(xué)方法對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)生活史中三個(gè)不同階段的可刺激宿主產(chǎn)生抗體的蛋白分別進(jìn)行了篩選，以期發(fā)現(xiàn)新的免疫保護(hù)性蛋白[2]。

1.1 未孢子化卵囊中的保護(hù)性抗原蛋白 相關(guān)研究人員通過(guò)免疫蛋白組學(xué)在球蟲(chóng)未孢子化卵囊中發(fā)現(xiàn)14種柔嫩艾美耳球蟲(chóng)已知蛋白，這些蛋白包括乳酸脫氫酶、烯醇酶、肌動(dòng)蛋白解聚因子、免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白、丙酮酸激酶、β微管蛋白、柔嫩艾美耳球蟲(chóng)假定蛋白、子孢子抗原等[2-3]。

1.2 孢子化卵囊中的保護(hù)性抗原蛋白 采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法在柔嫩艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊中發(fā)現(xiàn)22種柔嫩艾美耳球蟲(chóng)已知蛋白，包括乳酸脫氫酶、烯醇酶、14-3-3蛋白、微線蛋白、微管蛋白、子孢子抗原、表面抗原10、微線蛋白3、柔嫩艾美耳球蟲(chóng)未知蛋白、烯醇酰基還原酶和轉(zhuǎn)氫酶等[2-3]。

1.3 柔嫩艾美耳球蟲(chóng)第二代裂殖子中的保護(hù)性抗原蛋白 同樣采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法在柔嫩艾美耳球蟲(chóng)第二代裂殖子中發(fā)現(xiàn)26種柔嫩艾美耳球蟲(chóng)已知蛋白包括乳酸脫氫酶、烯醇酶、14-3-3蛋白、微線蛋白、微管蛋白、表面抗原等[4-5]。

2 柔嫩艾美耳球蟲(chóng)幾種主要免疫保護(hù)性抗原蛋白的應(yīng)用

通過(guò)對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)三個(gè)不同階段的免疫保護(hù)性抗原蛋白的分析，發(fā)現(xiàn)其中幾種蛋白在抗球蟲(chóng)病方面具有重要的研究?jī)r(jià)值。主要包括微線蛋白、棒狀蛋白、折光體蛋白、表面抗原、子孢子抗原、菱形蛋白、乳酸脫氫酶等。

2.1 微線蛋白(Microneme Protein,MIC) 頂復(fù)門(mén)寄生蟲(chóng)的微線蛋白多數(shù)由與高等真核細(xì)胞黏附蛋白高度同源的系列調(diào)節(jié)基序組成，如Ⅰ型凝血酶致敏蛋白重復(fù)域(Thrombospondin Type ⅠLike Repeats,TRS)，表皮生長(zhǎng)因子重復(fù)域(Epidermal Growth Factor Repeats，EGF)，血管性血友病因子A(von Willibrand Factor Type A Domain,vWA)，半乳糖凝集素和蘋(píng)果結(jié)構(gòu)域(Apple/PAN domains)，球蟲(chóng)大部分的MIC蛋白能夠與宿主細(xì)胞的葡聚糖特異性結(jié)合并建立頂端元件。MIC蛋白表達(dá)多變結(jié)構(gòu)域能夠黏附宿主細(xì)胞低聚糖表位，在球蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。MIC蛋白多以多價(jià)異聚體復(fù)合物形式存在，先由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成，然后運(yùn)送到微線體。每個(gè)微線體蛋白復(fù)合物有一個(gè)“護(hù)衛(wèi)蛋白”能讓微線體復(fù)合物與滑動(dòng)體相互作用[6]。目前MIC蛋白被廣泛用于抗球蟲(chóng)病研究中且具有一定的免疫保護(hù)性作用。張杰等[7]從SD-01株柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的第二代裂殖子總RNA中擴(kuò)增并克隆了EtMIC2基因，并進(jìn)一步構(gòu)建真核表達(dá)載體pPIC9-EtMIC2和原核表達(dá)載體PET30a-EtMIC2，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染畢赤酵母和大腸桿菌，使用巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)和大腸桿菌分別表達(dá)了EtMIC2蛋白，并對(duì)雛雞進(jìn)行免疫，兩組免疫組的雛雞體重增長(zhǎng)量與對(duì)照組相比均獲得了較大提高，畢赤酵母和大腸桿菌表達(dá)的EtMIC2蛋白質(zhì)都表現(xiàn)出良好的免疫原性，細(xì)胞因子和抗體水平顯著提高。

2.2 頂膜抗原(Apical Membrane Antigen,AMA) AMA最初在瘧疾寄生蟲(chóng)惡性瘧原蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)，是一個(gè)高度保守的抗原蛋白。AMA是由微線體分泌Ⅰ型跨膜蛋白，由胞質(zhì)區(qū)、跨膜區(qū)、胞外區(qū)組成。E.tenella的基因組中有三個(gè)AMA的編碼序列，分別是AMA1 , AMA2, AMA3。AMA1存在于E.tenella子孢子表面，2012年Jiang等[8]人應(yīng)用表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)(Expressed Sequence Tag,EST) 鑒定了E.terrellaAMA1的cDNA全長(zhǎng)，基因全長(zhǎng)1608 bp,含有一個(gè)開(kāi)放閱讀框，編碼535個(gè)氨基酸，蛋白分子量為58 kDa,實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果表明，AMAl在子孢子階段的表達(dá)水平要高于未孢子化的卵囊、孢子化卵囊和第二代裂殖子，AMA1在E.tenella的入侵和發(fā)育中起著重要的作用[9]。Blake等[10]利用基因圖譜法對(duì)球蟲(chóng)中免疫力最強(qiáng)的巨型艾美耳球蟲(chóng)保護(hù)性抗原進(jìn)行篩選，將兩株具有不同生物學(xué)特性的巨型艾美耳球蟲(chóng)在雞體內(nèi)進(jìn)行雜交后的基因組，與柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的基因組進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與AMA 1具有同源性的抗原可以?xún)?yōu)先刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫力，可以?xún)?yōu)先作為疫苗和藥物開(kāi)發(fā)的研究靶標(biāo)。

2.3 棒狀蛋白(Rhoptry Protein) 棒狀體是球蟲(chóng)體內(nèi)棒狀的細(xì)胞器，能夠分泌倆種不同的蛋白一種是與寄生蟲(chóng)早期入侵相關(guān)的蛋白，為棒狀體頸部區(qū)域蛋白(Rhoptry Neck Proteins, RONs)，一種是分泌較晚的棒狀體球狀區(qū)域蛋白(Rhoptry Proteins, ROPs)，參與帶蟲(chóng)空泡的形成，改變蟲(chóng)泡的內(nèi)環(huán)境，并與宿主細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相互作用，輔助蟲(chóng)體的入侵[11]。ROP蛋白分泌的確切機(jī)制還不清楚。有學(xué)者提出通過(guò)膜結(jié)合MIC復(fù)合物的胞質(zhì)尾觸發(fā)分泌信號(hào)，此復(fù)合物能與宿主細(xì)胞受體作用。棒狀體頸部區(qū)域蛋白(RONs)在入侵早期分泌，對(duì)于MJ[12](移動(dòng)連接)的形成和維持至關(guān)重要。而棒狀體球狀區(qū)域蛋白(ROPs)分泌的稍晚，蟲(chóng)泡形成后RONs與AMAI相互作用，引發(fā)ROPs的釋放。Aikawa等人經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)MJ是蟲(chóng)體的重要結(jié)構(gòu)，能夠起到錨定蟲(chóng)體的作用，繼而產(chǎn)生推力讓寄生蟲(chóng)向前運(yùn)動(dòng)進(jìn)入寄生泡。由微線體分泌到寄生蟲(chóng)表面的跨膜蛋白AMA1與RONs作用能夠啟動(dòng)MJ的形成，寄生蟲(chóng)通過(guò)AMA1錨定在宿主細(xì)胞表面，RONs復(fù)合物分泌入宿主細(xì)胞，然后RON2插入到宿主細(xì)胞膜。AMA1和RON蛋白在艾美爾球蟲(chóng)中是保守的，表明MJ的形成機(jī)制可能也是保守的[13]。王曄等成功構(gòu)建了EtRON2的真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-EtRON2,并在真核細(xì)胞中獲得表達(dá)，為深入研究EtRON2的生物學(xué)功能和研制球蟲(chóng)DNA疫苗奠定了基礎(chǔ)[14]。

2.4 球蟲(chóng)表面蛋白(Surface Antigen，SAGs) 艾美爾球蟲(chóng)子孢子和裂殖子表面有一層糖基磷脂?；?GPI)此蛋白可作為表面抗原(Surface Antigen，SAGs)。有研究表明E.tenella的SAGs能夠黏附多種培養(yǎng)細(xì)胞，證明這些蛋白參與最初的非特異性黏附階段[15]。最近的研究表明，E.tenella表達(dá)多達(dá)80種不同的SAG蛋白，并已證實(shí)這些蛋白在球蟲(chóng)生命周期中的調(diào)節(jié)是有差異的，如第二代裂殖子SAGS表面復(fù)合物要比子孢子和第一代裂殖子中多[16]。SAGS能有效的誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，阻止子孢子入侵細(xì)胞。一項(xiàng)研究10種E.tenella子孢子SAGs的試驗(yàn)表明，其中三種能夠增加雞巨噬細(xì)胞中一氧化氮的產(chǎn)量，提高IL-1β，IL-10的轉(zhuǎn)錄水平，并能降IL-12 IFN-γ轉(zhuǎn)錄水平[17]。這表明至少有部分的SAGs能夠調(diào)節(jié)雞的天然免疫和獲得性免疫反應(yīng)，并刺激細(xì)胞免疫，同時(shí)有促進(jìn)炎癥反應(yīng)，并能在E.tenella感染期間觀察到病理學(xué)變化[18-19]。3-lE基因是眾多表面抗原中的一員，Lillehoj等人用重組的E.acervulina 3-1 E蛋白作為抗原能夠引起機(jī)體的免疫應(yīng)答，刺激淋巴細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生I FN-γ，減少雞球蟲(chóng)卵囊的排出量[20]。余東游等構(gòu)建表達(dá)3-1E抗原基因的重組枯草芽孢桿菌作為活載體疫苗對(duì)肉雞進(jìn)行免疫，結(jié)果表明該活載體疫苗對(duì)肉雞抵抗柔嫩艾美耳球蟲(chóng)感染具有顯著的生理保護(hù)效果[21]。張艷等[22]構(gòu)建了重組表達(dá)載體pGEX-3-1E,并將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中，提取質(zhì)粒經(jīng)酶切PCR鑒定后，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Western blot檢測(cè)顯示，3-1E基因在大腸桿菌中成功表達(dá)，為3-1E基因的原核表達(dá)提供了依據(jù)。

2.5 菱形蛋白(Rhomboid Protein) Rhomboid蛋白自發(fā)現(xiàn)以來(lái)一直吸引著研究者的注意。研究表明Rhomboid蛋白存在球蟲(chóng)發(fā)育階段的各個(gè)時(shí)期，而以未孢子化階段轉(zhuǎn)錄水平最低。作為一類(lèi)膜內(nèi)的絲氨酸蛋白酶，它參與著表皮生長(zhǎng)因子及表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。近年來(lái)人們?cè)诤芏囗斊鏖T(mén)的原蟲(chóng)體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了Rhomboid蛋白的存在，其中包括柔嫩艾美耳球蟲(chóng)。經(jīng)過(guò)對(duì)弓形蟲(chóng)和瘧原蟲(chóng)Rhomboid蛋白的鑒定，發(fā)現(xiàn)Rhomboid蛋白水解其底物MIC蛋白是蟲(chóng)體侵入宿主細(xì)胞的關(guān)鍵過(guò)程[23]。張西臣等通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)研究了倆種蛋白間的相互作用。將含有Rhomboid蛋白、MIC4蛋白以及互作蛋白的酵母細(xì)胞AH109破碎后免疫雛雞，從而進(jìn)行攻蟲(chóng)試驗(yàn)，觀察酵母細(xì)胞中具有互相作用的兩種蛋白對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的動(dòng)物保護(hù)性。結(jié)果說(shuō)明，通過(guò)體液免疫水平和細(xì)胞免疫水平的檢測(cè)，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異均顯著(P<0.05 )，其中含有兩種互作蛋白的實(shí)驗(yàn)組差異極顯著(P<0.01);攻蟲(chóng)試驗(yàn)結(jié)果顯示其ACI可以達(dá)到168.24;同時(shí)試驗(yàn)結(jié)果首次表明酵母細(xì)胞也能夠產(chǎn)生一定的免疫保護(hù)作用[24]。

2.6 乳酸脫氫酶(LactatedehydrogenaseLDH) 球蟲(chóng)乳酸脫氫酶(LactatedehydrogenaseLDH)被認(rèn)為是一種很有潛力的疫苗候選抗原。LDH是一種廣泛分布于微生物、植物和動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的重要功能酶，是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶之一。大多數(shù)體內(nèi)寄生蟲(chóng)的能量來(lái)源于無(wú)氧糖酵解，LDH是該途徑的終端酶，所以，LDH對(duì)于寄生蟲(chóng)生命活動(dòng)的正常進(jìn)行至關(guān)重要。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于寄生蟲(chóng)LDH的研究主要集中在瘧原蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)等[25]。研究LDH對(duì)于促進(jìn)寄生蟲(chóng)病診斷抗原和疫苗研究以及新抗蟲(chóng)藥物的研發(fā)有重要的意義。已有研究表明，每種雞球蟲(chóng)僅有一種LDH，堆型艾美耳球蟲(chóng)、巨型艾美耳球蟲(chóng)和柔嫩艾美耳球蟲(chóng)LDH氨基酸序列的同源性為66%～80%，其蛋白在卵囊、子孢子、裂殖體和裂殖子階段的表達(dá)水平相當(dāng)，被認(rèn)為是一種很有潛力的疫苗候選抗原[26]。王艷歌[27]等構(gòu)建了重組EtLDH蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-EtLDH和pCAGGS-EtLDH-IFN-γ，并轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，通過(guò)免疫印跡和間接免疫熒光的方法證實(shí)EtLDH基因在真核細(xì)胞中成功表達(dá)，為進(jìn)一步研究該蛋白的生物學(xué)功能和研制球蟲(chóng)DNA疫苗奠定了基礎(chǔ)。

2.7 折光體蛋白(FoldingbodyProtein) 球蟲(chóng)子孢子及第一代裂殖體階段都含有折光體，子孢子侵入宿主細(xì)胞后，體內(nèi)的前后兩個(gè)折光體發(fā)生融合, 在球蟲(chóng)裂殖生殖階段,融合體又逐漸發(fā)生分裂,但在第一代裂殖生殖之后逐漸消失。因此，有人推測(cè)折光體內(nèi)可能儲(chǔ)存著子孢子通過(guò)腸道及細(xì)胞內(nèi)發(fā)育前幾小時(shí)所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這可能與蟲(chóng)體的入侵有關(guān)。第一個(gè)報(bào)道的折光體蛋白為GX3262 (亦稱(chēng)EtS07 ), 可用多克隆的高免雞血清在E.tenella的cDNA文庫(kù)中鑒定出來(lái)，用其表達(dá)的蛋白免疫雞后，可使盲腸球蟲(chóng)的病變值下降50%。S07編碼的抗原可作為雞球蟲(chóng)基因工程疫苗的候選之一。楊智勇[28]通過(guò)構(gòu)建pSIP409-SO7-IL2重組乳酸菌免疫雛雞，測(cè)定免疫后各項(xiàng)指標(biāo)，綜合各項(xiàng)數(shù)據(jù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組菌具有優(yōu)秀的保護(hù)效力。從而證明了S07表達(dá)產(chǎn)物能誘導(dǎo)雞產(chǎn)生對(duì)E.tenella的保護(hù)作用。

3 展望

近年來(lái)雞球蟲(chóng)保護(hù)性抗原蛋白的研究發(fā)展迅速，逐步有新的具有免疫原性的球蟲(chóng)抗原被應(yīng)用，球蟲(chóng)保護(hù)性抗原的研究也為雞球蟲(chóng)病免疫預(yù)防提供了重要的方向。但這些疫苗尚處在試驗(yàn)研究階段，還有一些瓶頸技術(shù)有待解決，例如載體的優(yōu)化，球蟲(chóng)保護(hù)性抗原基因的篩選，蛋白質(zhì)如何高效表達(dá)，只能誘發(fā)對(duì)球蟲(chóng)病的部分保護(hù)等。其中主要原因在于部分保護(hù)性抗原只是球蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程中某一階段的抗原，而球蟲(chóng)生活史復(fù)雜，基因組龐大，其保護(hù)性抗原又存在種間差異，因此篩選高度保守性共同抗原，研制多價(jià)聯(lián)合疫苗不失為一種好的方法。另外對(duì)表達(dá)質(zhì)粒載體的優(yōu)化應(yīng)尋找合適的酶切位點(diǎn)，從而提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性。研究表明重組蛋白胞外表達(dá)可以防止胞內(nèi)蛋白酶的降解，所以在實(shí)驗(yàn)研究中可以運(yùn)用表面展示元件使目的蛋白表達(dá)在細(xì)胞表面從而促進(jìn)蛋白胞外分泌。相信隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展和球蟲(chóng)免疫學(xué)以及蛋白組學(xué)研究的不斷深入，以上問(wèn)題都會(huì)逐步得到解決，球蟲(chóng)保護(hù)性抗原的應(yīng)用也會(huì)更加的廣泛，更多的保護(hù)性抗原也會(huì)被應(yīng)用到球蟲(chóng)免疫當(dāng)中。

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(編輯：侯向輝)

Progress ofE.tenellaProtective Antigen

ZHOU Fang-yu, WANG Chun-feng, YANG Gui-lian*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,JilinProvincialEngineeringResearchCenterofAnimalProbiotics,Changchun130118,China)

Chicken coccidiosis is an important parasitic disease of chicken. For a long time drug control becomes the main means of against coccidiosis. But due to drug residue and drug resistance issues, making chicken coccidiosis immunology research attracts a wide spread attention.This paper describes the different developmental stages of research ofE.tenella’s important protective antigen and aims to provide new ideas and references for the prevention and immunity of chicken coccidiosis.

coccidiosis；protective antigen；immune prevention

國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目(2013AA102806, 2011AA10A215); 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31272552， 31272541)； 吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20111816)

周芳玉，在讀碩士生，從事動(dòng)物寄生蟲(chóng)免疫學(xué)研究。

楊桂連。E-mail：yangguilian@jlau.edu.cn

2015-07-17

A

1002-1280 (2015) 09-0065-05

S852.43