動(dòng)脈粥樣硬化斑塊鈣化與microRNA

孫啟玉 賈興旺 田亞平 (承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 承德 067000)

目前研究表明急性心血管事件發(fā)生的主要原因是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化(AS)斑塊的破裂、出血、血栓形成，而和冠狀A(yù)S的嚴(yán)重程度不成正比。冠狀A(yù)S斑塊的鈣化是其病理發(fā)生到一定程度的表現(xiàn)。鈣化使斑塊變硬、變脆，容易碎裂導(dǎo)致急性心血管事件的發(fā)生。

1 AS斑塊鈣化與心血管事件

病理學(xué)上認(rèn)為AS斑塊鈣化發(fā)生時(shí)，在鈣化與非鈣化交界面由于不同的組織密度使其容易受壓破裂。現(xiàn)在越來(lái)越多的證據(jù)表明鈣化可作為AS斑塊穩(wěn)定性的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)，對(duì)冠脈事件的發(fā)生有預(yù)測(cè)價(jià)值。Shemesh等〔1〕對(duì)穩(wěn)定型冠心病患者隨訪觀察發(fā)現(xiàn)CAC(CAC)積分隨時(shí)間進(jìn)展變化。冠狀動(dòng)脈鈣化對(duì)有癥狀患者的預(yù)測(cè)能力得到了廣泛研究。Georgiou等〔2〕對(duì)192例病人進(jìn)行隨訪研究50個(gè)月，發(fā)現(xiàn)CAC積分和冠脈事件的發(fā)生密切相關(guān)，高積分病人發(fā)生不良事件的風(fēng)險(xiǎn)是低或零積分病人的13.2倍。在一項(xiàng)對(duì)458例有急性胸痛且排除急性冠脈綜合征(ACS)的病人研究中，有AS斑塊鈣化的病人比無(wú)鈣化者更易發(fā)生心血管不良事件，其危險(xiǎn)比(HR)分別是86.96與58.06〔3〕。對(duì)穩(wěn)定型心絞痛病人，Rijlaarsdam-Hermsen 等〔4〕的研究表明，CAC積分為陰性的病人在隨訪44個(gè)月時(shí)無(wú)不良事件的發(fā)生，其陰性預(yù)測(cè)價(jià)值是100%。CAC對(duì)于無(wú)癥狀病人冠脈事件也有很好的預(yù)測(cè)能力。一項(xiàng)5 000余例患者的前瞻性觀察研究發(fā)現(xiàn)，與CAC積分＜100的患者相比，＞100的患者4.3年后發(fā)生冠脈事件的相對(duì)危險(xiǎn)度為9.5～10.7〔5〕。Budoff等〔6〕對(duì)無(wú)癥狀患者的研究也發(fā)現(xiàn)死亡率與CAC積分呈正相關(guān)。

鑒于大量有關(guān)AS斑塊鈣化與不良事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的文獻(xiàn)報(bào)道。2005美國(guó)心臟學(xué)會(huì)的一份關(guān)于臨床檢測(cè)女性冠狀動(dòng)脈疾病的聲明寫到低CAC和低不良事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，高CAC預(yù)示高風(fēng)險(xiǎn)的不良事件。建議對(duì)Framingham評(píng)分為中度的病人用CAC來(lái)評(píng)價(jià)AS負(fù)荷〔7〕。歐洲心血管指南也寫到CAC積分是無(wú)癥狀患者未來(lái)發(fā)生心血管事件風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，并獨(dú)立于傳統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)因素〔8〕。

2 AS斑塊鈣化形成機(jī)制及危險(xiǎn)因素

以前人們認(rèn)為血管鈣化是磷酸鹽礦物質(zhì)在壞死組織沉積形成的，近年來(lái)研究表明AS鈣化是一種與新骨形成極為相似的受調(diào)控的主動(dòng)性代謝過(guò)程，其鈣鹽的主要成分是羥磷灰鈣，而不是原來(lái)認(rèn)為的磷酸鈣。AS鈣化出現(xiàn)較早，亞臨床的AS早期就出現(xiàn)了骨相關(guān)蛋白的表達(dá)，當(dāng)脂質(zhì)條紋形成時(shí)，組織學(xué)上就可以檢測(cè)到鈣化的存在〔8〕。

血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)表型的改變認(rèn)為是AS鈣化的關(guān)鍵步驟。Bobryshev等〔9〕用電鏡觀察 ApoE基因敲除鼠 AS模型，發(fā)現(xiàn)AS脂質(zhì)斑塊周圍的平滑肌細(xì)胞表現(xiàn)出軟骨樣細(xì)胞特征，在細(xì)胞間隙有許多含有羥磷灰石結(jié)晶的小囊泡出現(xiàn)，認(rèn)為平滑肌細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞，導(dǎo)致了斑塊鈣化的形成。發(fā)生表型轉(zhuǎn)換的平滑肌細(xì)胞可持續(xù)表達(dá)和鈣化相關(guān)的核因子(NF)-κB受體活化因子配體(RANKL)、核結(jié)合因子 α1(Cbfα1，Runx2)、骨橋蛋白(OPN)、骨鈣素、堿性磷酸酶及骨保護(hù)素(OPG)等〔10，11〕。這些蛋白調(diào)節(jié)骨基質(zhì)的形成，參與鈣化。

炎癥和AS斑塊鈣化的發(fā)生有關(guān)。脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的沉積及氧化應(yīng)激參與粥樣斑塊的形成。炎癥反應(yīng)導(dǎo)致大量活性氧簇(ROS)產(chǎn)生。體外研究表明H2O2可以通過(guò)激活Cbfα1促進(jìn)VSMC由收縮型向成骨型轉(zhuǎn)化〔12〕?？寡趸饔玫母呙芏戎鞍准唉?3多不飽和脂肪酸有抑制血管鈣化的作用〔13，14〕。氧化低密度脂蛋白能促進(jìn)β-甘油磷酸鹽誘導(dǎo)的VSMC成骨樣轉(zhuǎn)化〔15〕。血管鈣化，礦物質(zhì)基質(zhì)的形成又可作用于單核細(xì)胞促進(jìn)炎癥因子的釋放〔16〕。

高血糖、血脂是AS發(fā)生的危險(xiǎn)因素，同時(shí)也是硬化斑塊鈣化的危險(xiǎn)因素。糖尿病患者發(fā)生CAC比非糖尿病患者顯著增加〔17〕。高糖在體外可以通過(guò)增加VSMC中Cbfα1轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，呈時(shí)間依賴性促進(jìn)VSMC的成骨性轉(zhuǎn)化〔18〕。一項(xiàng)6 093例個(gè)體的研究表明高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)與CAC有很好的相關(guān)性，要高于低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)〔19〕。Orakzai等〔20〕對(duì)非高密度脂蛋白(Non-HDL-C)即包含致冠狀動(dòng)脈硬化載脂蛋白B的所有顆粒(極低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、乳糜顆粒、脂蛋白a等)和LDL-C、HDL-C、甘油三酯進(jìn)行比較，認(rèn)為Non-HDL-C和CAC相關(guān)性最強(qiáng)。研究表明血清膽紅素水平〔21〕及游離甲狀腺素水平〔22〕和CAC呈負(fù)相關(guān)，其水平降低是AS斑塊鈣化新的危險(xiǎn)因素。

3 AS斑塊鈣化相關(guān)因子

RANKL/OPG參與AS斑塊鈣化的研究較多。RANKL也稱為腫瘤壞死因子超家族成員(TNFSF)11，是前體破骨細(xì)胞分化、成熟的啟動(dòng)因子，其主要生理功能之一是促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，刺激破骨細(xì)胞活化。在不穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣斑塊中存在RANKL的表達(dá)，來(lái)源于轉(zhuǎn)化的VSMC和內(nèi)皮細(xì)胞，這對(duì)于斑塊中破骨細(xì)胞的生成和功能有重要作用〔23〕。RANKL可以和其跨膜受體RANK結(jié)合，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活MAPK，NF-κB，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞活性。這些細(xì)胞主要是單核細(xì)胞來(lái)源的破骨細(xì)胞前體細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞和樹突細(xì)胞〔24〕。RANKL的促破骨細(xì)胞作用使其表現(xiàn)為抗鈣化因子，能夠降低動(dòng)脈粥樣斑塊的不穩(wěn)定性。然而Sandberg等〔25〕的研究表明RANKL可以增加單核細(xì)胞趨化因子(MCP)-1及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的表達(dá)從而誘導(dǎo)斑塊的不穩(wěn)定性。因此RANKL在AS的確切機(jī)制有待研究。

OPG是破骨細(xì)胞生成抑制因子，在骨代謝調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵性作用，可與RANKL高度親和而阻礙RANKL同RANK的結(jié)合。OPG基因敲除小鼠有嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松，同時(shí)2/3的小鼠腎動(dòng)脈及主動(dòng)脈中膜發(fā)生鈣化〔26〕。OPG能抑制維生素D誘導(dǎo)血管鈣化小鼠模型的動(dòng)脈鈣化，而血清中鈣磷濃度沒有發(fā)生變化，表明OPG對(duì)血管鈣化的抑制作用不是通過(guò)降低血鈣或血磷水平達(dá)到的〔27〕。OPG也可抑制載脂蛋白(Apo)E基因缺陷小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的鈣化〔28〕，表明OPG能夠抑制鈣化，具有保護(hù)作用。Dhore等〔29〕對(duì)尸解標(biāo)本的研究發(fā)現(xiàn)，在血管骨樣組織鈣沉積周圍的細(xì)胞基質(zhì)中可以檢測(cè)到OPG/RANKL，進(jìn)一步證實(shí)OPG/RANKL系統(tǒng)參與 AS和鈣化的過(guò)程。Jono等〔30〕檢測(cè)了201例行冠狀動(dòng)脈造影患者的血清OPG水平，研究結(jié)果顯示冠狀動(dòng)脈狹窄的患者血清OPG水平明顯高于無(wú)冠狀動(dòng)脈狹窄者，且隨著冠脈病變支數(shù)及嚴(yán)重程度增加。Mohammadpour等〔31〕的研究表明血清OPG/RANKL比值和CAC顯著相關(guān)，血清OPG/RANKL有可能成為新的預(yù)測(cè)心血管事件發(fā)生的指標(biāo)。

OPN、胎球蛋白-A(FA)、人基質(zhì)γ羧基谷氨酸蛋白(MGP)及瘦素(LP)是除OPG/RANKL系統(tǒng)外和斑塊鈣化有關(guān)且在血中可檢測(cè)到的蛋白因子。OPN在正常動(dòng)脈不表達(dá)而在鈣化的動(dòng)脈粥樣斑塊處高表達(dá)〔32〕。OPN抑制羥磷灰石的生長(zhǎng)，增加其在酸性環(huán)境的分解〔33〕。體外實(shí)驗(yàn)證明OPN敲除小鼠VSMC更易產(chǎn)生鈣化，表明OPN有抑制鈣化的血管保護(hù)作用〔34〕。Uz等〔35〕認(rèn)為血清OPN水平可以評(píng)價(jià)可疑冠心病人冠狀動(dòng)脈鈣化程度。Minoretti等〔36〕的研究表明血清OPN水平可以預(yù)測(cè)穩(wěn)定心絞痛患者不良心血管事件的發(fā)生，具有危險(xiǎn)分層的價(jià)值。Georgiadou等〔37〕進(jìn)一步證明血清OPN水平在缺血性心臟疾病有很好預(yù)測(cè)價(jià)值。

FA在肝臟表達(dá)后進(jìn)入血液循環(huán)，主要聚集在骨骼。FA的N端富含酸性氨基酸殘基，與堿性磷酸鈣結(jié)合形成可溶性無(wú)定形膠體微球，從而增加其溶解度，抑制血清過(guò)飽和的鈣磷鹽沉積。研究表明VSMC攝取FA后其鈣化能力降低〔38〕。在血液透析患者，低血清FA水平和CAC相關(guān)〔39〕。但另一項(xiàng)研究認(rèn)為血清FA水平和CAC無(wú)關(guān)〔35〕。

MGP能夠直接抑制血管壁礦物質(zhì)的沉積，也可通過(guò)抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2和BMP-4的活性抑制VSMC的成骨性轉(zhuǎn)化〔40，41〕。MGP抑制血管鈣化的活性依賴于其谷氨酸殘基的羧基化，而維生素 K是催化這一反應(yīng)的必需輔助因子〔42〕。MGP敲除小鼠動(dòng)脈自發(fā)發(fā)生鈣化，其平滑肌細(xì)胞失去一些收縮型標(biāo)志物，而Cbfa1、OPN及骨鈣素和這些成骨相關(guān)的蛋白表達(dá)增加〔43〕。一項(xiàng)臨床實(shí)驗(yàn)表明對(duì)于可疑冠心病患者，血清MGP水平和CAC呈負(fù)相關(guān)〔44〕。但另一項(xiàng)研究卻表明血清MGP水平和AS的危險(xiǎn)因素相關(guān)，而和動(dòng)脈鈣化無(wú)關(guān)〔45〕。

LP是一種脂肪組織分泌的肽類激素，進(jìn)入血液循環(huán)后作用于LP受體，參與糖、脂肪及能量代謝的調(diào)節(jié)。LP有增加血管內(nèi)皮細(xì)胞氧自由基生成，促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增生，MMP表達(dá)等多種生物學(xué)效應(yīng)。促進(jìn)AS發(fā)生發(fā)展〔46，47〕。體外研究表明LP可通過(guò)抑制糖原合成酶(GSK)-3β的活性，呈劑量依賴增加VSMC的成骨性轉(zhuǎn)化〔48〕。在ApoE敲除小鼠動(dòng)物模型，給予腹腔注射LP能夠促進(jìn)AS斑塊鈣化的發(fā)生〔49〕。對(duì)無(wú)臨床癥狀患者及2型糖尿病患者的研究表明血清LP水平獨(dú)立于傳統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)因素和 CAC 相關(guān)〔50，51〕。Iribarren 等〔52〕的研究表明血清LP水平和年老女性患者的CAC相關(guān)，但該作用不是獨(dú)立的，和血脂、血壓、胰島素抵抗等其他因素相關(guān)。

關(guān)于血清炎癥相關(guān)因子作為斑塊鈣化的指標(biāo)有爭(zhēng)議。Hamirani等〔53〕總結(jié)了12篇有關(guān)血清炎癥因子和CAC的文章，測(cè)定的炎癥因子包括C反應(yīng)蛋白(CRP)、MMP-9、纖維蛋白原、MCP-1、人抵抗素、脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(Lp-PLA2)、白細(xì)胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)，發(fā)現(xiàn)炎癥因子與斑塊鈣化的關(guān)系是微弱的，建議有計(jì)劃的大規(guī)模研究。Jenny等〔54〕對(duì)6 783例不同種族亞臨床癥狀患者的血IL-6，CRP，纖維蛋白原進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)三者和CAC都有一定相關(guān)性，但在排除冠心病風(fēng)險(xiǎn)因素后，只有IL-6和CAC相關(guān)。最近，一項(xiàng)對(duì)455例個(gè)體20種炎性因子的研究表明，IL-6、IL-8和 IL-13與 CAC明顯相關(guān)，而 CRP缺少聯(lián)系〔55〕。Li等〔56〕認(rèn)為CAC和炎癥因子CRP的升高可能有著不同的病理生理機(jī)制，是兩者缺少相關(guān)性的原因。血清炎癥因子的改變和AS斑塊鈣化均與心血管事件的發(fā)生密切相關(guān)。

4 microRNA參與VSMC成骨性轉(zhuǎn)化

microRNAs(miRNAs)是一種小的內(nèi)源性非編碼RNA分子，大約由21～25個(gè)核苷酸組成。這些小的miRNA通常靶向一個(gè)或者多個(gè)mRNA，在翻譯水平抑制或斷裂靶mRNAs調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、分化、遷移和調(diào)亡。已發(fā)現(xiàn)microRNAs和多種疾病相關(guān)。AS斑塊鈣化由多種蛋白因子參與調(diào)節(jié)，和蛋白表達(dá)密切相關(guān)的microRNAs必然發(fā)揮重要作用。已發(fā)現(xiàn)microRNAs參與VSMC的表型轉(zhuǎn)化。

miR-204在心肌及 VSMC中表達(dá)。Cui等〔57〕培養(yǎng)小鼠VSMC細(xì)胞發(fā)現(xiàn)miR-204在β-甘油磷酸鹽誘導(dǎo)的VSMC鈣化過(guò)程中顯著下降，認(rèn)為miR-204與鈣化發(fā)生相關(guān)。堿性磷酸酶(ALP)是破骨細(xì)胞分化前期的標(biāo)志，骨鈣素是成骨細(xì)胞分化中期既骨基質(zhì)形成階段的標(biāo)志。抑制miR-204能夠增加VSMC的ALP、骨鈣素及Runx2的表達(dá)。相反，過(guò)表達(dá)miR-204能抑制VSMC的鈣化。Runx2是成骨細(xì)胞分化重要轉(zhuǎn)錄因子。進(jìn)一步研究證明miR-204是通過(guò)下調(diào)Runx2抑制VSMC鈣化。miR-125b是除miR-145、miR-23、miR-143外在動(dòng)脈表達(dá)豐富的microRNA之一。培養(yǎng)人冠狀動(dòng)脈VSMC在成骨性轉(zhuǎn)化過(guò)程中miR-125b的表達(dá)明顯下降，抑制內(nèi)源性miR-125b可以增加VSMC ALP的表達(dá)及基質(zhì)的礦物質(zhì)化。在體內(nèi)，ApoE敲除誘導(dǎo)的小鼠動(dòng)脈鈣化模型中，miR-125b含量顯著下降。miR-125b參與了VSMC的成骨性轉(zhuǎn)化，該作用可能是通過(guò)SP7轉(zhuǎn)錄因子實(shí)現(xiàn)的〔58〕。最近 Gui等〔59〕應(yīng)用血管鈣化動(dòng)物模型篩選出miR-135a、miR-762、miR-714和 miR-712為差異表達(dá) microRNAs，并在體外培養(yǎng)VSMC中進(jìn)行證實(shí)。這些microRNA的作用靶點(diǎn)為NCX1、PMCA1和 NCKX4，它們均為和Ca離子通道相關(guān)蛋白。miR-135a、miR-762、miR-714和 miR-712與 Ca及 Pi誘導(dǎo)的VSMC成骨性轉(zhuǎn)變相關(guān)。

AS斑塊鈣化的發(fā)生是多種蛋白因子及microRNAs相互作用的結(jié)果，對(duì)其發(fā)病機(jī)制的了解，有利于尋找血清標(biāo)志物幫助臨床診斷及危險(xiǎn)分層，并為靶向藥物治療提供線索，對(duì)于降低急性心血管事件的發(fā)生非常重要。

1 Shemesh J，Koren-Morag N，Apter S，et al.Accelerated progression of coronary calcification:four-year follow-up in patients with stable coronary artery disease〔J〕.Radiology，2004;233(1):201-9.

2 Georgiou D，Budoff MJ，Kaufer E，et al.Screening patients with chest pain in the emergency department using electron beam tomography:a follow-up study〔J〕.J Am Coll Cardiol，2001;38(1):105-10.

3 Nance JW Jr，Schlett CL，Schoepf UJ，et al.Incremental prognostic value of different components of coronary atherosclerotic plaque at cardiac CT angiography beyond coronary calcification in patients with acute chest pain〔J〕.Radiology，2012;264(3):679-90.

4 Rijlaarsdam-Hermsen D，Kuijpers D，van Dijkman PRM.Diagnostic and prognostic value of absence of coronary artery calcification in patients with stable chest symptoms〔J〕.Neth Heart J，2011;19(5):223-8.

5 Budoff MJ，Shaw LJ，Liu ST，et al.Long-term prognosis associated with coronary calcification:observations from a registry of 25，253 patients〔J〕.J Am Coll Cardiol，2007;49(18):1860-70.

6 Arad Y，Goodman KJ，Roth M，et al.Coronary calcifi cation，coronary disease risk factors，C-reactive protein，and atherosclerotic cardiovascular disease events:the St.Francis Heart Study〔J〕.J Am Coll Cardiol，2005;46(1):158-65.

7 Mieres JH，Shaw LJ，Arai A，et al.Role of noninvasive testing in the clinical evaluation of women with suspected coronary artery disease:consensus statement from the Cardiac Imaging Committee，Council on Clinical Cardiology，and the Cardiovascular Imaging and Intervention Committee，Council on Cardiovascular Radiology and Intervention，American Heart Association〔J〕.Circulation，2005;111(5):682-96.

8 De Backer G，Ambrosioni E，Borch-Johnsen K，et al.European guidelines on cardiovascular disease prevention in clinical practice.Third Joint Task Force of European and Other Societies on Cardiovascular Disease Prevention in Clinical Practice〔J〕.Eur Heart J，2003;24(17):1601-10.

9 Bobryshev YV.Transdifferentiation of smooth muscle cells into chondrocytes in atherosclerotic arteries in situ:implications for diffuse intimal calcification〔J〕.J Pathol，2005;205(5):641-50.

10 Steitz SA，Speer MY，Curinga G，et al.Smooth muscle cell phenotypic transition associated with calcification upregulation of cbfa1 and downregulation of smooth muscle lineage markers〔J〕.Circ Res，2001;89(12):1147-54.

11 Nakano-Kurimoto R，Ikeda K，Uraoka M，et al.Replicative senescence of vascular smooth muscle cells enhances the calcification through initiating the osteoblastic transition〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009;297(5):H1673-84.

12 Byon CH，Javed A，Dai Q，et al.Oxidative stress induces vascular calcification through modulation of the osteogenic transcription factor Runx2 by AKT signaling〔J〕.J Biol Chem，2008;283(22):15319-27.

13 Parhami F，Basseri B，Hwang J，et al.High-density lipoprotein regulates calcification of vascular cells〔J〕.Circ Res，2002;91(7):570-6.

14 Abedin M，Lim J，Tang TB，et al.N-3 fatty acids inhibit vascular calcification via the p38-mitogen-activated protein kinase and peroxisome proliferator-activated receptor-gamma pathways〔J〕.Circ Res，2006;98(6):727-9.

15 Bear M，Butcher M，Shaughnessy SG.Oxidized low-density lipoprotein acts synergy istically with beta-glycerophosphate to induce osteoblast differentiation in primary cultures of vascular smooth muscle cells〔J〕.J Cell Biochem，2008;105(1):185-93.

16 Nadra I，Mason JC，Philippidis P，et al.Proinflammatory activation of macrophages by basic calcium phosphate crystals via protein kinase C and MAP kinase pathways:a vicious cycle of inflammation and arterial calcification〔J〕?Circ Res，2005;96(12):1248-56.

17 Rydén L.What are the risk factors for progression of coronary artery calcification in patients with type 2 diabetes〔J〕?Nat Clin Pract Cardiovasc Med，2008;5(7):370-1.

18 Chen NX，Duan D，O＇Neill KD，et al.High glucose increases the expression of Cbfa1 and BMP-2 and enhances the calcification of vascular smooth muscle cells〔J〕.Nephrol Dial Transplant.2006;21(12):3435-42.

19 Allison MA，Wright CM.A comparison of HDL and LDL cholesterol for prevalent coronary calcification〔J〕.Int J Cardiol，2004;95(1):55-60.

20 Orakzai SH，Nasir K，Blaha M，et al.Non-HDL cholesterol is strongly associated with coronary artery calcification in asymptomatic individuals〔J〕.Atherosclerosis，2009;202(1):289-95.

21 Zhang ZY，Bian LQ，Kim SJ，et al.Inverse relation of total serum bilirubin to coronary artery calcification score detected by multidetector computed tomography in males〔J〕.Clin Cardiol，2012;35(5):301-6.

22 Kim ES，Shin JA，Shin JY，et al.Association between low serum free thyroxine concentrations and coronary artery calcification in healthy euthyroid subjects〔J〕.Thyroid，2012;22(9):870-6.

23 Tintut Y，Demer L.Role of osteoprotegerin and its ligands and competing receptors in atherosclerotic calcification〔J〕.J Investig Med，2006;54(7):395-401.

24 Montecucco F，Steffens S，Mach F.The immune response is involved in atherosclerotic plaque calcification:could the RANKL/RANK/OPG system be a marker of plaque instability〔J〕?Clin Dev Immunol，2007;2007:75805.

25 Sandberg WJ，Yndestad A，Qie E，et al.Enhanced T-cell expression of RANK ligand in acute coronary syndrome:possible role in plaque destabilization〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006;26(4):857-63.

26 Bucay N，Sarosi I，Dunstan CR，et al.Osteoprotegerindeficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification〔J〕.Genes Dev，1998;12(9):1260-8.

27 Price PA，June HH，Buckley JR，et al.Osteoprotegerin inhibits artery calcification induced by warfarin and by vitamin D〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2001;21(10):1610-6.

28 Bennett BJ，Scatena M，Kirk EA，et al.Osteoprotegerin inactivation accelerates advanced atherosclerotic lesion progression and calcification in older ApoE-/-mice〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006;26(9):2117-24.

29 Dhore CR，Cleutjens JP，Lutgens E，et al.Differential expression of bone matrix regulatory proteins in human atherosclerotic plaques〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2001;21(12):1998-2003.

30 Jono S，Ikari Y，Shioi A，et al.Serum osteoprotegerin levels are associated with the presence and severity of coronary artery disease〔J〕.Circulation，2002;106(10):1192-4.

31 Mohammadpour AH，Shamsara J，Nazemi S，et al.Evaluation of RANKL/OPG serum concentration ratio as a new biomarker for coronary artery calcification:a pilot study〔J〕.Thrombosis，2012;2012:306263.

32 Cho HJ，Kim HS.Osteopontin:a multifunctional protein at the crossroads of inflammation，atherosclerosis，and vascular calcification〔J〕.Curr Atheroscler Rep，2009;11(3):206-13.

33 Steitz SA，Speer MY，McKee MD，et al.Osteopontin inhibits mineral deposition and promotes regression of ectopic calcification〔J〕.Am J Pathol，2002;161(6):2035-46.

34 Speer MY，Chien YC，Quan M，et al.Smooth muscle cells deficient in osteopontin have enhanced susceptibility to calcification in vitro〔J〕.Cardiovasc Res，2005;66(2):324-33.

35 Uz O，Kardesoglu E，Yiginer O，et al.The relationship between coronary calcification and the metabolic markers of osteopontin，fetuin-A，and visfatin〔J〕.Turk Kardiyol Dern Ars，2009;37(6):397-402.

36 Minoretti P，F(xiàn)alcone C，Calcagnino M，et al.Prognostic significance of plasma osteopontin levels in patients with chronic stable angina〔J〕.Eur Heart J，2006;27(7):802-7.

37 Georgiadou P，Iliodromitis EK，Kolokathis F，et al.Osteopontin as a novel prognostic marker in stable ischaemic heart disease:a 3-year followup study〔J〕.Eur J Clin Invest，2010;40(4):288-93.

38 Reynolds JL，Skepper JN，McNair R，et al.Multifunctional roles for serum protein fetuin-a in inhibition of human vascular smooth muscle cell calcification〔J〕.J Am Soc Nephrol，2005;16(10):2920-30.

39 El-Shehaby AM，Zakaria A，El-Khatib M，et al.Association of fetuin-A and cardiac calcification and inflammation levels in hemodialysis patients〔J〕.Scand J Clin Lab Invest，2010;70(8):575-82.

40 Zebboudj AF，Imura M，Bostrom K.Matrix GLA protein，a regulatory protein for bone morphogenetic protein-2〔J〕.J Biol Chem，2002;277(6):4388-94.

41 Yao Y，Watson AD，Ji S，et al.Heat shock protein 70 enhances vascular bone morphogenetic protein-4 signaling by binding matrix Gla protein〔J〕.Circ Res，2009;105(6):575-84.

42 Hackeng TM，Rosing J，Spronk HM，et al.Total chemical synthesis of human matrix Gla protein〔J〕.Protein Sci，2001;10(4):864-70.

43 Steitz SA，Speer MY，Curinga G，et al.Smooth muscle cell phenotypic transition associated with calcification:upregulation of Cbfa1 and downregulation of smooth muscle lineage markers〔J〕.Circ Res，2001;89(12):1147-54.

44 Jono S，Ikari Y，Vermeer C，et al.Matrix Gla protein is associated with coronary artery calcification as assessed by electron-beam computed tomography〔J〕.Thromb Haemost，2004;91(4):790-4.

45 O＇Donnell CJ，Shea MK，Price PA，et al.Matrix Gla protein is associated with risk factors for atherosclerosis but not with coronary artery calcification〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006;26(12):2769-74.

46 Park HY，Kwon HM，Lim HJ，et al.Potential role of leptin in angiogenesis:leptin induces endothelial cell proliferation and expression of matrix metalloproteinases in vivo and in vitro〔J〕.Exp Mol Med，2001;33(2):95-102.

47 Yamagishi SI，Edelstein D，Du XL，et al.Leptin induces mitochondrial superoxide production andmonocyte themoattractant protein-1 expression in aortic endothelial cells by increasing fatty acid oxidation via protein kinase A〔J〕.J Biol Chem，2001;276(27):25096-100.

48 Zeadin MG，Butcher MK，Shaughnessy SG，et al.Leptin promotes osteoblast differentiation and mineralization of primary cultures of vascular smooth muscle cells by inhibiting glycogen synthase kinase(GSK)-3β〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2012;425(4):924-30.

49 Zeadin M，Butcher M，Werstuck G，et al.Effect of leptin on vascular calcification in apolipoprotein E-deficient mice〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2009;29(12):2069-75.

50 Qasim A，Mehta NN，Tadesse MG，et al.Adipokines，insulin resistance，and coronary artery calcification〔J〕.J Am Coll Cardiol，2008;52(3):231-6.

51 Reilly MP，Iqbal N，Schutta M，et al.Plasma leptin levels are associated with coronary atherosclerosis in type 2 diabetes〔J〕.J Clin Endocrinol Metab，2004;89(8):3872-978.

52 Iribarren C，Husson G，Go AS，et al.Plasma leptin levels and coronary artery calcification in older adults〔J〕.J Clin Endocrinol Metab，2007;92(2):729-32.

53 Hamirani YS，Pandey S，Rivera JJ，et al.Markers of inflammation and coronary artery calcification:a systematic review〔J〕.Atherosclerosis，2008;201(1):1-7.

54 Jenny NS，Brown ER，Detrano R，et al.Associations of inflammatory markers with coronary artery calcification:results from the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis〔J〕.Atherosclerosis，2010;209(1):226-9.

55 Raaz-Schrauder D，Klinghammer L，Baum C，et al.Association of systemic inflammation markers with the presence and extent of coronary artery calcification〔J〕.Cytokine，2012;57(2):251-7.

56 Li JJ，Zhu CG，Yu B，et al.The role of inflammation in coronary artery calcification〔J〕.Ageing Res Rev，2007;6(4):263-70.

57 Cui RR，Li SJ，Liu LJ，Yi L，et al.MicroRNA-204 regulates vascular smooth muscle cell calcification in vitro and in vivo〔J〕.Cardiovasc Res，2012;96(2):320-9.

58 Goettsch C，Rauner M，Pacyna N，et al.miR-125b regulates calcification of vascular smooth muscle cells〔J〕.Am J Pathol，2011;179(4):1594-600.

59 Gui T，Zhou G，Sun Y，et al.MicroRNAs that target Ca(2+)transporters are involved in vascular smooth muscle cell calcification〔J〕.Lab Invest，2012;92(9):1250-9.