鐵皮石斛組織培養(yǎng)研究進展

王 睿，潘凌潔，柯旭波，詹 妮，童霞秀，于 超，王華森

（浙江農(nóng)林大學農(nóng)業(yè)與食品科學學院，浙江 臨安 311300）

鐵皮石斛組織培養(yǎng)研究進展

王 睿，潘凌潔，柯旭波，詹 妮，童霞秀，于 超，王華森*

（浙江農(nóng)林大學農(nóng)業(yè)與食品科學學院，浙江 臨安 311300）

綜述了鐵皮石斛（Dendrobium officinale）組織培養(yǎng)研究進展，鐵皮石斛的組織快繁主要通過種子無菌萌發(fā)、試管苗原球莖發(fā)生和試管苗器官發(fā)生3種途徑；鐵皮石斛的基本培養(yǎng)基為MS、B5、N6、RM和Fonnesbech，但對最適培養(yǎng)基的選擇卻不同，主要在于外植體來源不同所致；鐵皮石斛在不同生長發(fā)育階段所需激素的量和種類都不相同，目前，鐵皮石斛組織培養(yǎng)中常使用的外源激素主要是生長素類（如IAA、IBA、NAA等）和細胞分裂素類（如BA、ZT和KT）；添加劑的使用在鐵皮石斛的組織培養(yǎng)快繁體系的建立中具有重要的意義，常用的添加劑為香蕉汁、椰子汁、馬鈴薯泥、蘋果汁、荸薺汁等；此外，碳源、溫度及光照對鐵皮石斛組培苗生長發(fā)育都有影響。

鐵皮石斛；組織培養(yǎng)；研究進展

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）又稱黑節(jié)草、鐵皮蘭，屬蘭科(Orchideceae)石斛屬(Dendrobium)多年生附生性草本植物，是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，具有益胃生津、滋陰清熱功效[1]；民間稱其為“救命仙草”[2～3]。多分布于海拔近千米的山地半陰濕巖石上，加上長期采挖，使得野生鐵皮石斛資源日漸枯竭[4～5]。鐵皮石斛的種子極小、無胚乳，需結(jié)合共生菌才能正常萌發(fā)，故實生苗的栽培難度較大[6]。傳統(tǒng)的無性繁殖方式繁殖系數(shù)低，大面積栽培種苗數(shù)量無法得到滿足。為了滿足市場的需求，國內(nèi)許多研究人員進行了鐵皮石斛組織培養(yǎng)技術(shù)的研究，取得了不少進展。本文綜述了近年來關(guān)于鐵皮石斛組織培養(yǎng)的研究概況，并分析存在的問題及發(fā)展的方向，為鐵皮石斛人工快繁提供參考。

1 研究概況

1.1 外植體的選擇

外植體作為植物組織培養(yǎng)中離體培養(yǎng)材料的來源，原則上可采用鐵皮石斛的任何部位，但是不同部位不同發(fā)育階段的植物材料對誘導反應條件不同。因此鐵皮石斛組織培養(yǎng)過程中，研究人員試驗過不同種類的外植體。葉秀嶙等[7]將2-6個月種齡的種子進行組織培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)萌發(fā)率不一樣，種齡越長萌發(fā)率越高，組織培養(yǎng)應采用健康、老熟的種子。鐵皮石斛的莖段也能很好的誘導器官發(fā)生，取鐵皮石斛當年生幼嫩莖，切成長度為1.0 ～ 1.5 cm 帶1 ～ 2個腋芽的小莖，進行離體培養(yǎng)，可以誘導出不定芽[8～9]。近幾年，鐵皮石斛的組織快繁主要通過種子無菌萌發(fā)、試管苗原球莖發(fā)生和試管苗器官發(fā)生3種途徑。

1.2 培養(yǎng)基的選擇

鐵皮石斛的基本培養(yǎng)基為MS、B5、N6、RM和Fonnesbech[10～11]，但對最適培養(yǎng)基的選擇卻不同，主要在于外植體來源不同所致。對鐵皮石斛種子無菌萌發(fā)及發(fā)芽率的研究表明，鐵皮石斛種子可在1/2MS、改良KC、改良N6培養(yǎng)基上生長，且最高萌發(fā)率可達100%[12]。鐵皮石斛的原球莖增殖可以選用1/2MS[13]、MS培養(yǎng)基[14～16]。鮑騰飛[17]等認為最有利于鐵皮石斛類原球莖生長增殖的基本培養(yǎng)基為1/2MS。方炎明[18]和單芹麗等[19]分別選用莖尖和蒴果為外植體在1/2MS培養(yǎng)基進行組織培養(yǎng)。詹忠根等[20]離體根尖培養(yǎng)選用B5培養(yǎng)基。蔣向輝等[21]將幼葉做為外植體，選擇MS培養(yǎng)基。朱艷等[22]以鐵皮石斛莖段誘導叢生芽作為目的，篩選出1/2MS誘導叢生芽的效果好，生成的苗粗壯。

1.3 激素對鐵皮石斛組織培養(yǎng)的影響

鐵皮石斛在不同生長發(fā)育階段所需激素的量和種類都不相同。針對不同的培養(yǎng)目的及培養(yǎng)階段，探尋各種激素的最佳配比一直是研究的熱點。目前，鐵皮石斛組織培養(yǎng)中常使用的外源激素主要是生長素類（如 IAA、IBA、NAA等）和細胞分裂素類（如BA、ZT和KT）。

鄭志仁等[23]研究了植物生長調(diào)節(jié)劑對鐵皮石斛種子萌發(fā)、原球莖增殖與分化、試管苗生根的影響，結(jié)果表明，鐵皮石斛種子萌發(fā)的適宜培養(yǎng)基為MS＋0.5mg/L NAA＋10%土豆汁；原球莖增殖與分化的適宜培養(yǎng)基為MS ＋0.5mg/L 6-BA＋0.1mg/L NAA＋10%土豆汁；試管苗生根的適宜培養(yǎng)基為MS＋0.2mg/L NAA＋10%土豆汁。陳兆貴[24]等認為最佳激素配比為1.0 mg/L NAA＋1.0 mg/L 6-BA＋1.0 mg/L KT，接種35 d鐵皮石斛原球莖增殖倍數(shù)達5倍。羅吉鳳[25]等研究結(jié)果表明，原球莖分化適宜的激素濃度為2 mg/L BA、0.2mg/L NAA和0.1mg/L IBA。蔣波等[26]報道了2.0 mg/L BA＋0.5mg/L NAA或3.0mg/L 6-BA＋0.5mg/L NAA適宜鐵皮石斛原球莖增殖。莫昭展等[27]研究表明，在改良MS中加入0.5 mg/L ABA，原球莖增殖的效果比較好。李璐[28]比較了6-BA和TDZ對鐵皮石斛花芽誘導的影響，結(jié)果表明，0.2 mg/L TDZ最適宜誘導其開花。張治國等[29]報道了2 mg/L BA＋0.2 mg/L NAA組合加快原球莖分化進程。謝啟鑫等[15]研究表明0.5 mg/L BA＋0.5 mg/LNAA組合適宜試管苗的增殖分化。秦廷豪[30]研究表明以鐵皮石斛無菌苗分成的莖段、帶頂芽的莖段和根蔸類外植體在MS＋0.5 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L NAA上均能誘導出叢芽，只有根蔸能誘導原球莖, 且誘導叢芽倍數(shù)高于其它兩類。常美花等[31]研究表明1.0 mg/L 6-BA＋0.5mg/L NAA為鐵皮石斛原球莖增殖的最佳濃度。張紅兵等[9]研究表明鐵皮石斛莖段腋芽誘導最佳的培養(yǎng)基為MS＋1.0 mg/L NAA＋3.0 mg/L 6-BA，誘導率達到95%；向培養(yǎng)基中加入活性炭2 g/L或維生素C（Vc）2.5 g/L均能有效地防止外植體褐化；誘導鐵皮石斛幼苗生根的最佳培養(yǎng)基為1/2MS＋2.0mg/L IBA，生根率在90%以上。唐桂香等[13]研究表明，0.5 mg/L NAA對鐵皮石斛的生根效果最好。宋順等[32]研究結(jié)果表明：最適合鐵皮石斛原球莖誘導的培養(yǎng)基為MS＋0.5 mg/L 6-BA＋1.5 mg/L NAA，原球莖誘導率為95%；最適合原球莖增殖的培養(yǎng)基為MS＋6-BA 1 mg/L＋NAA 1 mg/L；最適合原球莖分化的培養(yǎng)基為MS＋5 mg/L 6-BA＋1 mg/L NAA，其分化率達80%；最適合鐵皮石斛根誘導的培養(yǎng)基為MS＋1.5 mg/L IBA＋香蕉泥100 g/L，其生根率為100%。羅煥明等[33]以無菌播種取得的鐵皮石斛無菌苗作為試驗材料，研究1/2MS培養(yǎng)基中添加不同濃度的添加物對鐵皮石斛的增殖、生根的影響，結(jié)果表明：以1/2MS＋0.2 mg/L NAA＋30 g/L蔗糖＋200 g/L馬鈴薯培養(yǎng)基最有利于誘導芽的增殖，其中又以1/2MS＋0.5 mg/L NAA＋30 g/L蔗糖＋100 g/L香蕉培養(yǎng)基最有利于誘導芽生根。

1.4 添加劑對鐵皮石斛組織培養(yǎng)的影響

添加劑的使用在鐵皮石斛的組織培養(yǎng)快繁體系的建立中具有重要的意義。常用的添加劑為香蕉汁、椰子汁、馬鈴薯泥、蘋果汁、荸薺汁等[34]。椰子汁、蘋果汁[35]對鐵皮石斛原球莖增殖有較好的效果，添加馬鈴薯汁[12,22]能有效促進原球莖的分化；馬鈴薯汁和木瓜乳有利于誘導芽的增殖[36]，香蕉汁有利于誘導生根，宋順等[32]也報道了香蕉汁有利于誘導生根：鄭志仁等[23]認為土豆汁利于鐵皮石斛的種子萌發(fā)，有利于原球莖增殖與分化。然而張治國等[29]認為原球莖增殖時最好不要添加任何天然提取物。添加活性炭能使原球莖的增殖量顯著增加[25,35～36]，這可能是活性炭吸附了某種不利于原球莖增殖的物質(zhì)[36]。

1.5 碳源

周根余等[37]研究了不同碳源對鐵皮石斛原球莖生長的影響，發(fā)現(xiàn)原球莖在蔗糖中生長最快，濃度3%，葡萄糖中其次，而乳糖中最慢。而馮瑩等[38]報道了白糖對鐵皮石斛原球莖的培養(yǎng)效果優(yōu)于蔗糖。陸兵[36]認為原球莖分化中，蔗糖濃度以3%為分化的臨界值，蔗糖2%為原球莖分化的適宜濃度。

1.6 溫度及光照

鮑順淑等[39]研究了光照強度對鐵皮石斛組培苗生長發(fā)育的影響，以期找到鐵皮石斛組培階段在人工光可控環(huán)境下的適宜光照環(huán)境，結(jié)果表明鐵皮石斛組培苗在人工光型密閉式植物工廠內(nèi)培育的適宜光照強度為60 ～ 70 μmol/（m2·s），光照強度為92 μmol/（m2·s）時有利于鐵皮石斛組培苗多糖的積累，但其生理活性受到一定的光抑制。唐麗等[40]研究表明在組織培養(yǎng)和快速繁殖中，當培養(yǎng)溫度為25℃時，原球莖增殖效果最佳；當溫度≥25℃時，分生苗數(shù)量增多；溫度≤23℃時，生根苗生長健壯高大。

2 展望

據(jù)報道，截止2012年6月，全國鐵皮石斛組培苗年產(chǎn)量約4億株，浙江、云南分別有2億株和1.3億株，全國種植面積達到2 100 hm2，并且云南鐵皮石斛的種植面積仍以每年40% ～ 50%的速度在擴大。正是由于鐵皮石斛組織培養(yǎng)繁殖技術(shù)的快速發(fā)展才推動了鐵皮石斛的大規(guī)模生產(chǎn)。同時對瀕臨滅絕的野生鐵皮石斛資源有緩解作用。然而，鐵皮石斛標準化種苗生產(chǎn)體系所需成本偏高，生產(chǎn)周期偏長，市場價格比較昂貴，不同品種及生長條件下的藥用成分含量造成了鐵皮石斛的品質(zhì)不同。針對上述問題，今后要解決是，加強鐵皮石斛優(yōu)良品種的選育，進一步控制原球莖增殖和分化的時間，提高試管苗的生長速度，探討生長環(huán)境對鐵皮石斛的生長發(fā)育的影響，有利于組培苗移栽到大田里更好地生長以及藥用成分的積累。這樣才能從根本上解決上述存在的問題。

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Advance on Research of Tissue Culture of Dendrobium officinale

WANG Rui，PAN Ling-jie，KE Xu-bo，ZHAN Ni，TONG Xia-xiu，YU Chao，WANG Hua-sen*
（School of Agriculture and Food Science, Zhejiang A ＆ F University, Lin’an 311300, China）

Descriptions were made on researches on tissue culture of Dendrobium officinale involving selection of explants, minimal medium, exogenous hormones and their concentration, additives, as well as on carbon source, temperature and light.

Dendrobium officinale; tissue culture; research

S723.1+32.6

A

1001-3776（2015）05-0080-05

2015-03-21；

2015-06-11

浙江省基金（Y3110340, LQ12C15002）；浙江省科技廳重大專項（2010C02003）；浙江省公益性項目（2012C22019）；2012浙江省“三農(nóng)六方”農(nóng)業(yè)科技協(xié)作計劃項目（113-2045210160）；浙江農(nóng)林大學“國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃”（201410341020）；2014年浙江省大學生科技創(chuàng)新活動計劃暨新苗人才計劃（2014R412032，2014R412039，2014R412031）；2013年浙江農(nóng)林大學創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201301012，201301006，201312004，201312021）

王睿（1996-），男，浙江寧波人，從事農(nóng)業(yè)科學研究；*通訊作者。