實驗病理標本前期處理應注意的若干問題

李建瑛，劉江偉，許 琴，張東輝，趙紅艷，是文輝，李佳佳，董 翔，馬 娜，許永華

(蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院動物實驗科，烏魯木齊 830000）

實驗病理標本前期處理應注意的若干問題

李建瑛，劉江偉，許 琴，張東輝，趙紅艷，是文輝，李佳佳，董 翔，馬 娜，許永華

(蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院動物實驗科，烏魯木齊 830000）

實驗病理技術(shù)中標本的取材、固定以及后續(xù)的制片染色，對病理診斷結(jié)果的可靠性、真實性有很大的影響，本文對動物實驗病理制片關(guān)鍵步驟中易出現(xiàn)的問題及對策進行探討。

實驗病理;組織固定;切片制作;病理診斷

近幾年隨著病理技術(shù)大力發(fā)展，在醫(yī)學領(lǐng)域成果倍出。筆者從事動物實驗病理技術(shù)多年，發(fā)現(xiàn)部分科研人員對病理技術(shù)不了解，缺乏病理基礎(chǔ)知識，甚至得出錯誤結(jié)論，造成人為的損失，其共性是輕視了病理組織標本的前期處理，這是一個在病理工作中十分關(guān)鍵的步驟，根據(jù)筆者多年工作經(jīng)驗對該問題談談體會。

1 取材前的準備工作

1.1 取材器械準備

準備一支HB鉛筆，一套取材器械，包括：組織剪、無齒鑷、刀柄及一次性手術(shù)刀片。標本取材的編號一定要用鉛筆標注清晰。取材器械要鋒利，尤其是手術(shù)刀片要定期更換。

1.2 固定液的選擇

固定液需根據(jù)標本制作的需要而選擇不能一概而論。常用固定液有以下幾種：①甲醛：一般作為固定劑使用的10%甲醛是用水和40%甲醛(9： 1）混合而成，實際上是4%的甲醛溶液［1］。②中性甲醛：是最常用的固定液之一，固定效果好，為免疫組織化學最常用的固定液，對組織穿透性好，組織收縮小。③多聚甲醛：該固定液適用于動物灌注固定取材，也可用于組織標本的較長時間保存，也可用于光鏡及免疫組織化學實驗。④戊二醛(C5H8O2）電鏡固定液：戊二醛固定液的優(yōu)點是對糖原，糖蛋白，微管內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞基質(zhì)等有較好的固定作用。一般戊二醛的pH為4．0～5．0貯存時間過長時pH會下降，當pH降至3．5以下就不能使用，戊二醛原液應在冰箱保存［2］。

1.3 固定標本容器的選擇要合適

有時標本瓶口過小，等到修材時，無法取出標本從而引起由于過度牽拉而導致組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞;有時出現(xiàn)標本大小與固定液溶積比例不合適，固定液過少而造成組織滲透不全固定不完全［2－3］。

2 取材

2.1 陰性對照組標本的取材

動物實驗中均有陰性對照組，在動物實驗病理中一定要取3～5只，排除其個體差異。標本的取材一定要正規(guī)，不能隨意對待標本。

2.2 組織標本的取材

主要取之于活組織檢查標本、動物模型組織標本、解剖標本均為新鮮組織夾取標本用無齒鑷，以免對組織造成人為損傷。如機體死亡2 h以上的組織可能有不同程度的自溶，其抗原可能發(fā)生變性消失或嚴重彌漫現(xiàn)象，因此盡塊固定處理以免影響免疫組織化學標記效果。防止人為因素的影響：切取組織時應用鋒利的刀剪，刀刃宜薄、并足夠長。一般標本切取的組織塊厚約0．2～0．3cm，根據(jù)情況可略作調(diào)整，大小以1．5×1．5×0．2～0．3 cm為宜，用于免疫組織化學染色的組織以1cm×1cm×0．2 cm為好，不要太大以免浪費試劑。取材時間應盡可能短：原則上應盡快取材，如：胃、肺、腸、腦組織、脊髓等組織要先固定再取材因組織薄軟、含水量多等特點所以最好先固定再取材。注意特殊情況：取材應避免過多的壞死組織或凝血塊，組織塊上如有血液、粘液糞便等到污物應先用水沖洗干凈再取材。

2.3 標本初步固定后的修材

修材切取組織時不宜過度用力，否則會挫傷或擠壓組織引起組織結(jié)構(gòu)的變形和損傷，取材組織大小1．5×1．5×0．2～0．3 cm為宜，

2.4 特殊取材

由于電鏡電子束穿透能力的限止，必須把標本切成厚度小于0．1 um以下的薄片才適用，⑴取材動作應迅速(爭取在1 min內(nèi)）投內(nèi)固定液;⑵所取組織的體積要小，一般不超過0．2×0．2×0．3 cm;⑶操作最好在低溫(0～4℃）下進行，因固定劑的滲透能力較弱以降低酶的活性防止細胞自溶，還可能由于污染微生物在組織內(nèi)繁殖使細胞微結(jié)構(gòu)遭受破壞。⑷將取材的組織放在潔凈的卡片紙上，滴一滴冷卻的固定液用新的鋒利刀片垂直往下切，然后用牙簽或鑷子將組織移至盛有冷固定液的小瓶中［4］。

3 組織固定

3.1 標本固定要及時充分

良好的組織學切片取決于及時充分的組織固定，組織固定不良或不及時在以后的的標本制備過程中則無法加以糾正，也無法切出優(yōu)質(zhì)的切片，固定液的量是我們常忽略的問題，組織與固定液的比例至少是1∶10，所以一些大的標本應取材后再固定或固定一段時間后更換固定液。固定的容器宜相對要大，并且能加蓋封閉，防止組織與容器粘連或固定液揮發(fā)而產(chǎn)生固定不良，瓶底常墊以棉花防止組織標本與容器粘連使固定劑不能均勻滲入組織塊，若為臟器標本體積較大時應切開臟器，平鋪固定，實質(zhì)器官取成小塊組織固定［5］。固定不及時或不當引起自溶出現(xiàn)細胞核質(zhì)著色較淺輪廓不清以及程度不等的條狀發(fā)白區(qū)現(xiàn)象。標本無論大小離體后30 min內(nèi)立即固定。固定組織時固定液量要足量，一般應為組織塊總體積的5～10倍，也可達15～20倍。最好固定24 h后再取材。

3.2 組織固定方法

大多數(shù)組織采用浸泡法固定，即體外固定。動物取材尤其是對比較嬌嫩的組織如：腦積液、內(nèi)耳及視膜等，最好采用灌注法固定，即通過血管將固定液灌注到所要固定的組織。一般大動物可通過動脈或靜脈導管灌注，小動物可直接用注射針插入心室或主動脈，在固定前先用生理鹽水把血液沖洗干凈然后再進行灌注固定［3］。

4 病理切片

石蠟切片：其優(yōu)點是組織結(jié)構(gòu)保存良好，在病理論斷和回顧性研究中有較大的實用價值能連續(xù)切組織結(jié)構(gòu)清晰，抗原定位明確。冰凍切片：是免疫組織化學染色中最常用的一種方法，其最突出的優(yōu)點是能夠較完好的保存多種抗原的免疫活性尤其是細胞表面抗原應采用冰凍切片。超薄切片：電鏡取材，切取1 mm×1 mm×1 mm大小的組織數(shù)塊，置于鑭醛固定液，4℃過夜，鋨酸處理。丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂浸透、包埋、聚合，光學顯微鏡下進行組織塊修整，超薄切片，銅網(wǎng)撈片，在透射電鏡掃描電鏡下觀察并照片，用于觀察微生物或病毒形態(tài)及細胞器結(jié)構(gòu)［6］。

5 染色

組織切片要經(jīng)過烘烤使其與玻璃片粘帖牢固，一般撈片后在空氣中略微干燥后即烤片，一般在60℃左右烤箱內(nèi)烤30 min。免疫組化染色則需要在HE制片基礎(chǔ)上放在37℃恒溫箱過夜，這樣減少染色中脫片現(xiàn)象。皮膚組織應及時烤片。石蠟切片必需經(jīng)過脫蠟后才能染色，脫蠟前切片要經(jīng)烘烤組織切片脫蠟應完全徹底，脫蠟不凈是影響染色不良的重要原因［7］。蘇木精染色要充分，應根據(jù)染片的多少和液體的新鮮來確定時間;鹽酸酒精分化要適當，必要是應在鏡下觀察，返藍要充分這樣細胞核會更清晰;伊紅染色不宜過長，切片經(jīng)伊紅染后，水洗時間要短。切片經(jīng)過染色后，通過從低濃度到高濃度各級酒精脫水。低濃度酒精對伊紅有分化作用，切片經(jīng)過低濃度時間要短快速，向高濃度時逐步延長脫水時間，脫水要徹底，如脫水不徹底會造成切片發(fā)霧，在顯微鏡下組織結(jié)構(gòu)模糊不清。染色后必須經(jīng)二甲苯處理透明才能用樹膠封片，如透明不充分切片會出現(xiàn)結(jié)構(gòu)模糊不明［8］。染色后進行封片，在封片時樹膠不能太稀或太稠，也不能滴太多或太少，太稀或太少切片容易出現(xiàn)空泡。HE染色結(jié)果：因細胞核呈蘭色，細胞槳呈淡紅色，顏色鮮艷，細胞核漿對比明顯清晰。

6 討論

在多年的病理技術(shù)工作中發(fā)現(xiàn)許多實驗人員對病理技術(shù)了解不深，不嚴格按規(guī)定操作流程處理標本，不慎重隨意性大。針對這個問題，我們加強了對實驗人員的病理基礎(chǔ)知識培訓，在病理工作的配合方面取得了良好效果。

另外在人員少工作量大的情況下，堅持病理技術(shù)人員參與動物實驗制度。掌握實驗進展，指導實驗人員共同制訂病理工作計劃。

我們還堅持嚴格執(zhí)行病理醫(yī)生取材制度。在工作中注意實驗人員、技術(shù)人員、病理工作人員多方緊密合作完成實驗病理工作。通過以上工作保證動物實驗病理診斷的準確性，維護其“金標準”地位。

［1］郭志杰．病理制片中固定液的選擇［J］．實用醫(yī)技雜志，2009，6(6）：146．

［2］王伯沄，李玉松，黃高昇，等．病理學技術(shù)［M］．人民衛(wèi)生出版社，北京：2000年(第一版）：61－76．

［3］王曉鴻，曹婉維．制作優(yōu)質(zhì)HE病理組織切片的要素［J］．中國實用醫(yī)藥，2011，6(6）：135．

［4］劉樺，盧鶴翔．影響病理切片制作的因素及質(zhì)量控制［J］．中國煤炭工業(yè)醫(yī)學雜志，2005，8(12）：1339．

［5］張同海．病組織標本前期處理常見問題［J］．實用醫(yī)技雜志，2006，13(19）：145．

［6］賴英榮，鐘覺民，羅燦嶠．活體組織HE制片程序探討［J］．實用醫(yī)技雜志，2007，14(12）：1532．

［7］張新新，付紅霞，李艷麗．日常病理切片技術(shù)的幾點體會［J］．臨床合理用藥，2010，3(2）：8．

［8］胡雙慶．有關(guān)影響常規(guī)病理制片質(zhì)量幾個問題的探討［J］．中國社區(qū)醫(yī)師，2010，12(229）：103．

Several issues should be mentioned before pathological specimen processing

LI Jian－ying，LIU Jiang－wei，XU Qin，ZHANG Dong－h(huán)ui，ZHAO Hong－yan，SHI Wen－h(huán)ui，LI Jia－jia，DONG Xiang，MA Na，XU Yong－h(huán)ua
(Animal Experiment Department，Lanzhou Military District Urumqi General Hospital，Urumqi 830000，China）

Experimental pathology is an important part of life science research associated with animal experiment．Acquisition and fixation of optimum specimen and subsequent section of paraffin embedded tissue and dyeing are key factors playing important role in reliability，authenticity of pathological diagnosis．This paper summarizes the problems encountered in pathological section making of animal experiment and it correspond solutions．

Experimental pathology;Tissue fixation;Section making;Pathological diagnosis

R－332

A

1671－7856(2015）07－0066－03

10．3969．j．issn．1671．7856．2015．007．014

李建瑛(1977－），女，實驗師，本科，專業(yè)：實驗病理學技術(shù)。Email：1610801584qq．com。

許永華(1956－），女，主任技師，研究方向：醫(yī)學實驗動物學。Email：xyh821023@sina．com。

2015－06－25

綜述與專論