RNAI-基因敲除技術(shù)及其在腫瘤研究中的進展

RNAI-基因敲除技術(shù)及其在腫瘤研究中的進展

王佳

(天津市天津醫(yī)院，天津300211)

關(guān)鍵詞〔〕基因敲除； RNAI-基因敲除技術(shù)；腫瘤

中圖分類號〔〕R73〔文獻標識碼〕A〔

第一作者：王佳(1973-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事創(chuàng)傷骨科研究。

基因敲除技術(shù)又被稱為基因編輯技術(shù)，是采取不同方式對原有的基因予以切斷，然后安插新基因的技術(shù)。RNAI-基因敲除技術(shù)是一種重要的基因敲除技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于對各種疾病治療的研究之中。其中，在腫瘤治療相關(guān)研究中的應(yīng)用十分突出。受到自身高度特異性和高效性的影響，從細胞水平角度進行分析，RNAI成為一種十分理想的基因敲除工具〔1〕。后基因組時代，在進行各種功能基因組學研究的過程中，RNAI逐漸引起人們的廣泛關(guān)注，并成為一種十分重要的研究手段。目前RNAI在多種病毒感染性疾病以及腫瘤治療的研究中都得到了大量的應(yīng)用，并取得一定的理論和實踐成果。筆者即對RNAI-基因敲除技術(shù)及其在腫瘤研究中的進展情況作一綜述。

1RNAI-基因敲除技術(shù)概述

1.1RNAI-基因敲除技術(shù)基因敲除技術(shù)是通過一定的基因工程途徑，對機體內(nèi)特定的基因予以不同的處理使其發(fā)生缺失或者失活的技術(shù)〔2〕。多種條件會引起基因敲除，包括基因突變和同源重組以及RNAI等。其中，RNAI-基因敲除技術(shù)是一種重要的類型。RNA表示核糖核酸，是一種特殊的“化學信使”，在多種疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中都發(fā)揮著十分重要的作用。借助RNAI可以關(guān)閉特定基因的表達，RNAI-基因敲除技術(shù)又被稱為核糖核酸干擾，是單分子RNA分裂時出現(xiàn)的某種蛋白質(zhì)合成受到抑制的現(xiàn)象。RNAI基因敲除技術(shù)是一種mRNA水平上的基因沉默機制，具有高度的特異性。RNAI由內(nèi)源性或外源性dsRNA誘發(fā)，在細胞內(nèi)，一定的條件下，dsRNA會被切割成21～25 nt具有較小干擾性的RNA，即siRNA。siRNA可以通過介導識別方式，對同源性靶mRNA分子進行一定的靶向切割，從而對該基因功能產(chǎn)生一定的影響，導致其出現(xiàn)無法表達的情況。1994年，有學者通過對華麗新小桿線蟲早期胚胎的分析研究，發(fā)現(xiàn)在其RNA的發(fā)育過程中，在分配體細胞和生殖腺細胞的時候，胚胎早期大部分RNA轉(zhuǎn)錄本會在較短的時間內(nèi)即發(fā)生降解。但是，如果在胚胎中導入具有阻抑效應(yīng)的外源性RNA，便可以產(chǎn)生較強的阻抑效應(yīng)，并持續(xù)到下一代。1995年，有學者在對華麗新小桿線蟲par1基因相關(guān)功能進行研究的時候，在新小桿線蟲中導入par1基因的反義RNA，獲得par1基因缺陷引起的par1擬表型。并通過進一步研究發(fā)現(xiàn)，在導入par1基因之后，在相應(yīng)的意義鏈上，也會產(chǎn)生par1擬表型，這一par1擬表型與導入par1基因的反義RNA是相同的。研究結(jié)果表明，反義RNA以及有意義RNA均可以發(fā)揮出相似的阻抑效應(yīng)。還有學者對此進行了進一步的深入研究，并通過研究提出，在通過一定的途徑和方式被攝入機體細胞中之后，雙鏈RNA可以對其同源基因(靶基因)的表達產(chǎn)生很強的特異性抑制作用。最終，學者還將這一雙鏈RNA命名為 “RNAI”〔3～5〕。

1.2RNAI-基因敲除技術(shù)的機制和特點RNAI-基因敲除技術(shù)的應(yīng)用過程中，會利用一定的基因工程途徑，對機體內(nèi)特定的基因予以不同的處理。通過一定的處理，會出現(xiàn)相應(yīng)的基因缺失或者失活現(xiàn)象。在RNAI的效應(yīng)階段，siRNA雙鏈會與一個核酶復合物發(fā)生結(jié)合，并構(gòu)成一個RNA誘導沉默復合物(RISC)。在對RISC進行激活的時候，需要通過一定的過程。在距離siRNA3'端一定的位置，需要切割相應(yīng)的mRNA。但是關(guān)于切割的確切機制，目前尚缺乏十分清楚的結(jié)論。但是，在每個沉默復合物中，都包含一個不同于Dicer的RNA酶以及一個siRNA。在臨床治療應(yīng)用過程中，主要是通過清除細胞病毒途徑和“關(guān)閉”病原體特定基因途徑。清除病毒途徑是應(yīng)用分子中獨有的生物活性分子，同時致使病原體基因mRNA形成含藥靶點標記；永久“關(guān)閉”病原體特定基因途徑，是臨床提取患者自體病基因mRNA含藥靶點標記，通過體外RNAI生物轉(zhuǎn)錄合成的專項抗體因子來阻斷病原體生物復制鏈、致使病原體相應(yīng)蛋白質(zhì)無法合成，繼而達到永久“關(guān)閉”病原體特定基因的作用。這條途徑治療過程中只是“關(guān)閉”病原體特定基因，而對正常基因本身無損害。RNAI-基因敲除技術(shù)具有十分明顯的特點。首先，該技術(shù)具有易操作性?，F(xiàn)如今，很多生物技術(shù)公司已經(jīng)研制并生產(chǎn)出有效的RNAi 載體，從而為各種疾病的治療提供了更多有利條件。其次，在對基因表達進行抑制的過程中，RNAI-基因敲除技術(shù)具有十分明顯的高效性。另外，RNAI-基因敲除技術(shù)還具有十分明顯的序列特異性〔6〕。

2RNAI-基因敲除技術(shù)在腫瘤相關(guān)研究中的應(yīng)用

RNAI-基因敲除技術(shù)的應(yīng)用范圍十分廣泛，可以被積極地應(yīng)用于各種腫瘤相關(guān)研究之中。

2.1RNAI-基因敲除技術(shù)用于抑制癌基因表達每個人體內(nèi)都有原癌基因，絕對不是每個人體內(nèi)都有癌細胞。原癌基因主管細胞分裂、增殖，而且人體里還有抑癌基因。平時，原癌基因和抑癌基因維持著平衡，但在致癌因素作用下，原癌基因的力量會變大，而抑癌基因卻變得較弱。因此，致癌因素是啟動癌細胞生長的“鑰匙”，主要包括精神因素、遺傳因素、生活方式、某些化學物質(zhì)等。多把“鑰匙”一起用，才能啟動“癌癥程序”；“鑰匙”越多，啟動機會越大。腫瘤可以為良性和惡性。原癌基因的活化包括多種情況，例如染色體重排和插入突變、點突變、基因擴增。對于上述不同類型的活化癌基因mRNA而言，均可以通過RNAI技術(shù)對其產(chǎn)生有效抑制，從而達到對腫瘤生長有效抑制的目的。

2.1.1RNAI-基因敲除技術(shù)用于敲除點突變激活的癌基因在敲除點突變激活癌基因，可達到理想腫瘤治療效果的過程中，RNAI技術(shù)是一個十分理想的工具。k-ras是一種原癌基因，當k-ras基因突變時，該基因永久活化，不能產(chǎn)生正常的ras蛋白，使細胞內(nèi)信號傳導紊亂，細胞增殖失控而癌變。對于發(fā)生突變的ras基因而言，與正常細胞中存在的野生型ras基因進行比較可以發(fā)現(xiàn)，二者之間存在較大的相似性，僅有一個堿基不同〔7〕。但是，RNAI具有高度的特異性，因此可以專門針對腫瘤細胞中發(fā)生突變的ras基因發(fā)揮作用，產(chǎn)生較強的抑制效果。而對于正常細胞中存在的野生型ras基因，則不會產(chǎn)生抑制。利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體shRNA表達系統(tǒng)進行實驗，可以在體外環(huán)境下對Capan-1胰腺癌細胞內(nèi)k-ras基因的表達產(chǎn)生特異性的抑制。另外，也可以對裸小鼠移植瘤的生長產(chǎn)生較為明顯的抑制作用。

2.1.2RNAI-基因敲除技術(shù)用于抑制基因擴增在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中，原癌基因會發(fā)生基因擴增現(xiàn)象。在基因擴增過程中，原癌基因可以在原來染色體上，利用一定的機制，通過復制達到多個拷貝數(shù)〔8〕。于是，通過擴增，相關(guān)表達產(chǎn)物的數(shù)量會出現(xiàn)異常增多的情況，細胞大量增殖。在多種上皮性腫瘤中，表皮生長因子受體EGFR(ErbB1)都會出現(xiàn)基因擴增的情況，并對腫瘤的發(fā)生產(chǎn)生極大的影響〔9〕。以往還有研究發(fā)現(xiàn)，采用化學合成方式可以獲得實驗所需的anti-erbB1 siRNA，并對A431細胞內(nèi)erbB1的表達予以有效抑制，從而促進細胞凋亡的增加，并削弱腫瘤的增殖。

2.1.3RNAI-基因敲除技術(shù)用于抑制融合基因表達在各種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中，染色體重排指的是癌基因從原本所在染色體位置上發(fā)生轉(zhuǎn)移，到達另一個染色體某一位置上的過程中〔10〕。這一過程會對相應(yīng)的調(diào)控作用產(chǎn)生影響，導致其被激活。于是，大量異?；虍a(chǎn)物出現(xiàn)，細胞出現(xiàn)惡性增殖。在人9號染色體上存在C-ABL基因，22號染色體上存在BCR基因，在一定的條件下，兩種基因發(fā)生易位，并會導致無關(guān)基因出現(xiàn)融合，最終形成BCR/ABL融合基因〔11〕。BCR/ABL融合基因是慢性髓性白血病(CML)致病的始動和核心因素，并與疾病的發(fā)生存在十分密切的聯(lián)系〔12〕。而利用RNAI-基因敲除技術(shù)，則可以對相應(yīng)的融合基因mRNA表達予以有效抑制，達到控制疾病的目的。

2.2RNAI-基因敲除技術(shù)用于抑制其他與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因的表達在各種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中，除了與癌基因被激活有關(guān)之外，還會出現(xiàn)多種形式基因的改變。具體來看，腫瘤的發(fā)病機制會受到諸多因素的調(diào)控，其中，細胞凋亡障礙是一個重要的機制〔13〕。在細胞凋亡方面，涉及到諸多類型的基因，包括Bcl-2基因和raf-1基因等。而RNAI-基因敲除技術(shù)在對各種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程進行抑制過程中，其作用的發(fā)揮便與各種凋亡基因之間存在一定的關(guān)系。Bcl-2基因是Bcl家族中重要的抗細胞凋亡基因，它能夠抑制細胞凋亡，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預后之間存在十分密切的聯(lián)系〔14〕。Bcl-2則可抑制細胞凋亡，其異常表達也與癌癥的發(fā)生、發(fā)展及預后密切相關(guān)，因為細胞凋亡是人體的自然過程，該過程可迫使受損細胞死亡，而Bcl-2基因卻幫助癌細胞繼續(xù)存活〔15〕。raf-1基因也是一種抗凋亡基因，并和白血病的發(fā)生以及臨床耐藥之間具有十分緊密的聯(lián)系。因此，臨床對腫瘤進行治療的過程中，可以通過對Bcl-2和raf-1mRNA表達的抑制，達到對白血病細胞等的增殖予以有效抑制的目的〔16〕。在腫瘤治療過程中，對腫瘤血管生成予以有效抑制是一個十分重要的策略，而利用RNAi-基因敲除技術(shù)，通過anti-VEGF siRNA可以對抑制相關(guān)因子的表達，以抑制腫瘤生長〔17〕。另外，各種腫瘤的臨床治療過程中，耐藥是一個十分突出的問題。耐藥性的存在會對多種類型腫瘤的臨床治療產(chǎn)生不利影響，并與多藥耐藥基因的表達之間存在一定的關(guān)系。為此，通過anti-MDR siRNA，便可以達到很好的抑制細胞耐藥的效果，提高臨床治療水平。

3RNAI-基因敲除技術(shù)應(yīng)用于腫瘤研究中的問題

RNAI-基因敲除技術(shù)應(yīng)用于腫瘤研究中的過程中，雖然獲得了一定的研究成果，但也仍然存在一定的問題。長期以來，RNAI-基因敲除技術(shù)的毒理作用一直是一個重要的研究內(nèi)容〔18〕。在機體中，干擾素是一種十分重要的物質(zhì)，可以對機體內(nèi)多種不同的代謝途徑予以有效激活，并對RNaseL降解mRNA產(chǎn)生一定的誘導作用，從而對機體內(nèi)正常的細胞代謝過程產(chǎn)生影響〔19，20〕。而RNAI技術(shù)則會對干擾素的出現(xiàn)產(chǎn)生一定的影響，從而對正常細胞產(chǎn)生一定的不利影響。另外，關(guān)于RNAI在體內(nèi)的具體作用方式相關(guān)細節(jié)問題，目前仍然缺乏十分系統(tǒng)、明確的闡釋。還有研究指出，HBV病毒的RNAI會對細胞產(chǎn)生較強的毒性作，導致大面積正常細胞出現(xiàn)死亡。但關(guān)于其具體的作用機制，至今尚不甚清楚。另外，在RNAI抗性方面，也存在一定的問題。如果通過自身形成另一種較為特殊二級結(jié)構(gòu)或者RNA結(jié)合特異性的蛋白的方式來對RNAI結(jié)合位點予以封閉，會導致RNAi作用的下降。另外，在RNAI治療方面，也面臨一定的問題。在獲取siRNA的過程中，存在一定的難度〔21〕。而如果采用化學方式進行合成，又會對其自身穩(wěn)定性產(chǎn)生不利影響〔22〕。而且，在具體的治療過程中，如何進行導入也是一個十分棘手的問題。如果采用常規(guī)肌肉注射或者靜脈注射的方式，在體內(nèi)siRNA的存在時間很短，無法有效發(fā)揮持久的作用，臨床效果不甚理想。

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〔2015-07-01修回〕

(編輯曲莉)