骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療腦梗死的研究進(jìn)展

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療腦梗死的研究進(jìn)展

王萬(wàn)松屈新輝1吳曉牧1

(南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江西南昌330006)

關(guān)鍵詞〔〕骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；移植；腦梗死；缺血再灌注

中圖分類號(hào)〔〕R743.3〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助課題(No.81160148)

通訊作者：屈新輝(1970-)，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事帕金森病及干細(xì)胞的基礎(chǔ)和臨床研究。

1江西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 江西省神經(jīng)病學(xué)研究所

第一作者：王萬(wàn)松(1988-)，男，碩士，主要從事干細(xì)胞的基礎(chǔ)研究。

腦梗死是常見(jiàn)的腦血管病類型，因腦血管供血障礙而引發(fā)缺血性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，造成神經(jīng)功能缺損。隨著人口老齡化，其發(fā)病率逐年上升，成為人類死亡和殘疾的主要病因之一。目前，針對(duì)腦梗死的溶栓治療因嚴(yán)格的時(shí)間窗而限制了獲益患者。傳統(tǒng)藥物治療雖然使疾病死亡率有所下降，但多數(shù)患者仍殘存神經(jīng)功能缺損，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。自干細(xì)胞移植理論的興起，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)移植治療腦梗死的研究中發(fā)現(xiàn)移植BMSCs可促進(jìn)腦梗死后功能改善〔1〕和組織修復(fù)〔2〕，并有望成為臨床腦梗死治療的新方法。

1BMSCs的特性

BMSCs是具有自我更新和多向分化能力的中胚層源成體干細(xì)胞，最早由Friedenstein等〔3〕從骨髓分離培養(yǎng)，體外形如長(zhǎng)梭紡錘狀，貼壁集落生長(zhǎng)；固定高表達(dá)CD90、CD106、CD29等，低表達(dá)或不表達(dá)CD34、CD45、CD11b等，區(qū)別于造血干細(xì)胞，被認(rèn)為是骨髓中的非造血成分，參與造血微環(huán)境的構(gòu)成。一般情況下可分化為脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞等中胚層源細(xì)胞，而其分化方向和免疫表型受外界微環(huán)境因素影響，在誘導(dǎo)因素作用下，可跨胚層分化為神經(jīng)細(xì)胞等〔4〕，并且研究發(fā)現(xiàn)腦組織提取液可促進(jìn)BMSCs分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞〔5〕。

BMSCs具有調(diào)節(jié)免疫炎癥作用，通過(guò)影響抗感染和炎癥因子的分泌，降低炎癥對(duì)組織的損傷〔6〕，同時(shí)可抑制炎癥環(huán)境中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化〔7〕，具有免疫調(diào)節(jié)作用。Zimmermann等〔8〕發(fā)現(xiàn)BMSCs可通過(guò)自身的旁分泌作用調(diào)節(jié)炎癥信號(hào)通路，或許BMSCs可通過(guò)多重機(jī)制調(diào)節(jié)免疫炎癥。另有研究發(fā)現(xiàn)BSMCs在缺氧環(huán)境中上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)的表達(dá)，并通過(guò)加強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)因子和生長(zhǎng)因子的分泌起到抗凋亡作用〔9〕。通過(guò)免疫炎癥的調(diào)節(jié)及營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)因子的分泌，BMSCs具有重塑其所在微環(huán)境的功能。BMSCs可自體提供、取材安全、無(wú)道德倫理沖突，再者，容易培養(yǎng)、擴(kuò)增周期短、異體移植未見(jiàn)排異〔10〕，因此，相對(duì)其他類型干細(xì)胞而言，BMSCs應(yīng)用更為廣泛。

2BMSCs移植治療腦梗死研究

幾乎在所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，移植BMSCs均能有效改善神經(jīng)功能缺損癥狀。Suzuki等〔11〕選擇腦梗死后6 h移植BMSCs，發(fā)現(xiàn)隨著梗死體積明顯減小，神經(jīng)功能缺損得到顯著改善。而Ding等〔12〕在腦梗死后第5天移植BMSCs，雖然也觀察到神經(jīng)功能缺損癥狀的好轉(zhuǎn)，但卻未發(fā)現(xiàn)梗死體積縮小?？梢?jiàn)梗死體積并不是功能預(yù)后的決定因素，并且能否有效減少梗死體積與移植時(shí)間點(diǎn)密切相關(guān)。Gutierrez-Fernandez等〔13〕移植BMSCs后雖然也發(fā)現(xiàn)梗死體積沒(méi)有差異，但在改善神經(jīng)功能缺損的同時(shí)，凋亡細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞增殖明顯，并認(rèn)為BMSCs可保護(hù)腦梗死后受損的細(xì)胞免于凋亡，從而修復(fù)受損組織，提高神經(jīng)功能。在關(guān)于腦梗死后移植BMSCs減少細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)中，Deng等〔14〕選擇在腦梗死后24 h靜脈移植BMSCs，并且在移植后14 d和28 d發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)水平的升高和細(xì)胞凋亡的減少密切相關(guān)，并認(rèn)為腦梗死缺血半暗帶的血液供應(yīng)對(duì)于抗凋亡至關(guān)重要。Bao等〔15〕則證實(shí)BMSCs通過(guò)旁分泌作用，分泌大量腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)，營(yíng)養(yǎng)支持受損神經(jīng)細(xì)胞，有效阻止凋亡，并促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生。Li等〔16〕發(fā)現(xiàn)移植BMSCs后，腦梗死病灶周圍抗炎因子白細(xì)胞介素-10(IL-10)的表達(dá)上升，降低炎癥對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的持續(xù)損害，減少細(xì)胞凋亡，并且室管膜下區(qū)細(xì)胞增殖明顯。如上所述，BMSCs可通過(guò)增強(qiáng)血液供應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)支持和調(diào)節(jié)炎癥起到抗凋亡作用，達(dá)到組織修復(fù)效果。Zhang等〔17〕證實(shí)BMSCs可以激活具有促進(jìn)細(xì)胞增殖功能的sonic hedgehog信號(hào)通路，促進(jìn)腦梗死后少突膠質(zhì)細(xì)胞增殖，修復(fù)受損神經(jīng)軸突。

但是BMSCs對(duì)腦梗死的治療效果仍然受限于BMSCs存活時(shí)間短暫的問(wèn)題。Goldmacher等〔18〕發(fā)現(xiàn)移植后腦梗死病灶中的BMSCs在第8天全部消失。為此，為獲得更大療效或發(fā)揮BMSCs的治療潛能，延長(zhǎng)干細(xì)胞的存活時(shí)間成為突破當(dāng)前瓶頸的新思路。

3BMSCs治療腦梗死的新策略

3.1缺氧預(yù)處理BMSCs腦梗死缺血缺氧導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)和大量凋亡因子等都不利于移植后BMSCs的存活。但Liu等〔19〕發(fā)現(xiàn)BMSCs在含氧量?jī)H為3%的缺氧環(huán)境中，激活具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡功能的PI3K/Akt信號(hào)通路，上調(diào)HIF的表達(dá)，提高BMSCs對(duì)缺氧環(huán)境的耐受，延長(zhǎng)BMSCs的存活時(shí)間。眾多學(xué)者重點(diǎn)研究了移植缺氧預(yù)處理的BMSCs治療腦梗死。Wei等〔20〕發(fā)現(xiàn)缺氧預(yù)處理后的BMSCs歸巢明顯，可定植于梗死皮層，并且有效減少梗死體積和缺血半暗帶處死亡細(xì)胞數(shù)。另一研究〔21〕發(fā)現(xiàn)將缺氧預(yù)處理后的BMSCs移植入腦梗死模型中有著強(qiáng)烈的神經(jīng)發(fā)生和血管再生，并認(rèn)為缺氧預(yù)處理能有效提高BMSCs的治療潛能。

3.2基因修飾BMSCs鑒于BMSCs可旁分泌BDNF、VEGF等蛋白促進(jìn)腦梗死的修復(fù)，利用內(nèi)源性基因轉(zhuǎn)染BMSCs后移植，則可使相關(guān)蛋白基因高表達(dá)，將有助于病灶修復(fù)。van Velthoven等〔22〕將BDNF基因修飾BMSCs后移植，發(fā)現(xiàn)BDNF強(qiáng)烈分泌并有效改善神經(jīng)功能缺損，但是在移植后第28天與單純移植BMSCs組神經(jīng)功能缺損無(wú)差異，治療效果主要受限于基因修飾后BMSCs不能長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定高表達(dá)目的蛋白。Liu等〔23〕將一種名為Survivin的抗凋亡基因轉(zhuǎn)染BMSCs后移植，發(fā)現(xiàn)在提高BMSCs存活率和延長(zhǎng)其存活時(shí)間的同時(shí)，BMSCs長(zhǎng)時(shí)間旁分泌VEGF和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)。Shen等〔24〕將一種名為依達(dá)拉奉(MCI-186)的氧自由基清除劑基因轉(zhuǎn)染BMSCs后移植，發(fā)現(xiàn)BMSCs存活率的提高使BDNF和VEGF得到高表達(dá)。

除了單基因轉(zhuǎn)染，有學(xué)者成功將多重基因轉(zhuǎn)染BMSCs，并將其移植治療腦梗死。Ding等〔12〕將具有促神經(jīng)發(fā)生功能的Noggin基因和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)基因雙基因轉(zhuǎn)染BMSCs后移植，兩種內(nèi)源性蛋白協(xié)同高表達(dá)，較單基因轉(zhuǎn)染移植，BMSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞現(xiàn)象更為明顯。雖然干細(xì)胞結(jié)合基因治療腦梗死更具療效，但是出于安全性的考慮，其尚未應(yīng)用于臨床。

3.3誘導(dǎo)BMSCs為神經(jīng)樣細(xì)胞BMSCs可多向分化，并能分化為神經(jīng)細(xì)胞；但研究發(fā)現(xiàn)在腦梗死病灶BMSCs僅少量表達(dá)nestin，未能分化為成熟的神經(jīng)細(xì)胞〔25〕。將BMSCs誘導(dǎo)為神經(jīng)細(xì)胞后移植成為一新思路。Heo等〔26〕將BMSCs誘導(dǎo)成為神經(jīng)元樣細(xì)胞，移植后抗炎效果加強(qiáng)，但是神經(jīng)元樣細(xì)胞在梗死灶邊緣并未分化為成熟的神經(jīng)細(xì)胞。顯然誘導(dǎo)BMSCs為神經(jīng)細(xì)胞后移植仍不成熟。首先，對(duì)于誘導(dǎo)BMSCs為神經(jīng)細(xì)胞的有效性存在爭(zhēng)議，Thomas等〔27〕發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)的BMSCs僅具有神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)而不具備相應(yīng)功能。其次應(yīng)考慮誘導(dǎo)劑的毒副作用，尤其是化學(xué)誘導(dǎo)劑具有的細(xì)胞毒性作用，將會(huì)影響細(xì)胞骨架的穩(wěn)定和變形能力。

4移植BMSCs的途徑和數(shù)量

目前關(guān)于BMSCs的移植途徑主要為靜脈途徑、頸動(dòng)脈途徑和立體定向途徑。(1)靜脈途徑：其最大優(yōu)點(diǎn)在于創(chuàng)傷微小，風(fēng)險(xiǎn)較低，可操作性強(qiáng)。缺點(diǎn)在于BMSCs歸巢量微少，大部分細(xì)胞都滯留于肺脾等外周器官〔28〕，而且細(xì)胞容易相互凝集形成細(xì)胞栓子，造成外周器官栓塞，尤其以肺栓塞多見(jiàn)。(2)頸動(dòng)脈途徑：優(yōu)點(diǎn)在于可以避免外周器官阻滯BMSCs，同時(shí)可以最小創(chuàng)傷向病灶移植大量BMSCs。缺點(diǎn)在于容易造成腦動(dòng)脈栓塞形成，引發(fā)腦梗死。(3)立體定向途徑：其優(yōu)點(diǎn)在于直接向病灶移植BMSCs，提高細(xì)胞利用率，增強(qiáng)療效。Kawabori等〔29〕證實(shí)立體定向途徑移植1 106的細(xì)胞量，其療效優(yōu)于靜脈途徑移植3 106的細(xì)胞量。其缺點(diǎn)在于損害腦組織、創(chuàng)傷較大，引發(fā)顱內(nèi)高壓，操作難度大。

關(guān)于移植細(xì)胞數(shù)量，目前主要集中在1×104～107等范圍〔13，30〕，Wang等〔30〕證實(shí)移植1×106～107的細(xì)胞量療效優(yōu)于1×104～105的細(xì)胞量。但是這并不意味移植的細(xì)胞數(shù)量越多，療效越好。首先，血液途徑移植，細(xì)胞濃度越高越容易形成細(xì)胞栓塞。其次，梗死灶貧瘠的微環(huán)境不足以營(yíng)養(yǎng)支持大量的干細(xì)胞，造成干細(xì)胞的存活率降低，結(jié)果可能適得其反。

5BMSCs治療腦梗死的具體機(jī)制

BMSCs治療腦梗死有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：(1)都能有效改善神經(jīng)功能缺損癥狀。(2)相對(duì)其他治療措施，極大延長(zhǎng)了治療時(shí)間窗〔31〕。(3)是基因工程治療的良好載體。(4)未見(jiàn)腫瘤等不良事件發(fā)生。

但是目前對(duì)于BMSCs治療腦梗死的具體機(jī)制不明，可能與以下幾個(gè)方面有關(guān)。(1)細(xì)胞替代：BMSCs移植治療腦梗死最初目的在于替代壞死細(xì)胞以恢復(fù)受損結(jié)構(gòu)。然而其有效性飽受爭(zhēng)議。首先，血管途徑移植BMSCs的歸巢量微少〔28〕及在腦梗死慢性期膠質(zhì)瘢痕的限制阻礙，能有效定植壞死部位的干細(xì)胞數(shù)量微少。再者，移植后雖然有小部分BMSCs表達(dá)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志物，但是其是否具有相應(yīng)功能有待進(jìn)一步確定。(2)營(yíng)養(yǎng)支持：研究表明移植BMSCs后凋亡的細(xì)胞數(shù)顯著減少并改善神經(jīng)缺損，這可能與BMSCs的營(yíng)養(yǎng)支持相關(guān)。研究表明移植后BMSCs可分泌BDNF、GDNF、bFGF等多種營(yíng)養(yǎng)因子〔15，23〕，對(duì)受損的神經(jīng)細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)支持。(3)免疫炎癥調(diào)節(jié)：BMSCs能旁分泌TGF-β(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子)抑制免疫細(xì)胞的播散，有效減少炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)〔32〕，可調(diào)節(jié)外周血中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞活性，減少炎癥細(xì)胞對(duì)梗死灶損害〔30〕。(4)血管再生：BMSCs可分泌VEGF支持血管再生，并且研究表明移植BMSCs后缺血半暗帶血管發(fā)生明顯〔14〕。(5)促進(jìn)內(nèi)源性修復(fù)：Li等〔33〕研究證實(shí)腦梗死后大腦自身啟動(dòng)自我修復(fù)，包括祖細(xì)胞的生成、神經(jīng)發(fā)生和血管新生。而B(niǎo)MSCs可支持祖細(xì)胞的生成、促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生和加強(qiáng)血管新生以促進(jìn)修復(fù)。

在腦梗死后不同時(shí)期移植BMSCs，其具體治療機(jī)制可能有所偏重。研究證實(shí)腦梗死早期移植BMSCs主要通過(guò)炎癥抑制和營(yíng)養(yǎng)支持發(fā)揮療效〔34〕，而恢復(fù)期移植BMSCs則偏重于血管再生〔31〕和抑制膠質(zhì)瘢痕形成以恢復(fù)功能。

6展望

目前已從多角度多方向研究利用BMSCs移植治療腦梗死，并且臨床試驗(yàn)業(yè)已開(kāi)展，但是仍然有著許多問(wèn)題亟需解決和值得深入研究。這包括預(yù)處理干細(xì)胞的最佳方式、影響干細(xì)胞存活的決定因素、移植模式以及干細(xì)胞在體內(nèi)的蹤跡和最終結(jié)局，這些問(wèn)題的盡早解決關(guān)系到治療效果的穩(wěn)定性和安全性，有利于進(jìn)一步開(kāi)展臨床試驗(yàn)。

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〔2014-11-22修回〕

(編輯袁左鳴)