瘤果黑種草子中磷脂類成分的研究

李 靜，劉玉明*，劉慶華，李 微

(1.天津理工大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，天津 300384;2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830004)

瘤果黑種草Nigella glandulifera Freyn et Sint.為毛茛科黑種草屬植物，主產(chǎn)新疆，瘤果黑種草子作為維藥收入1977年至今各版《中國藥典》，功效為利尿、活血、解毒、通乳;還可烏發(fā)、抗衰老。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，瘤果黑種草子提取物及其化學(xué)成分具有抗腫瘤的活性［1-2］。目前已從該植物中分離得到多個(gè)化學(xué)成分［3-9］。本課題組為了尋找其中水溶性且具有生物活性的天然產(chǎn)物，以進(jìn)一步了解該植物的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)該植物種子水溶性部位進(jìn)行了深入細(xì)致的化學(xué)成分研究，從中分離得到了5個(gè)化學(xué)成分，化合物3、4和5為磷脂類化合物，且為首次從該屬植物中分離得到，其中化合物5為新化合物。

1 儀器與材料

Bruker Avance III 400 MHz型核磁共振儀;Finnigan Surveyor LC-LCQ Advantage Max型質(zhì)譜儀;Bruker micrOTOF-Q II型高分辨質(zhì)譜儀;Elementar Vario EL cube型元素分析儀;北京泰克儀器有限公司生產(chǎn)的X-4型顯微熔點(diǎn)儀;瑞士BUCHI公司生產(chǎn)的C-605型中壓制備系統(tǒng)。色譜用硅膠 (100～200目，硅膠H)為青島海洋化工廠產(chǎn)品。所用試劑均為分析純。瘤果黑種草子于2011年2月購于新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市，經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所劉慶華研究員鑒定為Nigella glandulifera Freyn et Sint.的種子。

2 提取與分離

取榨過油的黑種草子餅18 kg，經(jīng)95%乙醇水溶液回流提取2次，50%乙醇水溶液回流提取2次，水回流提取2次，每次3 h，合并提取液，減壓濃縮得到總浸膏2630 g。將所得浸膏分散于3倍體積的溫水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶劑得石油醚部分840 g、乙酸乙酯部分80 g和正丁醇部分560 g。剩余水層濃縮得到1100 g，將此水部分經(jīng)硅膠柱層析，以二氯甲烷-甲醇 (10∶1～0∶1)梯度洗脫，經(jīng)TLC檢測合并，得到15份流份。其中第8份流份經(jīng)硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷-甲醇-水 (12∶4∶0.5)洗脫，得化合物1(1.5 g);第10份流份經(jīng)多次硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷-甲醇-水 (7∶3∶0.5)反復(fù)硅膠柱色譜，得化合物2(2.2 g)和化合物3(83 mg);第12份流份經(jīng)反復(fù)MPLC硅膠柱分離，以純甲醇洗脫，得化合物4(116 mg)和化合物5(19 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1:白色粉末，mp 248～250℃，［α］25D－23.1(c=0.50，MeOH).Libermann-Burchard反應(yīng)陽性，Molish反應(yīng)陽性，薄層酸水解后TLC顯示有葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和鼠李糖。HR-ESIMS(positive mode)m/z 1375.6460 ［M+Na］+(calcd 1375.6510 for C64H104O30Na).1H-NMR(C5D5N) δ:0.85、0.87、0.96、1.10、1.14、1.17(各3H，s，6×Me)，1.53(3H，d，J=6.2 Hz，Me of Rha in 3-O-Glycosyl moiety)，1.68(3H，d，J=6.2 Hz，Me of Rha in 28-O-Glycosyl moiety)，4.98(lH，d，J=7.8 Hz，Glc H-l)，5.05(lH，d，J=6.7 Hz，Ara H-l)，5.34(1H，d，J=7.6 Hz，Xyl 1-H)，5.38(1H，br s，12-H)，5.84(1H，s，1-H of Rha in 28-O-Glycosyl moiety)，6.23(lH，d，J=8.0 Hz，ester Glc H-l)，6.35(lH，s，1-H of Rha in 3-O-Glycosyl moiety)。13C-NMR(C5D5N) δ:176.7(C-28)，144.2(C-13)，123.0(C-12)，107.5(Xyl-1)，104.9(Glc-1)，104.7(Ara-1)，102.8(Rha-1in 28-O-Glycosyl moiety)，101.3(Rha-1)，95.7(ester Glc-1)，82.9(Rha-3)，81.2(C-3)，78.7(Glc-4)，78.5(ester Glc-3)，78.4(Xyl-3)，78.1(ester Glc-5)，77.2(Glc-5)，76.6(Glc-3)，75.7(Ara-2)，75.4(Xyl-2 and Glc-2)，75.1(Ara-3)，74.1(Rha-4 in 28-O-Glycosyl moiety)，74.0(ester Glc-2)，73.0(Rha-4)，72.8(Rha-3 in 28-O-Glycosyl moiety)，72.6(Rha-2 in 28-O-Glycosyl moiety)，72.0(Rha-2)，71.2(Xyl-4)，70.9(ester Glc-4)，70.4(Rha-5 in 28-O-Glycosyl moiety)，69.8(Rha-5)，69.7(Ara-4)，69.3(ester Glc-6)，67.4(Xyl-5)，66.2(Ara-5)，64.1(C-23)，61.4(Glc-6)，48.3(C-9)，47.7(C-5)，47.1(C-17)，46.3(C-19)，43.7(C-4)，42.2(C-14)，41.7(C-18)，40.0(C-8)，39.1(C-1)，37.0(C-10)，34.1(C-21)，33.2(C-29)，32.8(C-22)，32.6(C-7)，30.8(C-20)，28.4(C-15)，26.4(C-2)，26.2(C-27)，23.9(C-11)，23.8(C-30)，23.4(C-16)，18.6(Rha-6)，18.5(Rha-6 in 28-O-Glycosyl moiety)，18.2(C-6)，17.6(C-26)，16.3(C-25)，14.2(C-24)。根據(jù)以上理化性質(zhì)及光譜數(shù)據(jù)，對(duì)照文獻(xiàn) ［10］，鑒定化合物1為異株五加甲苷。

化合物2:無色黏稠液體。1H-NMR(D2O)δ:3.56(2H，dd，J=6.5，11.7 Hz，H-1A，3A)，3.65(2H，dd，J=4.3，11.7 Hz，H-1B，3B)，3.78(1H，m，H-2).13C-NMR(D2O)δ:62.5(C-1，3)，72.1(C-2)。根據(jù)以上理化性質(zhì)及光譜數(shù)據(jù)，對(duì)照文獻(xiàn) ［11］，鑒定化合物2為甘油。

化合物3:無色黏稠液體。ESI-MS，m/z(positive mode):104.1［C5H13NO+H，膽堿基］+，184.2，342.5，368.5［M-C11H22+H］+，522.5［M+H］+，544.5［M+Na］+，560.5 ［M+K］+.1H-NMR(CD3OD)δ:0.89(3H，t，J=6.4 Hz，18'-CH3)，1.27(20H，br s，H-4'to H-7'，and H-12'to H-17')，1.59(2H，br s，H-3')，2.01(4H，br s，H-8'and H-11')，2.34(2H，t，J=7.4 Hz，H-2')，3.21(9H，s，3×-NCH3)，3.63(2H，like-t，H-5)，3.89(2H，m，H-3)，3.96(1H，m，H-2)，4.09(1H，dd，J=6.1，11.3 Hz，H-1A)，4.16(1H，dd，J=4.5，11.3 Hz，H-1B)，4.29(2H，br s，H-4)，5.33(2H，m，H-9'and H-10').13C-NMR(CD3OD):δ:64.8(s，C-1)，68.5(d，JC-P=7.5 Hz，C-2)，66.4(d，JC-P=5.8 Hz，C-3)，59.0(d，JC-P=5.0 Hz，C-4)，66.1(m，C-5)，53.3(t，JC-N=3.7 Hz，3 ×-NCH3)，173.9(C-1')，33.5(C-2')，24.6(C-3')，28.8-29.4(C-4'to C-7'，and C-12'to C-15')，26.7(C-8'and C-11')，129.5(C-9')，129.4(C-10')，31.6(C-16')，22.3(C-17')，13.0(C-18')。根據(jù)以上理化性質(zhì)及光譜數(shù)據(jù)，對(duì)照文獻(xiàn) ［12］，鑒定化合物3為1-油酰-甘油-3-磷酰膽堿。

化合物4:無色黏稠液體。ESI-MS，m/z(positive mode):104.2［C5H13NO+H，膽堿基］+，258.3［M+H］+，280.2 ［M+Na］+，361.2，515.4［2M+H］+，537.4［2M+Na］+，618.3［2M+C5H13NO+H，即2M+膽堿基 +H］+，772.3［3M+H］+，794.3［3M+Na］+， 810.4 ［3M+K］+。HR-ESI-MS， m/z:280.0934 ［M+Na］+(C8H20PNO6Na，280.0926)。1H-NMR(CD3OD)δ:3.22(9H，s，3×-NCH3)，3.54(1H，dd，J=5.6，11.4 Hz，H-1A)，3.59(1H，dd，J=5.4，11.4 Hz，H-1B)，3.64(2H，like-t，H-5)，3.76(1H，m，H-2)，3.86(1H，m，H-3A)，3.91(1H，m，H-3B)，4.29(2H，br s，H-4)。13C-NMR(CD3OD):δC62.4(s，C-1)，71.1(d，JC-P=7.6 Hz，C-2)，66.5(d，JC-P=5.8 Hz，C-3)，59.0(d，JC-P=5.0 Hz，C-4)，66.0(m，C-5)，53.3(t，JC-N=3.7 Hz，3 ×-NCH3)。以上理化性質(zhì)及光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13］分析一致，鑒定化合物4為甘油磷酰膽堿。

化合物5:無色黏稠液體。ESI-MS，m/z(正離子模式):579.1［2M+H］+.HR-ESI-MS(正離子模式)m/z 579.1230［2M+H］+(calcd 579.1232 for C16H41N2O8P2S4).Anal.calcd.for C8H20NO4PS2(%):C=33.15;H=7.13;N=4.83;S=22.12;O=22.08，F(xiàn)ound:C=33.42;H=7.28;N=4.67;S=21.85;O=22.19.1H-NMR(CD3OD)δ:3.22(9H，s，3 ×-NCH3)，3.49(2H，m，H-5)，3.56(1H，dd，J=5.6，11.4 Hz，H-1A)，3.63(1H，dd，J=5.2，11.4 Hz，H-1B)，3.76(1H，m，H-2)，3.89(1H，m，H-3A)，3.91(1H，m，H-3B)，4.01(2H，m，H-4).13C-NMR(CD3OD)δ:62.5(s，C-1)，71.4(d，JC-P=6.7 Hz，C-2)，65.8(d，JC-P=5.4 Hz，C-3)，55.7(d，JC-P=0.8 Hz，C-4)，67.7(m，C-5)，53.3(t，JC-N=3.8 Hz，3×-NCH3)。根據(jù)氫譜、碳譜、ESI-MS譜、HR-ESI-MS譜和元素分析綜合判斷，其相對(duì)分子質(zhì)量為289，分子式為C8H20NO4PS2?；衔?和上述化合物4的核磁共振圖譜相似，DEPT譜顯示兩者都有1個(gè)次甲基、4個(gè)亞甲基和3個(gè)甲基，且同樣受到磷核和季氮核的偶合裂分，由此推斷化合物5也為磷酰膽堿類化合物。將上述化合物5的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)與化合物4的相應(yīng)數(shù)據(jù)比較后發(fā)現(xiàn)，兩者的丙三醇基片段部分和膽堿基片段部分化學(xué)位移極為相近，化合物5的C3和(或)C4位的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)沒有出現(xiàn)顯著的高場位移，提示化合物5中兩硫原子不與此兩片段相連接，故只能與磷原子直接相連。通過以上分析，結(jié)合1H-1H COSY、HSQC、HMBC和NOESY譜進(jìn)一步確證，鑒定化合物5的結(jié)構(gòu)為O-(1-丙三醇基)-O-(2-膽堿基)二硫代磷酸酯。

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