山羊痘病毒反向間接血凝試驗(yàn)方法的建立

陳伯祥 楊 明 李 杰

（甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅平?jīng)?744000）

山羊痘病毒反向間接血凝試驗(yàn)方法的建立

陳伯祥 楊 明 李 杰

（甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅平?jīng)?744000）

山羊痘（Goat pox，GTP）是由山羊痘病毒引起的一種全身皮膚、呼吸道、消化道黏膜出現(xiàn)痘疹為特征的高度接觸性傳染病。1997年，此病被國際獸疫局列為A類傳染病。本病主要發(fā)生在非洲、歐洲和亞洲。從1985年至今，我國河北、福建、江蘇、河南、山東、貴州、廣西等省區(qū)均有山羊痘發(fā)生和流行的報(bào)道。近年國內(nèi)山羊痘的發(fā)生與流行呈上升趨勢(shì)，給我國養(yǎng)羊業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

目前，山羊痘的診斷主要依靠臨床經(jīng)驗(yàn)來判斷，確診還需實(shí)驗(yàn)室確定。目前報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法有AGP、IHI、CIE、FAT和PCR等。為建立一種更敏感的血清學(xué)試驗(yàn)方法來檢測(cè)山羊痘病毒抗原，本研究以兔抗山羊痘病毒IgG致敏綿羊紅細(xì)胞為材料，采用反向間接血凝試驗(yàn)（RPHA）檢測(cè)山羊痘病毒抗原。

1 材料與方法

1.1 毒株

山羊痘病毒株（GTPV-S-1），由甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所引進(jìn)并保存。山羊痘活疫苗購自中牧集團(tuán)蘭州生物藥廠。

1.2 細(xì)胞

Vero-E6傳代細(xì)胞由甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所保存。綿羊睪丸細(xì)胞由本課題組制作。

1.3 方法

1.3.1 山羊痘病毒的增殖

取山羊痘病毒（GTPV-S-1）株在Vero-E6細(xì)胞上連續(xù)傳代3代，出現(xiàn)細(xì)胞病變時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)液；再在綿羊睪丸原代細(xì)胞上增殖，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)75%上收集細(xì)胞培養(yǎng)液；同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞作對(duì)照。

1.3.2 山羊痘抗原的制備

取山羊痘病毒（GTPV-S-1）在綿羊睪丸細(xì)胞上培養(yǎng)液40ml，反復(fù)凍融3次，4℃6000r/min離心30min，去除細(xì)胞碎片，收集上清液。在上清液中加入飽和硫酸銨使之達(dá)到50%濃度，4℃靜置過夜。次日，4℃6000r/min離心30min，棄上清，取沉淀以適量0.01mol/L pH7.2 PBS 懸浮，并將懸浮液通過Sephadex G-200柱層析，以0.01mol/L pH7.2 PBS進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，用722型紫外可見分光光度計(jì)測(cè)其OD260和OD280，計(jì)算其病毒蛋白含量，為純化的山羊痘病毒。依試驗(yàn)需要進(jìn)行不同濃度的濃縮，作為山羊痘抗原。

1.3.3 兔抗山羊痘病毒血清與IgG制備

用山羊痘活疫苗皮下免疫注射健康家兔，30頭份/只；7d后皮下免疫注射山羊痘活疫苗，30頭份/只；14d后皮下免疫注射山羊痘活疫苗，40頭份/只；21d耳靜脈注射山羊痘病毒（GTPV-S-1）培養(yǎng)液2ml，間隔10d后采集全血分離血清，作為兔抗山羊痘陽性血清。

取山羊痘血清20mL用飽和硫酸銨鹽析，提取IgG，并通過Sephadex G-25層析，測(cè)定洗脫液的OD280和OD260值，計(jì)算IgG含量，進(jìn)行適量濃縮后作為兔抗山羊痘病毒IgG。

1.3.4 紅細(xì)胞的醛化、鞣化與致敏

采集健康綿羊全血（加肝素抗凝），用0.01mol/L pH7.2 PBS洗滌3次，配成2.5%的紅細(xì)胞懸液；取2.5%的紅細(xì)胞懸液9份與1%戊二醛1份混合，室溫下孵育90min，洗滌3次，制成2.5%的醛化紅細(xì)胞，加入等量10-5的優(yōu)質(zhì)鞣酸溶液充分混勻，37℃水浴作用15min，洗滌2次，用PBS配制成2.5%的鞣酸化醛化紅細(xì)胞懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將2.5%的鞣酸化醛化紅細(xì)胞懸液2000r/min離心5min，取沉淀懸浮于10倍體積的0.1mol/LpH3.5醋酸鹽緩沖液中，加入等體積的純化兔抗山羊痘病毒IgG，37℃水浴感作2h，期間每隔15min輕輕吹吸混勻。用PBS洗滌5次，配成0.5%的懸液，作為兔抗山羊痘病毒IgG致敏紅細(xì)胞，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 RPHA實(shí)驗(yàn)方法的建立

取山羊痘抗原與PBS，在96孔U型血凝板上進(jìn)行微量法反向間接血凝試驗(yàn)。

1.3.5.1 最佳試驗(yàn)條件的篩選

取山羊痘抗原，在不同的兔抗山羊痘病毒IgG致敏紅細(xì)胞濃度、緩沖液、感作溫度和感作時(shí)間下，確定最佳實(shí)驗(yàn)條件。

1.3.5.2 特異性試驗(yàn)

分別取羊口瘡病毒抗原、豬瘟病毒抗原和O型口蹄疫病毒抗原，按RPHA實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行操作和判定。

1.3.5.3 對(duì)比試驗(yàn)

用感染山羊痘的皮膚黏膜痘疹經(jīng)處理取上清液作為山羊痘待檢樣品；同時(shí)，將收集的山羊痘病毒在Vero-E6上3代細(xì)胞培養(yǎng)液和在綿羊睪丸細(xì)胞上2代細(xì)胞混合培養(yǎng)液；另設(shè)細(xì)胞培養(yǎng)液為空白對(duì)照。用RPHA法和AGP法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 山羊痘病毒的增殖

GTPV-S-1能夠在Vero-E6細(xì)胞和綿羊睪丸原代細(xì)胞上增殖，且能引起典型的細(xì)胞病變。感染初期細(xì)胞變圓、收縮，聚集成簇；此后病變細(xì)胞形成拉網(wǎng)狀，細(xì)胞間隙增大，局部病變逐步擴(kuò)展、彌漫、融合，最后細(xì)胞成片脫落死亡。

2.2 山羊痘抗原

山羊痘細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)鹽析處理，層析后收集的洗脫液，測(cè)定OD280，發(fā)現(xiàn)第一峰的洗脫液能與山羊痘陽性血清出現(xiàn)沉淀線，其余各個(gè)峰值的洗脫液則不出現(xiàn)沉淀線。第一峰洗脫液的病毒蛋白含量為4.3075mg/mL。

2.3 兔抗山羊痘病毒血清與IgG制備

兔抗山羊痘血清經(jīng)AGP檢測(cè)效價(jià)為1：8。

兔抗山羊痘血清經(jīng)硫酸銨鹽析，Sephadex G-25層析，測(cè)IgG洗脫液的OD值，經(jīng)計(jì)算其蛋白含量為1.36mg/mL，其AGP效價(jià)為1：8。

2.4 RPHA實(shí)驗(yàn)方法的建立

2.4.1 RPHA法最佳工作條件

經(jīng)測(cè)定，采用0.5% 致敏紅細(xì)胞、PBS、37℃感作1h優(yōu)于0.25%致敏紅細(xì)胞、鹽水、4℃或室溫、感作時(shí)間45min或90min。

2.4.2 特異性試驗(yàn)

用兔抗山羊痘病毒IgG致敏紅細(xì)胞，分別與山羊痘病毒抗原、羊口瘡病毒抗原、豬瘟病毒抗原和O型口蹄疫病毒抗原，按RPHA實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行操作。結(jié)果顯示，兔抗山羊痘病毒IgG致敏紅細(xì)胞只與山羊痘病毒抗原發(fā)生反應(yīng)，與其他病毒抗原均不發(fā)生反應(yīng)。說明本致敏紅細(xì)胞具有特異性。

2.4.3 對(duì)比試驗(yàn)

對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果如表1。

甘肅省科技支撐計(jì)劃（1104NKCL097）

陳伯祥（1968—），男，研究員，主要從事動(dòng)物傳染病防治研究。