葉酸代謝相關(guān)基因多態(tài)性在母胎醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用及相關(guān)性研究

陳小梅，韓淑芬

(1.河北唐山市灤南婦幼保健院，河北 唐山 063500； 2.河北省唐山市婦幼保健院，河北 唐山 063500)

【出生缺陷預(yù)防】

葉酸代謝相關(guān)基因多態(tài)性在母胎醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用及相關(guān)性研究

陳小梅1，韓淑芬2

(1.河北唐山市灤南婦幼保健院，河北 唐山 063500； 2.河北省唐山市婦幼保健院，河北 唐山 063500)

目的 探討葉酸代謝相關(guān)基因多態(tài)性在母胎醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用及相關(guān)性研究。方法 該研究應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法，研究葉酸代謝與唐氏綜合征(DS)、非綜合征性唇腭裂(NSCL/P)之間的關(guān)系。結(jié)果 DS與葉酸代謝之間，經(jīng)Logistic回歸分析，攜帶MTHFR TT 基因型母親孕育DS患兒的風(fēng)險(xiǎn)是CC基因型的2.41倍(OR=2.41，95%CI：1.32～9.48，P<0.05)，MTRR基因GG基因型母親生育DS患兒的風(fēng)險(xiǎn)增加2.74倍(OR=2.74，95%CI：1.23～8.38，P<0.05)。NSCL/P與葉酸代謝之間，經(jīng)Logistic回歸分析，攜帶CBS基因的rs397589 TT 基因型使NSCL/P的患病風(fēng)險(xiǎn)提高2.51倍(OR=2.51，95%CI：1.23～14.38，P<0.05)。結(jié)論 采用分子醫(yī)學(xué)檢測(cè)，在一定程度上能夠解釋葉酸利用能力障礙所導(dǎo)致的胚胎發(fā)育異常，但是也有一定的局限性。

葉酸代謝；唐氏綜合征；非綜合征性唇腭裂；母胎醫(yī)學(xué)

據(jù)調(diào)查研究表明，活產(chǎn)新生兒中有5%左右存在各種先天缺陷，而新生兒死亡約20%由先天畸形導(dǎo)致[1-2]。人類(lèi)自身不能合成葉酸，必須依賴(lài)食物供給，葉酸(folic acid，F(xiàn)A)又稱(chēng)蝶酰谷氨酸，是人體必不可少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其主要生物學(xué)功能是作為甲基供體參與細(xì)胞內(nèi)的甲基化反應(yīng)和脫氧核糖核酸的合成，葉酸不能被人體直接利用，必需通過(guò)一系列活化才能發(fā)揮其生理功能。葉酸利用代謝異常是母嬰醫(yī)學(xué)中導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常的環(huán)境因素之一，常見(jiàn)的胚胎發(fā)育異常有(neural tube defect，NTD)[3]、唐氏綜合征(down syndrome, DS)[4]、非綜合征性唇腭裂(non syndromic cleft lip and cleft palate，NSCL/P)[5]、先天性心臟病[6-7]等。本文主要探討葉酸代謝轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，利用分子醫(yī)學(xué)檢測(cè)的手段對(duì)葉酸代謝與DS、NSCL/P之間的關(guān)系研究。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

DS研究：病例組為河北唐山市灤南婦幼保健院3年來(lái)就診治療的DS患者母親血樣80份；對(duì)照母親血樣83份，與病例母親生活環(huán)境相近，生育過(guò)孩子，無(wú)不良生育史，染色體核型正常。

NSCL/P研究：病例組為河北唐山市灤南婦幼保健院近3年來(lái)就診治療的NSCL/P患者77例，年齡12.14±8.79歲，男40例，女37例；對(duì)照組75例，年齡11.96±9.14歲，男38例，女37例，排除伴有其他畸形的綜合性唇腭裂以及其他器質(zhì)性疾病。

本研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，未違反醫(yī)學(xué)倫理學(xué)原則，所有患者均自愿加入本研究并簽署知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

本研究應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法，對(duì)還原葉酸載體(reduced folate carrier1，RFC-1)和蛋氨酸合酶(methionine synthase，MTR)基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，探討葉酸利用能力相關(guān)基因MTHFR 677C>T、MTRR 66A>G、RFC-1 80G>A和MTR 2756A>G與DS的關(guān)系。

1.2.1 標(biāo)本的收集

所有受試對(duì)象均與住院后次日清晨采血，均取肘靜脈血5mL置于真空EDTA-K2抗凝管中，以1 000r/min離心獲取血小板豐富的血漿，接著以1 800r/min離心7min從而獲取血小板貧瘠血漿。真空EDTA-K2抗凝管中，以1 500r/min離心獲取血小板豐富的血漿，接著以2 500r/min離心8min從而獲取血小板貧瘠血漿。

1.2.2 主要試劑及儀器

主要試劑：RNA提取物試劑盒購(gòu)于美國(guó)ABI公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于美國(guó)LC Science公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生生物有限公司。儀器：臺(tái)式離心機(jī)(Eppendorf Mini spin，Beckman公司)、紫外交聯(lián)儀(BIO-RAD公司)、凝膠成像分析儀(美國(guó)ABI公司)以及定量PCR儀(uVP公司)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.3.1 組織與血漿中RNA的提取 取500μL血小板貧瘠血漿置于1.5mLEP管中，加入20μL的Proteinase K消化液進(jìn)行消化，然后按照Trizol LS試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行后續(xù)操作，使用NanoDrop 1 000檢測(cè)血漿中總RNA的濃度。

1.2.3.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性反應(yīng) 首先配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，即：無(wú)RNA酶雙蒸水14.75μL，0.5μLRNase抑制劑，1μL逆轉(zhuǎn)錄酶。將100ng總RNA、2μLRT引物以及5μLBuffer加入到上述反應(yīng)體系中，在43℃50min中，95℃5min中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。，再進(jìn)行PCR反應(yīng)：需要5μLcDNA、1μL上游引物以及下游引物、12.5μL 2×Master Mix，補(bǔ)充雙蒸水至25μL，95℃預(yù)變性5min中，95℃變性25s，50℃退火30s，70℃延伸40s，35個(gè)循環(huán)，72℃后延伸5min。RT引物以及PCR引物見(jiàn)表1。記錄各個(gè)反應(yīng)管中的熒光信號(hào)所設(shè)立的閾值時(shí)循環(huán)數(shù)(CT值)，將原始數(shù)據(jù)取3次以上重復(fù)掃描后取平均值，以U6作為內(nèi)參進(jìn)行歸一，計(jì)算MTHFR 677C>T、MTRR 66A>G、RFC-1 80G>A和MTR 2756A>G相對(duì)表達(dá)情況，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法，對(duì)CBS和SHMTI基因上的兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)rs397589和rs1979276進(jìn)行檢測(cè)。MTHFR-C677T、MTHFR-A1298C和MTRR-A66G凝膠圖像顯示見(jiàn)附圖。

表1 葉酸代謝相關(guān)基因以及U6的RT-PCR引物序列

Table 1 Folate metabolism-related genes and RT-PCR primer sequences of U6

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0軟件處理。應(yīng)用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)，分析基因頻率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，確認(rèn)樣本的群體代表性?；蛐鸵约盎蝾l率分布的比較采用Pearsonχ2檢驗(yàn)。關(guān)聯(lián)分析用χ2檢驗(yàn)和Logistic回歸分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 唐氏綜合征與葉酸利用能力的關(guān)系

2.1.1 等位基因頻率的分布

MTHFR 677C>T、MTRR 66A>G、RFC-1 80G>A和MTR 2756A>G等位基因頻率的分布經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)病例組和對(duì)照組各基因型達(dá)到遺傳平衡(均P>0.05)，具有群體代表性。MTHFR、MTRR、RFC-1和MTR等位基因頻率的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為1.438、1.185、0.413、0.253，均P>0.05)，見(jiàn)表2。

2.1.2 MTHFR、MTRR、還原葉酸載體和蛋氨酸合酶各基因型與唐氏綜合征發(fā)生的關(guān)系

經(jīng)Logistic回歸分析，攜帶MTHFR TT 基因型母親孕育DS患兒的風(fēng)險(xiǎn)是CC基因型的2.41倍(OR=2.41，95%CI：1.32～9.48，P<0.05)，而CT合并TT基因型未顯著增加DS發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。以AA合并AG基因型為參照，MTRR基因GG基因型母親生育DS患兒的風(fēng)險(xiǎn)增加2.74倍(OR=2.74，95%CI：1.23～8.38，P<0.05)，見(jiàn)表3。

表2 MTHFR 677C>T、MTRR 66A>G、RFC-1 80G>A和MTR 2756A>G等位基因頻率的分布[n(%)]

Table 2 Allele frequency distribution of MTHFR 677C>T, MTRR 66A>G, RFC-1 80G>A and MTR 2756A>G [n(%)]

附圖 凝膠圖像顯示檢測(cè)多態(tài)性PCR-RFLP圖譜

Fig. Gel image showing PCR-RFLP pattern of the examined polymorphism

表3 MTHFR、MTRR、RFC-1和MTR多態(tài)性與DS關(guān)系的Logistic回歸分析

Table 3 Logistic regression analysis of the relationship between MTHFR, MTRR, RFC-1, MTR polymorphism and DS

2.2 非綜合征性唇腭裂與葉酸利用能力的關(guān)系

2.2.1 CBS和SHMT1基因上兩個(gè)SNP的等位基因頻率的分布

經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)病例組和對(duì)照組各基因型達(dá)到遺傳平衡(P>0.05)，兩個(gè)SNP位點(diǎn)基因頻率均符合Hardy-Weinberg平衡，具有群體代表性。兩個(gè)SNP位點(diǎn)基因頻率的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為3.423、1.827，均P>0.05)，見(jiàn)表4。

表4 CBS和SHMT1基因兩個(gè)SNP的等位基因頻率的分布[n(%)]

Table 4 Allele frequency distribution of two SNP on CBS and SHMT1 genes[n(%)]

2.2.2 CBS和SHMT1基因上兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性的等位基因與非綜合征性唇腭裂發(fā)生的關(guān)系

經(jīng)Logistic回歸分析，攜帶CBS基因的rs397589 TT 基因型使NSCL/P的患病風(fēng)險(xiǎn)提高2.51倍(OR=2.51，95%CI：1.23～14.38，P<0.05)，而GT和GG基因型未顯著增加NSCL/P發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，見(jiàn)表5。

表5 CBS和SHMT1基因上兩個(gè)SNP的等位基因多態(tài)性與NSCL/P關(guān)系的Logistic回歸分析(n)

3 討論

3.1 葉酸代謝基因與唐氏綜合征的關(guān)系

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在分子醫(yī)學(xué)檢測(cè)基因型模式下，攜帶MTHFR TT 基因型母親孕育DS患兒的風(fēng)險(xiǎn)是CC基因型的2.41倍(P<0.05)，而CT合并TT基因型未顯著增加DS發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。以AA合并AG基因型為參照，MTRR基因GG基因型母親生育DS患兒的風(fēng)險(xiǎn)增加2.74倍(P<0.05)。雖然引起DS發(fā)生的染色體不分離機(jī)制至今還不明確，但本研究顯示，葉酸代謝相關(guān)基因特別是MTHFR、MTRR突變與DS發(fā)生相關(guān)。還原葉酸載體-1(reduced folate carrier，RFC-1)幫助5-甲基四氫葉酸(methyltetrahydrofolate，5-MeTHF)進(jìn)入細(xì)胞，RFC-1基因變異可引起葉酸轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷，進(jìn)而可能導(dǎo)致與葉酸代謝有關(guān)的出生缺陷發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加。結(jié)合本研究的發(fā)現(xiàn)，RFC-1 80G>A多態(tài)性單獨(dú)分析可能較少影響葉酸代謝，與DS的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)無(wú)顯著關(guān)聯(lián)，但不能排除其與其他葉酸代謝基因之間存在交互和修飾效應(yīng)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)CBS和SHMT1基因進(jìn)行了trans-phase基因-基因相互作用分析，發(fā)現(xiàn)攜帶CBS基因的rs397589 TT 基因型使NSCL/P的患病風(fēng)險(xiǎn)提高2.51倍(P<0.05)。說(shuō)明在NSCL/P的發(fā)生中，這兩個(gè)基因的相互作用發(fā)揮關(guān)鍵的作用。如果這兩個(gè)代謝酶基因存在與疾病有關(guān)的相互作用，一方面會(huì)影響Hcy的轉(zhuǎn)硫代謝，造成Hcy在體內(nèi)堆積，形成Hcy血癥[8]；另外一方面，會(huì)影響四氫葉酸的功能[9]，破壞DNA的正常甲基化和人類(lèi)基因組的完整性，使得這種相互作用成為NSCL/P形成的潛在危險(xiǎn)因素。

3.2 葉酸代謝基因的局限性

在母嬰醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，采用分子醫(yī)學(xué)檢測(cè)手段，在一定程度上能夠解釋葉酸利用能力障礙所導(dǎo)致的胚胎發(fā)育異常，但是也有一定的局限性。由于葉酸代謝和蛋氨酸合成通路涉及的相關(guān)代謝酶和基因很多，還應(yīng)該對(duì)多個(gè)相關(guān)基因同時(shí)進(jìn)行基因變異篩查。本研究在母嬰醫(yī)學(xué)領(lǐng)域罕有報(bào)道，可以相信隨著分子醫(yī)學(xué)檢測(cè)水平的不斷提高，葉酸代謝障礙所導(dǎo)致的胚胎發(fā)育異常將不再是嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題。

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[專(zhuān)業(yè)責(zé)任編輯：于學(xué)文]

Application of polymorphism of folate metabolism related gene in molecular medical examination of maternal-fetal medicine

CHEN Xiao-mei1, HAN Shu-fen2

(1.ChildHealthHospitalofLuannanofTangshanCity,HebeiTangshan063500,China; 2.ChildHealthHospitalofTangshanCity,HebeiTangshan063500,China)

Objective To investigate the application of polymorphism of folate metabolism related gene in molecular medical examination of maternal-fetal medicine.Methods Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method was used to study the relationship between folate metabolism and Down’s syndrome (DS) as well as non syndromic cleft lip and palate (NSCL/P).Results Logistic regression analysis showed that the risk of mothers carrying TT genotype of MTHFR gene was 3.62 times of that of the mothers carrying CC genotype in procreating children with DS (OR=2.41,95%CI:1.32-9.48,P<0.05), and the risk of mothers carrying GG genotype of MTRR gene increased by 2.74 times in procreating children with DS (OR=2.74,95%CI:1.23-8.38,P<0.05). Logistic regression analysis indicated that the risk of NSCL/P among mothers carrying rs397589 TT genotype of CBS gene enhanced 2.765 times (OR=2.51,95%CI:1.23-14.38,P<0.05).Conclusion Molecular medical examination means, to a certain extent, can explain the abnormal embryonic development caused by folic acid use disability, but there are some limitations.

folate metabolism; Down’s syndrome (DS); non syndromic cleft lip and palate (NSCL/P); maternal-fetal medicine

2014-06-25

陳小梅(1974-)，女，主治醫(yī)師，主要從事婦產(chǎn)科臨床工作。

韓淑芬，主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.01.048

R715.5

A

1673-5293(2015)01-0125-04