動(dòng)物中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶2研究進(jìn)展

綜述與專論

動(dòng)物中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶2研究進(jìn)展

呂丹，張連峰

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100021)

【摘要】哺乳動(dòng)物中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族包括DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferase 1, Dnmt1)，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶2(DNA methyltransferase 2, Dnmt2，也叫做天冬氨酸t(yī)RNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(tRNA aspartic acid methyltransferase 1, TRDMT1))和 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3(DNA methyltransferase 3, Dnmt3)。Dnmt2在進(jìn)化史上比Dnmt1和Dnmt3更古老，存在于更多物種中，包括植物、真菌、寄生蟲(chóng)、昆蟲(chóng)、魚(yú)類、兩棲類、鳥(niǎo)類和哺乳動(dòng)物，但其生化學(xué)機(jī)制和生物學(xué)功能仍不十分清楚，已有研究報(bào)道也存在許多矛盾之處。本文僅就Dnmt2在動(dòng)物中的研究，包括其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，對(duì)RNA甲基化的作用及相關(guān)生物學(xué)表型的研究進(jìn)展作一總結(jié)。

【關(guān)鍵詞】Dnmt2；甲基化；RNA；功能

[基金項(xiàng)目]北京市自然科學(xué)基金(7122111)；國(guó)家自然科學(xué)基金(31301932)。

[作者簡(jiǎn)介]呂丹(1980-)，女，副研究員，研究方向：心肌病及高血壓相關(guān)動(dòng)物模型建立及相關(guān)調(diào)節(jié)基因功能研究。E-mail: lvd@cnilas.org。

[通訊作者]張連峰，E-mail: zhanglf@cnilas.org。

【中圖分類號(hào)】R33【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.002.012

Research progress of DNA methyltransferase 2 in animals

LU Dan, ZHANG Lian-feng

(Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine, Ministry of Heath,

Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences &

Comparative Medical Center, Peking Union Medical College, Beijing 100021, China)

Abstract【】There are three members in DNA methyltransferase family of mammals, DNA methyltransferase 1 (Dnmt1), DNA methyltransferase 2 (Dnmt2, also named tRNA aspartic acid methyltransferase 1, TRDMT1) and DNA methyltransferase 3 (Dnmt3). Dnmt2 is immemorial than Dnmt1 and Dnmt3, and it exists in plant, fungi, parasites, insects, fish, amphibians, aves and mammalia, however, its biological function is still unknown. The structure characteristics, RNA methylation, function analysis and scientific problems are discussed in this paper.

【Key words】Dnmt2; Methylation; RNA; Function; Animals

DNA甲基化是一種在原核和真核生物基因組中常見(jiàn)的復(fù)制后修飾，是基因組信息流調(diào)控的重要方式，參與染色體結(jié)構(gòu)維持、基因調(diào)控、RNA降解、基因印記和X染色體滅活等重要的生理生化過(guò)程，并通過(guò)基因組信息流的調(diào)控影響胚胎發(fā)育、組織維持、衰老和疾病發(fā)生。哺乳動(dòng)物中有兩類DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，第一類是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferase 1, Dnmt1)負(fù)責(zé)DNA甲基化水平的維持。第二類包含DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A(DNA methyltransferase 3A, Dnmt3A)，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B(DNA methyltransferase 3B, Dnmt3B)和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3L(DNA methyltransferase 3L, Dnmt3L)，負(fù)責(zé)DNA的初始甲基化。

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家系中還有一個(gè)成員，即DNA甲基轉(zhuǎn)移酶2(DNA methyltransferase 2, Dnmt2)，也叫做天冬氨酸t(yī)RNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(tRNA aspartic acid methyltransferase 1, TRDMT1)。Dnmt2在進(jìn)化史上比Dnmt1和Dnmt3s更古老，存在的物種更廣泛，包括植物、真菌、寄生蟲(chóng)、昆蟲(chóng)、魚(yú)類、兩棲類、鳥(niǎo)類和哺乳動(dòng)物[1]，其生化學(xué)機(jī)制和生物學(xué)功能一直不十分清楚，已有研究報(bào)道也存在許多矛盾之處。

1998年Okano M和Yoder JA兩個(gè)研究小組發(fā)現(xiàn)，在小鼠和人的細(xì)胞中有一個(gè)包含大部分甲基化轉(zhuǎn)移酶功能域的基因，與酵母(yeast Schizosaccharomyces)的 pombe基因有很高的同源性，并命名為Dnmt2[2-3]。同年Van den Wyngaert等用Northen blot技術(shù)研究了Dnm2組織表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)廣泛，但表達(dá)水平很低[4]，主要存在于肌肉、發(fā)育中的胚胎內(nèi)臟、卵巢囊腫以及增殖中的睪丸細(xì)胞中[5]。Dnmt2在斑馬魚(yú)中定位于細(xì)胞質(zhì)中[6]，而在果蠅中則存在于胞漿和核內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)定位顯示大量的Dnmt2結(jié)合于核基質(zhì)處，在有絲分裂前期進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，呈現(xiàn)類紡錘體式定位，并在細(xì)胞分裂過(guò)程中可觀察到與DNA結(jié)合[5]，這些研究結(jié)果預(yù)示著Dnmt2可能有多方面的功能。

1Dnmt2的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

Dnmt2與Dnmt1及Dnmt3s比較(圖1，見(jiàn)封三)，缺少N端的調(diào)節(jié)功能域，保留了由10個(gè)進(jìn)化保守的基序(motifs)構(gòu)成的催化功能域和靶結(jié)合域[4，7]。

本文綜合了NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene)中人類(Homosapiens)Dnmt2蛋白序列(NP_004403.1)，大鼠(Rattusnorvegicus)Dnmt2蛋白序列(NP_001026813.1)，小鼠(Musmusculus)Dnmt2蛋白序列(NP_034197.3)和果蠅(Drosophilamelanogaster)Dnmt2蛋白序列(NP_477475.1)以及Reinhardt等綜述提供的有關(guān)信息[8]，列入圖2(見(jiàn)封三)中。通過(guò)對(duì)比分析可以看出，人類、大鼠及小鼠的Dnmt2 蛋白在基序VIII 和靶識(shí)別序列之間有一個(gè)60個(gè)氨基酸的序列，該序列在果蠅的Dnmt2 蛋白中卻不存在[9-10]。人類、大鼠、小鼠和果蠅的基序IV、基序VI 和靶識(shí)別序列中與催化活性以及底物結(jié)合相關(guān)的區(qū)域存在著5個(gè)高度相似區(qū)域。在基序VIII-IX區(qū)有41個(gè)保守的氨基酸，其中包含Cys-Phe-Thr三肽和Asp-Ile二肽, 這個(gè)區(qū)域與原核生物DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的TRD結(jié)構(gòu)域相一致[11]。人類、大鼠和小鼠的Dnmt2氨基酸序列高度相似，人類和大鼠的氨基酸殘基數(shù)相同，而小鼠在C端比人類和大鼠多出了25個(gè)氨基酸殘基。

2DNMT2與DNA甲基化無(wú)關(guān)

Dnmt2蛋白有一個(gè)十分保守的DNA(cytosine-5)甲基化轉(zhuǎn)移酶催化功能域，X射線結(jié)晶研究證實(shí)，人類的Dnmt2結(jié)構(gòu)和細(xì)菌的高度相似，并且可以與DNA形成具有變性抗性的復(fù)合物[11]，純化的重組人Dnmt2在體外可以使DNA序列中0.5%的C堿基甲基化[12]。到目前為止，有幾個(gè)研究報(bào)告證實(shí)Dnmt2在哺乳類細(xì)胞、果蠅和痢疾阿米巴(parasiteEntamoebahistolytica)中有微弱的DNA甲基化活性[13-18]，但是，也有Dnmt2不參與DNA甲基化的研究報(bào)告，最早在一種線蟲(chóng)(Pristionchuspacificus)中發(fā)現(xiàn)，Dnmt2沒(méi)有DNA甲基化的活性[19]。 Raddatz G等利用全基因組甲基化分析技術(shù)分析了果蠅和曼氏血吸蟲(chóng)(Schistosomamansoni)這兩種只表達(dá)Dnmt2 動(dòng)物的全基因組甲基化水平，證實(shí)這類動(dòng)物的全基因組沒(méi)有明顯的DNA甲基化譜。Dnmt2敲除和未敲除的果蠅基因組甲基化水平?jīng)]有明顯的區(qū)別，而在小鼠的胚胎細(xì)胞中，敲除了Dnmt1和Dnmt3，僅保留Dnmt2后不能維持DNA甲基化譜[20]。Zemach A和Takayama S等分別在斑馬魚(yú)和果蠅中失活Dnmt2，卻不影響其基因組的甲基化[21-22]。所以Dnmt2 不是一種DNA甲基化酶，已逐漸成為主流觀點(diǎn)。

3Dnmt2對(duì)內(nèi)源RNA甲基化

Dnmt2不是一種DNA甲基化酶，而是一種RNA甲基化酶已被越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的Dnmt2的功能性底物RNA分子是tRNA(Asp)，Dnmt2能夠特異性甲基化tRNA(Asp)反密碼子環(huán)38C[23]。隨后證實(shí)除了tRNA(Asp)之外，tRNA(Val) tRNA(Gly) 和tRNA(Glu)也可被Dnmt2甲基化，并保護(hù)這幾種tRNA不被RNA酶降解[24-25]。同時(shí)敲除Dnmt2和NSun2這兩種RNA甲基化酶基因后，小鼠tRNA穩(wěn)定性減低并導(dǎo)致蛋白合成受到抑制[26]。Dnmt2的作用不僅局限于tRNA甲基化，還具有廣泛的RNA甲基化活性。在小鼠中Kit 基因能改變毛色，但在Dnmt2敲除的小鼠中，Kit 基因具有通過(guò)表觀遺傳方式改變毛色的作用不復(fù)存在。用miR-124 microRNA抑制Sox9基因表達(dá)后小鼠會(huì)過(guò)度生長(zhǎng)，但在Dnmt2敲除小鼠中，miR-124 microRNA對(duì)Sox9基因的抑制作用也同時(shí)被消除，說(shuō)明Kit和miR-124 microRNA介導(dǎo)的表觀遺傳表型需要Dnmt2活性[27]。綜上，由于RNA甲基化分析技術(shù)局限性，目前發(fā)現(xiàn)的Dnmt2的RNA底物還十分有限，但是，研究已表明Dnmt2具有廣泛的內(nèi)源RNA甲基化活性，并且在表觀遺傳中的重要作用。

Dnmt2在結(jié)構(gòu)上不屬于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家系，與已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的RNA甲基轉(zhuǎn)移酶在序列和結(jié)構(gòu)上沒(méi)有相似性，不是一種常規(guī)的RNA甲基轉(zhuǎn)移酶。為了闡明Dnmt2酶的催化機(jī)制，Jurkowski等突變了人Dnmt2的C24、C140、C287和C292等幾個(gè)在RNA甲基轉(zhuǎn)移酶中起作用的位點(diǎn)，結(jié)果不影響Dnmt2在tRNA(ASP)的C38 甲基化活性，但是突變了通常在DNA甲基化中起作用的一個(gè)谷氨酸殘基(E119)后，Dnmt2甲基化活性消失。說(shuō)明Dnmt2是以DNA甲基化的方式催化RNA的甲基化[28]。他們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Dnmt2主要作用于tRNA反義密碼的頸和環(huán)[29]，RNA的一段雙鏈區(qū)，比如tRNA的雙鏈“頸”，是不是Dnmt2與RNA結(jié)合所必需的結(jié)構(gòu)仍有待實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

4Dnmt2對(duì)病源RNA作用

Dnmt2存在于原核生物和真核生物，包括植物、真菌、寄生蟲(chóng)、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物的基因組中，可能是在長(zhǎng)期進(jìn)化篩選壓力下保留下的基因之一[1]。Dnmt2表達(dá)水平很低，但是在應(yīng)激刺激時(shí)表達(dá)上調(diào)[30-31]。Durdevic等最近的研究發(fā)現(xiàn)，在敲除Dnmt2的果蠅中，固有免疫代償性的活化，而果蠅C病毒(DrosophilaC virus, DCV)在敲除Dnmt2的果蠅中有堆積的現(xiàn)象。Dnmt2可以結(jié)合DCV病毒RNA起到控制作用[32]。所以Dnmt2有可能是古老的病源防疫機(jī)制的因子之一[7]。

5動(dòng)物中Dnmt2 相關(guān)生物學(xué)表型仍然不明確

Dnmt2既然是在長(zhǎng)期進(jìn)化篩選壓力下保留的基因，可以推測(cè)該基因具有十分重要的生物學(xué)功能。但是，目前在寄生蟲(chóng)、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物的研究中，尤其在小鼠研究中尚未發(fā)現(xiàn)重要的Dnmt2相關(guān)生物學(xué)表型，然而，在人腫瘤細(xì)胞(Hela)和人胚胎腎細(xì)胞(HEK293)中Dnmt2過(guò)表達(dá)引起細(xì)胞死亡。表1總結(jié)了到目前為止，對(duì)Dnmt2基因生物功能的研究結(jié)果。

6展望

Dnmt2，尤其是在哺乳動(dòng)物和人類中的作用尚有很多不解之處：(1)目前僅發(fā)現(xiàn)了幾種Dnmt2所引起的甲基化的RNA，那么Dnmt2對(duì)RNA的作用是全面性的還是局限性的？這需要不斷進(jìn)步的RNA甲基化分析技術(shù)的支持。隨著Dnmt2引起的甲基化的RNA譜數(shù)據(jù)的積累，可逐步了解Dnmt2在基因組到RNA再到蛋白質(zhì)及整個(gè)信息流的調(diào)控中發(fā)揮的作用。另外，Dnmt2以DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的方式對(duì)RNA起作用， Dnmt2與RNA的結(jié)合需要RNA雙鏈“頸”的結(jié)構(gòu)嗎？仍需進(jìn)一步證實(shí)。(2)Dnmt2在小鼠和人類的組織中表達(dá)都很低，Dnmt2是否在應(yīng)急狀態(tài)下才表達(dá)以及其表達(dá)調(diào)控的機(jī)制現(xiàn)在都不清楚，同時(shí)Dnmt2在應(yīng)激和抵抗病原感染中的重要性也需要深入研究。(3)Dnmt2在哺乳動(dòng)物中的生物學(xué)功能，或者相關(guān)聯(lián)的表型是什么？需要Dnmt2基因過(guò)表達(dá)和基因敲除的動(dòng)物模型對(duì)比研究，也需要在應(yīng)急狀態(tài)下對(duì)比研究，僅一種Dnmt2基因敲除小鼠沒(méi)有明顯表型不能完全說(shuō)明問(wèn)題，此外，也需要Dnmt2基因過(guò)表達(dá)和基因敲除的其他物種，如大鼠等，來(lái)進(jìn)一步確定其生物學(xué)功能。

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〔修回日期〕2014-12-08