大鼠胸髓橫斷后腰髓下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的變化

熊?chē)?guó)星，洪毅，張軍衛(wèi)，陳世錚，關(guān)驊

·基礎(chǔ)研究·

大鼠胸髓橫斷后腰髓下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的變化

熊?chē)?guó)星1，洪毅2，3，張軍衛(wèi)2，3，陳世錚2，3，關(guān)驊2，3

目的 探討脊髓損傷后遠(yuǎn)端下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)、功能的改變。方法 將70只Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為T(mén)10脊髓橫斷3 d組（n=10）、1周組（n=10）、2周組（n=10）、4周組（n=15）、8周組（n=15）和假手術(shù)組（n=10），進(jìn)行L4-6脊髓節(jié)段TUNEL熒光標(biāo)記、AChE酶組化定量檢測(cè)。結(jié)果 TUNEL標(biāo)記法觀察損傷遠(yuǎn)端脊髓前角的細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果僅偶見(jiàn)熒光標(biāo)記物。脊髓橫斷3 d時(shí)，AChE陽(yáng)性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元（面積＞300 μm2）的OD值明顯減?。≒＜0.01）；損傷1周時(shí)，OD值突然明顯增大（P＜0.01）；隨后OD值再次下降，至4周時(shí)降至最低點(diǎn)，然后再次增加，8周時(shí)與假手術(shù)組仍存在顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)論 脊髓損傷后遠(yuǎn)端下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元沒(méi)有明顯減少及結(jié)構(gòu)的不可逆改變，但代謝功能發(fā)生顯著的可逆性變化。

脊髓損傷；跨神經(jīng)元變性；功能重組

［本文著錄格式］熊?chē)?guó)星，洪毅，張軍衛(wèi)，等.大鼠胸髓橫斷后腰髓下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的變化［J］.中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐，2015，21（2）: 142-147.

CITED AS:Xiong GX，Hong Y，Zhang JW，et al.Functional and structural changes of lower motor neuron distal to the site of rats with spinal cord transection at T10［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2015，21（2）:142-147.

脊髓損傷后有無(wú)跨神經(jīng)元變性，目前尚無(wú)定論［1］。早期組織形態(tài)學(xué)研究結(jié)果顯示，脊髓損傷后遠(yuǎn)端神經(jīng)元數(shù)目明顯減少（20%甚至更多），支持跨神經(jīng)元變性的存在［2］。而近年來(lái)運(yùn)用神經(jīng)元示蹤方法，研究發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后遠(yuǎn)端下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目無(wú)明顯減少，不支持跨神經(jīng)元變性的存在［3］；有的研究發(fā)現(xiàn)數(shù)目減少但認(rèn)為是其他的原因影響數(shù)目的減少［4］。

脊髓損傷后其遠(yuǎn)端神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和/或功能的改變將會(huì)影響神經(jīng)再生及功能重建的過(guò)程和結(jié)果。通過(guò)對(duì)脊髓損傷遠(yuǎn)端下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能變化的研究，將對(duì)脊髓損傷功能重建研究提供科學(xué)依據(jù)，也將對(duì)脊髓損傷功能康復(fù)（如功能性電刺激）療效評(píng)估提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Sprague-Dawley雌性大鼠70只，體重為200～250 g，均購(gòu)自中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物飼養(yǎng)中心。隨機(jī)分為脊髓橫斷3 d組、1周組、2周組各10只，4周組、8周組各15只，假手術(shù)組（椎板切除組）10只。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備

消毒器械一套，以體積分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛腹

2 結(jié)果

2.1 L4-6前角細(xì)胞TUNEL熒光標(biāo)記結(jié)果

假手術(shù)組偶見(jiàn)散在的熒光標(biāo)記物，主要出現(xiàn)于白質(zhì)區(qū)域。

脊髓橫斷組3 d、1周、2周、4周、8周組損傷遠(yuǎn)端脊髓前角偶見(jiàn)熒光標(biāo)記物，其中1周組稍多。而損傷近端（1周組）灰質(zhì)、白質(zhì)區(qū)均見(jiàn)較多熒光標(biāo)記物，陽(yáng)性反應(yīng)物表現(xiàn)出典型的核濃縮、核變形、碎裂現(xiàn)象。見(jiàn)圖1。

2.2 L4-6前角細(xì)胞AChE酶組化檢測(cè)及OD值

假手術(shù)組：光鏡下見(jiàn)AChE陽(yáng)性部位分布和密度與Nacimiento報(bào)道［5］的一致。主要分布于脊髓前角，所有前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元內(nèi)AChE活性較強(qiáng)，酶反應(yīng)顆粒元沒(méi)有直接受損?？梢?jiàn)，損傷遠(yuǎn)端運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元所有的蛋白合成減少是AchE染色減弱最可能的原因。

脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的AchE動(dòng)態(tài)變化可能反映了AchE合成、軸索運(yùn)輸及不同分子形式轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)機(jī)制。損傷后超微結(jié)構(gòu)研究可能有助于判斷是否有AchE的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)再分布。

3.2 脊髓損傷遠(yuǎn)端下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元未見(jiàn)明顯凋亡

凋亡一詞由Kerr等于1972年首次提出。它是以細(xì)胞和細(xì)胞核皺縮、染色質(zhì)密度增加，膜芽出為特征，因其過(guò)程需要精確的基因轉(zhuǎn)錄和一定量蛋白質(zhì)合成，因此被認(rèn)為是一種主動(dòng)性、不同于壞死的死亡形式。1996年Li等首先觀察脊髓壓迫損傷后的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)在傷后的第4天和第9天分別出現(xiàn)較多的凋亡細(xì)胞，主要是少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，都分布在白質(zhì)的前索、側(cè)索和后索中，持續(xù)3周以上，而灰質(zhì)內(nèi)未見(jiàn)有細(xì)胞凋亡［8］。Crowe等通過(guò)改良Allen氏法致傷猴脊髓T10節(jié)段，運(yùn)用TUNEL法進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)傷后6 h在損傷部位出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，傷后8 d和3周凋亡細(xì)胞主要分布在損傷部位兩端脊髓的傳導(dǎo)束內(nèi)，并可見(jiàn)到髓磷脂，提示凋亡可能同時(shí)伴有脊髓傳導(dǎo)束的Wallerian變性［9］。而Yong等在大鼠脊髓嚴(yán)重挫傷模型中發(fā)現(xiàn)白質(zhì)、灰質(zhì)均在傷后1 d發(fā)現(xiàn)凋亡表現(xiàn)［10］。但目前凋亡機(jī)制不很清楚，可能是源于導(dǎo)致軸突脫髓鞘的不利細(xì)胞環(huán)境，或者是Wallerian變性的結(jié)果，也可能二者皆而有之。

用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法較多，其中TUNEL法是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法。該方法是對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能較準(zhǔn)確地反映細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片等，并可檢測(cè)出極少量的凋亡細(xì)胞，因而在細(xì)胞凋亡的研究中被廣泛采用［11］。本研究中，使用TUNEL法觀察大鼠脊髓橫斷的遠(yuǎn)、近端神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況。發(fā)現(xiàn)損傷近端凋亡現(xiàn)象明顯，而遠(yuǎn)端很少見(jiàn)到凋亡細(xì)胞，而且凋亡細(xì)胞主要在白質(zhì)區(qū)，這些與以前的研究所見(jiàn)相一致。表明脊髓損傷后遠(yuǎn)端運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元無(wú)明顯的繼發(fā)凋亡。

3.3 脊髓損傷遠(yuǎn)端下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元可能有可逆性變性

神經(jīng)系統(tǒng)損傷后存在跨神經(jīng)元變性。如初級(jí)視皮層被摘除3年后，26只恒河猴視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞明顯減少，考慮為跨神經(jīng)元變性［12］，側(cè)枕葉梗死后可見(jiàn)雙側(cè)視神經(jīng)萎縮［13］，多發(fā)性側(cè)索硬化兒童丘腦、胼胝體壓部明顯縮小［14］。不過(guò)，脊髓損傷后是否有跨神經(jīng)元變性存在爭(zhēng)議。

20世紀(jì)90年代以前，大多數(shù)研究證實(shí)脊髓損傷后其遠(yuǎn)端及大腦皮層存在跨神經(jīng)元變性。Van Alphen等報(bào)道截癱患者（頸髓、胸髓損傷3例）死亡后發(fā)現(xiàn)腰骶髓前角細(xì)胞減少。Eidelberg等報(bào)道成年大鼠T8～T10脊髓完全橫斷后1周光鏡和電鏡下L4～L5運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元有明顯減少（約25%）［2］。上述作者結(jié)論均認(rèn)為存在跨神經(jīng)元變性。

國(guó)內(nèi)學(xué)者觀察了大鼠T12脊髓橫斷后頭尾兩端的局部改變，光鏡下見(jiàn)C4、L4前角神經(jīng)元有破碎、消失或固縮，腰髓前角的變化是跨神經(jīng)元變性，電鏡下觀察分為暗變性、亮變性和壞死崩解。Bose等進(jìn)行大鼠胸髓（T8）挫傷4個(gè)月后的研究，非結(jié)合型霍亂毒素B亞組溶液注射入比目魚(yú)肌行逆行性神經(jīng)元標(biāo)記。神經(jīng)元標(biāo)記結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胸髓損傷大鼠比目魚(yú)肌運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元減少16%，且神經(jīng)元大小分布和樹(shù)突形態(tài)發(fā)生明顯變化。認(rèn)為數(shù)目和形態(tài)的變化可能源于細(xì)胞減少（跨神經(jīng)元變性），或中等細(xì)胞向大細(xì)胞轉(zhuǎn)變，或中等細(xì)胞不能運(yùn)輸免疫標(biāo)記物［3］。

但是，20世紀(jì)90年代以來(lái)，很多研究對(duì)脊髓損傷后跨神經(jīng)元變性的存在提出疑問(wèn)。McBride報(bào)道，完全橫斷成年雌性大鼠T9，熒光金逆行性標(biāo)記脊髓橫斷組和假手術(shù)組右坐骨神經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脊髓橫斷組和假手術(shù)組在術(shù)后10、20、52周標(biāo)記的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目或分布沒(méi)有區(qū)別。認(rèn)為脊髓損傷后沒(méi)有發(fā)生跨神經(jīng)元變性［15］。Bjugn等報(bào)道光學(xué)體視框技術(shù)（optical disector）觀察胸髓橫斷的小白鼠腰髓前角神經(jīng)元的變化。結(jié)果表明沒(méi)有腰段前角神經(jīng)元減少。不過(guò)，腰段前角的平均大小脊髓橫斷組（2.49 mm）較假手術(shù)組（3.05 mm）減?。≒＜0.05）。結(jié)論仍認(rèn)為脊髓損傷后沒(méi)有發(fā)生跨神經(jīng)元變性［3］。

跨神經(jīng)元變性常發(fā)生在原發(fā)損傷幾周后，故Bjugn［3］認(rèn)為Eidelberg報(bào)道的脊髓橫斷24 h內(nèi)見(jiàn)到的跨神經(jīng)元變性可能有其他的原因。

Van De Meent報(bào)道345例頸髓損傷患者的小指展肌、拇外展肌最大復(fù)合動(dòng)作電位明顯減小，半年后有不同程度恢復(fù)［1］，與本研究中膽堿能神經(jīng)元代謝功能的動(dòng)態(tài)變化曲線相似，提示脊髓損傷后其遠(yuǎn)端可能發(fā)生可逆的跨神經(jīng)元變性。

綜上所述，脊髓損傷后跨神經(jīng)元變性存在與否，之前的研究集中在神經(jīng)元數(shù)目是否減少上。不可忽略的是，跨神經(jīng)元變性可能主要是形態(tài)學(xué)的改變尤其是突觸形態(tài)學(xué)的改變，神經(jīng)元數(shù)目的減少可能并不明顯。之前不一致的研究結(jié)果，可能與研究的方法學(xué)不同有關(guān)，這其中包括計(jì)數(shù)方法和示蹤劑等不同。

脊髓損傷后遠(yuǎn)端下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元可逆性變化的研究為損傷后若干年脊髓功能重組、脊髓移植提供了理論上成功的可能。

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中國(guó)殘疾人康復(fù)協(xié)會(huì)康復(fù)技術(shù)專(zhuān)業(yè)委員會(huì)2015年國(guó)家級(jí)繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育項(xiàng)目安排

一、第48屆物理療法與作業(yè)療法技術(shù)培訓(xùn)班，項(xiàng)目編號(hào)2015-16-00-096（國(guó)）；2015年4月13～24日；北京，中國(guó)康復(fù)研究中心；學(xué)費(fèi)1600元，資料費(fèi)220元，住宿費(fèi)自理。

二、第9屆全國(guó)認(rèn)知障礙診斷與康復(fù)治療技術(shù)學(xué)習(xí)班，項(xiàng)目編號(hào)2015-16-00-095（國(guó)）；2015年8月10～14日；北京，中國(guó)康復(fù)研究中心；學(xué)費(fèi)1200元，資料費(fèi)150元，住宿費(fèi)自理。

三、第8屆全國(guó)康復(fù)評(píng)定技術(shù)研討班，項(xiàng)目編號(hào)2015-16-00-097（國(guó)）；2015年8月17～21日；北京，中國(guó)康復(fù)研究中心；學(xué)費(fèi)1200元，資料費(fèi)150元，住宿費(fèi)自理。

各班名額有限，歡迎積極報(bào)名和郵件、電話咨詢(xún)。

聯(lián)系人：李煒垣老師。聯(lián)系電話：（010）87569503，87569502或手機(jī)短信：13810520552；E-mail:xxbbm2011@163.com；地址：北京2619信箱，中國(guó)康復(fù)研究中心康復(fù)評(píng)定科，郵編：100068。

Functional and Structural Changes of Lower Motor Neuron Distal to the Site of Rats with Spinal Cord Transection at T10

XIONG Guo-xing，HONG Yi，ZHANG Jun-wei，CHEN Shi-zheng，GUAN Hua.Department of Rehabilitation，School of Public Health，Capital Medical University，Beijing 100069，China

Objective To investigate the structural and functional changes of lower motor neuron distal to the site of spinal cord injury in rats.Methods Seventies Sprague-Dawley rats were divided randomly into 6 groups:sham-operation group（controls，n=10）and 3 day group（n=10），1 week group（n=10），2 week group（n=10），4 week group（n=15）and 8 week group（n=15）after spinal cord transaction at T10. Neuronal apoptosis and acetylcholinesterase（AChE）activity of spinal cord at L4-6were observed by using the terminal deoxynucleotidal transferase-mediated DUTP-biotin nick end labeling（TUNEL）method and the semiquantitative enzyme cytochemistry，respectively.Results The assessment of apoptosis by TUNEL labeling showed that fluorescent markers were observed occasionally in anterior horn distal to the site of injury.The optical density（OD）value of AchE positive motor neurons（area＞300 μm2）initially decreased about 3 days after transaction and then overshot 1 week or so.However，after that，the OD value decreased again，the lowest about 4 weeks.Then the OD value increased again，though at 8 weeks was still lower than that of controls（P＜0.05）.Conclusion The findings on indistinctive apoptosis provided the proof of no significant changes of lower motor neuron distal to the site of transection.Semiquantitative histochemical results about AChE reflected marked metabolic changes of motoneurons caudal to the transaction，which represented as part of functional reorganization.

spinal cord injury；transneuronal degeneration；functional reorganization

R651.2

A

1006-9771（2015）02-0142-06

1.首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院康復(fù)醫(yī)學(xué)教研室，北京市100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，北京市100068；3.中國(guó)康復(fù)研究中心北京博愛(ài)醫(yī)院脊柱脊髓外科，北京市100068。作者簡(jiǎn)介：熊?chē)?guó)星（1973-），男，漢族，湖北云夢(mèng)縣人，康復(fù)醫(yī)學(xué)博士，副教授，主要研究方向：神經(jīng)康復(fù)、骨科康復(fù)。腔注射麻醉（300 mg/kg）。俯臥位四肢外展固定于手術(shù)臺(tái)，常規(guī)術(shù)區(qū)備皮、消毒，鋪無(wú)菌孔巾。

以T9-11為標(biāo)志確定T8椎板棘突，沿棘突做縱行切口約4 cm，切開(kāi)皮膚及淺筋膜，并皮下游離。尖刀片緊貼棘突骨面兩側(cè)（以減少因切開(kāi)肌肉所致肌間出血）做椎旁肌縱行切開(kāi)，顯微撐開(kāi)器撐開(kāi)兩側(cè)椎旁肌，暴露術(shù)野，咬除T7-9棘突，顯露椎板，蚊式止血鉗橫向輕輕鉗夾摩擦椎板直至顯露硬膜囊外間隙。由尾側(cè)向頭側(cè)咬除椎板直至兩側(cè)椎弓根，完整暴露脊髓。參考Basso方法，眼科手術(shù)刀于T10節(jié)段處連同硬脊膜和脊髓一同快速切斷，可見(jiàn)大鼠后肢痙攣性抽搐數(shù)次后軟癱，切除2 mm寬脊髓組織，并以彎頭顯微鑷輕抬起脊髓兩斷端，直視下兩人證實(shí)脊髓完全橫斷。創(chuàng)口敷灑慶大霉素。逐層縫合肌肉、筋膜、皮膚，術(shù)畢。

假手術(shù)組僅剝離椎板，不傷及脊髓，其他處理均同脊髓橫斷組。

1.2.2 術(shù)后一般護(hù)理

飼養(yǎng)環(huán)境的溫度控制在20～25℃，定期通風(fēng)；勤換飼養(yǎng)籠墊料，保持干燥，因尿失禁而被浸濕的肢體及時(shí)用溫水清洗擦干。術(shù)后常規(guī)每日慶大霉素（2～4）× 104U/kg皮下或肌注，直到血尿、膿尿停止，尿液澄清，此期大約1周左右。

如停藥后再次出現(xiàn)泌尿系感染征象，則立即恢復(fù)抗生素治療，直至癥狀消失。每天按摩、擠壓膀胱協(xié)助排尿2～3次，促進(jìn)大鼠反射性膀胱形成，恢復(fù)排尿反射，恢復(fù)排尿反射時(shí)間約2～4周。

同時(shí)每日兩次輕揉大鼠腹部及雙后肢，預(yù)防腸梗阻和壓瘡的發(fā)生。吹風(fēng)機(jī)干燥皮毛以減少壓瘡的發(fā)生。

術(shù)后大鼠分籠飼養(yǎng)以減少相互撕咬及自噬。

1.2.3 取材、切片制備

脊髓橫斷組大鼠分別于術(shù)后3 d、1周、2周、4周和8周水合氯醛腹腔注射麻醉（300 mg/kg），自左心室插管后剪開(kāi)右心耳，快速灌注生理鹽水沖洗，待流出的液體清亮后，用4%多聚甲醛經(jīng)心內(nèi)灌注，取出脊髓損傷節(jié)段及尾側(cè)5 mm外節(jié)段（L4-6），在4%多聚甲醛中固定12 h，入30%蔗糖磷酸鹽緩沖液至組織塊下沉為止。損傷位點(diǎn)節(jié)段制作30 μm厚冰凍連續(xù)縱切片以備確認(rèn)完全橫斷模型成功，損傷尾側(cè)節(jié)段分別制作10 μm、30 μm冰凍連續(xù)橫斷切片，行酶組化、免疫組織化學(xué)染色。

假手術(shù)組于術(shù)后7 d取材，其操作與脊髓橫斷組一致。

1.2.4 TUNEL法對(duì)L4-6脊髓凋亡細(xì)胞行熒光標(biāo)記

取脊髓橫斷組、假手術(shù)組距斷端尾側(cè)5 mm處以及1周組橫斷尾側(cè)鄰近損傷處10 μm厚冰凍橫斷切片，按TUNEL標(biāo)記法對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。

冰凍切片浸洗后浸入封閉液（3%H2O2）中，室溫15～25℃封閉10 min；漂洗后浸入通透液（0.1%TritonX-100溶于0.1%檸檬酸鈉）中，冰上（2～8℃）促滲2 min；漂洗后每個(gè)樣本滴加50 μl TdT酶反應(yīng)液（Equilibration Buffer 45 μl+FITC-12-dUTP 1 μl+TdT Enzyme 4 μl，陰性對(duì)照片不加TdT酶），加蓋玻片37℃避光濕潤(rùn)反應(yīng)60 min；漂洗后LEICA DC100熒光顯微鏡下（激發(fā)波長(zhǎng)450～500 nm，發(fā)射波長(zhǎng)515～565 nm（綠））觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 L4-6脊髓AChE酶組化染色定量檢測(cè)

脊髓橫斷組和假手術(shù)組每組取6只大鼠，距斷端尾側(cè)5 mm處脊髓組織的30 μm厚冰凍橫斷切片，入碘化硫代乙酰膽堿配制的孵育液室溫24 h，按Mesulam氏法漂洗后鐵氰化鉀染色顯示乙酰膽堿酯酶（AchE）。觀察各組酶染色差異。

每只大鼠隨機(jī)選取3個(gè)脊髓標(biāo)本，6個(gè)前角，每組各36個(gè)前角映像，應(yīng)用LEICA Q500IW型自動(dòng)彩色圖像分析儀進(jìn)行運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元胞體光密度（optical density，OD）值定量分析。以O(shè)D值表示酶活性。OD值越大其酶活性越高。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2014-04-16

2014-05-21）

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.02.005