一株豬偽狂犬流行株的分離與鑒定

談國(guó)倉(cāng)

(青海省湟源縣畜牧獸醫(yī)站,青海湟源 812100)

一株豬偽狂犬流行株的分離與鑒定

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豬偽狂犬是由豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）感染豬引起的急性傳染病，該病毒屬于皰疹病毒科（Herpesviridae）α-皰疹病毒亞科，與人源單純皰疹病毒（HSV-1、HSV-2）、水痘帶狀皰疹病毒（VZV）及I型馬牛皰疹病毒（BHV-1、EHV-1）等同屬[1]。豬偽狂犬在世界上分布廣泛，臨床癥狀與狂犬病相似，曾被誤認(rèn)為是狂犬病[2]。目前，偽狂犬病疫情仍在蔓延擴(kuò)大，全世界因偽狂犬病造成的經(jīng)濟(jì)損失每年可達(dá)數(shù)十億美元，僅低于口蹄疫和豬瘟等一類疫病。豬偽狂犬病在我國(guó)多個(gè)省份廣泛流行，嚴(yán)重影響了豬場(chǎng)的生產(chǎn)水平。近年來(lái)，偽狂犬病病源不斷發(fā)展變化，在流行時(shí)出現(xiàn)了毒力增強(qiáng)現(xiàn)象，給該病的凈化和預(yù)防帶來(lái)了新的壓力。

豬是偽狂犬主要的自然宿主和傳染源。除高級(jí)靈長(zhǎng)類外PRV能有效地感染哺乳動(dòng)物和部分禽類，宿主范圍廣闊。豬感染后，種豬繁殖障礙，母豬出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等為主要臨床癥狀，公豬則表現(xiàn)為不育，仔豬多以高熱、呼吸困難、食欲廢絕、腹瀉、震顫、運(yùn)動(dòng)失調(diào)，一般情況下幼齡仔豬發(fā)病率和死亡率高達(dá)100%，嚴(yán)重者昏迷直至死亡，育肥豬常引發(fā)生長(zhǎng)發(fā)育障礙，飼料利用率低[3]。家畜或野生動(dòng)物感染PRV后，主要表現(xiàn)以發(fā)熱、奇癢（豬除外）、腦脊髓炎等癥狀的急性傳染病，且豬體內(nèi)存在潛伏感染。PRV是一種致病性強(qiáng)、可感染多種動(dòng)物的病毒。在自然條件下，豬偽狂犬病常發(fā)生于豬、牛、羊、犬、鼠類等，其中豬最為普遍。家兔、豚鼠、小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物都易感該病，其中以家兔最為敏感。本病主要經(jīng)呼吸道、消化道感染，經(jīng)皮膚黏膜、傷口等也可感染發(fā)病，也可經(jīng)交配、精液、胎盤垂直傳播，帶毒豬配種時(shí)可相互感染，感染懷孕母豬可傳染胎兒，幼豬可經(jīng)母豬乳汁感染?？諝馐荘RV傳播的最主要途徑，同時(shí)污染的飼料、吸血昆蟲、帶毒鼠、羊等也可傳播本病。PRV在感染的急性后期存在一個(gè)潛伏感染期，主要潛伏在三叉神經(jīng)節(jié)、嗅球和扁桃體內(nèi)。期間PRV持續(xù)存在于感染部位但不產(chǎn)生具有感染力的病毒。潛伏感染的豬是病毒活化、散毒和在易感豬群中傳播的傳染源。當(dāng)外界因素等造成豬機(jī)體免疫力下降時(shí)，潛伏的病毒轉(zhuǎn)化為感染性的病毒。PR潛伏期一般為3～6 d，多則可達(dá)10 d。潛伏感染的豬一直是使病毒活化、散毒和在易感豬群中傳播的傳染源。受外界不良因素等應(yīng)激造成豬免疫力減弱時(shí)，潛伏狀態(tài)的病毒可轉(zhuǎn)化為具有感染性的病毒[4]。對(duì)偽狂犬病毒流行株的分離鑒定及其生物學(xué)特性分析，有利于深入了解偽狂犬流行病學(xué)，為控制該病的傳播及新型疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

疑似偽狂犬病病料采自當(dāng)?shù)啬嘲l(fā)病豬場(chǎng)病死豬腦組織，6周齡BALB/c小鼠等。

1.1.2 試劑

DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（Invitrogen）、胎牛血清（購(gòu)于杭州四季青生物工程公司），pMD18-T載體、病毒基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、DNA Marker I（均購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司），偽狂犬陽(yáng)性、陰性標(biāo)準(zhǔn)血清、PK-15細(xì)胞及偽狂犬標(biāo)準(zhǔn)株均由中國(guó)農(nóng)科院提供，PBS，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。

1.2 方法

1.2.1 病料處理

無(wú)菌條件下將采取的病料剪碎后，加入5倍體積的無(wú)菌PBS，用無(wú)菌研磨棒研磨處理后，置于低溫條件下反復(fù)凍融3次，6 000 rpm離心30 min，取上清，加入青鏈霉素，無(wú)菌條件下經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病毒的培養(yǎng)

將0.5ml病毒濾液接種于單層PK-15細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，同時(shí)設(shè)定陰性對(duì)照即將等量的PBS接種于另一單層PK-15細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，37℃孵育1 h后棄去液體，加入含2%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液約10ml，置于5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中連續(xù)傳代培養(yǎng)，并觀察記錄細(xì)胞病變情況，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變穩(wěn)定時(shí)，終止培養(yǎng)并收集病毒液，并于-80℃ 超低溫冰箱中保存。

1.2.3 TCID50測(cè)定

將上述收集的病毒液用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液作10倍系列梯度稀釋，稀釋后病毒濃度依次為10-1-10-8，取各梯度病毒稀釋液100μl分別接種到長(zhǎng)成單層PK-15細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板上，同時(shí)將培養(yǎng)板最后兩列孔接種DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液設(shè)為陰性對(duì)照，將加好樣的96孔培養(yǎng)板置于37℃體積比為5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察細(xì)胞病變情況，然后按照Reed-Muench法計(jì)算分離病毒的TCID50

1.2.4 分離病毒的PCR檢測(cè)

[6]參照GenBank中偽狂犬高度保守基因序列設(shè)計(jì)引物，上游引物序列：5’-CACGGAGGAGGAGCTGGGGCT-3’；下游引物序列：5’-GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT-3’，擴(kuò)增約217 bp的DNA片段，由上海生工生物工程有限公司合成。

首先利用病毒基因組提取試劑盒提取收集的病毒液和標(biāo)準(zhǔn)株DNA，然后以此DNA 為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為Premix Ex Taq酶12.5μl，上、下游引物各0.5μl，模板DNA 1 μl，補(bǔ)充無(wú)菌雙蒸水至總體積25μl；反應(yīng)條件為：95℃ 5min，95℃ 30s，63℃30s，72℃ 30s，30個(gè)循環(huán)；72℃延長(zhǎng)10min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀記錄結(jié)果。將鑒定正確的片段連入pMD18-T載體，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞擴(kuò)增，提取質(zhì)粒后，送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.5 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

將偽狂犬標(biāo)準(zhǔn)株和收集病毒液分別稀釋成含101-106TCID50的稀釋液，每個(gè)稀釋度腹股溝皮下按100μl/只分別接種5只6周齡BALB/c小鼠，并觀察記錄試驗(yàn)動(dòng)物臨床發(fā)病癥狀及死亡情況，同時(shí)設(shè)注射DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液的5只小鼠作為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞病變觀察結(jié)果

收集的病毒液接種PK-15細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)后，出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞病變，48h內(nèi)細(xì)胞空洞、變圓、變小，并伴隨拉絲病變，約72h可見明顯的細(xì)胞脫落現(xiàn)象。

2.2 TCID50測(cè)定結(jié)果

根據(jù)分離病毒株不同稀釋度接種96孔細(xì)胞板PK-15細(xì)胞后出現(xiàn)的病變情況，利用Reed-Muench法進(jìn)行毒價(jià)TCID50測(cè)定，結(jié)果TCID50=l0-5.19/0.1ml（詳見表1）。

2.3 PCR鑒定結(jié)果

以病毒液DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠成像儀下可見清晰目的條帶（見圖1），連接產(chǎn)物經(jīng)純化后測(cè)序鑒定為預(yù)期基因。

2.4 動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果

小鼠接種稀釋后的分離株病毒液和標(biāo)準(zhǔn)株病毒液后約24h，出現(xiàn)了精神沉郁、打盹、食欲降低、不愛活動(dòng)等臨床表現(xiàn)，48h后有的小鼠出現(xiàn)了后肢麻痹、被毛逆立、怕冷、注射部位奇癢、啃咬奇癢皮膚等典型偽狂犬癥狀，72 h后逐漸有小鼠死亡。但是該分離病毒株的半數(shù)致死量（LD50）顯著低于偽狂犬標(biāo)準(zhǔn)株。

3 討論

談國(guó)倉(cāng)（1983-），男，青海西寧人，本科，研究方向:獸醫(yī)臨床。