牛病毒性腹瀉病毒的綜合診斷和防控

達(dá)熱瑪

(青海省海北州祁連縣八寶鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站,青海祁連 810499)

牛病毒性腹瀉病毒的綜合診斷和防控

達(dá)熱瑪

(青海省海北州祁連縣八寶鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站,青海祁連 810499)

牛病毒性腹瀉病毒是危害養(yǎng)牛業(yè)的重要病毒性傳染病，該病毒主要感染犢牛，成年牛也可以感染發(fā)病，牛病毒性腹瀉病毒具有潛伏感染和免疫耐受的特征，從而對(duì)本病的綜合診斷提出了更高要求。本文主要綜述了牛病毒性腹瀉的臨床癥狀、病理變化、實(shí)驗(yàn)室診斷方法及防控措施，為基層養(yǎng)殖場(chǎng)的飼養(yǎng)管理與疫病防治提供參考。

牛病毒性腹瀉病毒 綜合診斷 防控

牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）屬于黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬（Pestivirus），該病毒呈世界性分布，世界上許多養(yǎng)牛的國(guó)家和地區(qū)都有本病發(fā)生的報(bào)道[1]。BVDV的宿主范圍廣泛，豬、牛、羊、駱駝都可以感染本病毒，感染動(dòng)物和帶毒動(dòng)物是本病的傳染源，病毒主要通過(guò)呼吸道和消化道感染傳播，有些病牛呈潛伏感染狀態(tài)，該病毒可以通過(guò)胎盤(pán)垂直傳播[2]。持續(xù)性感染和免疫耐受是本病的重要特征，這一特征給本病的診斷、檢疫及防控均造成很大困難。該病的診斷方法很多，常用的檢測(cè)方法有常規(guī)的病毒分離培養(yǎng)、中和試驗(yàn)等方法，常規(guī)檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)，特異性和敏感性不好，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，新型的檢測(cè)方法逐漸應(yīng)用到牛病毒性腹瀉病毒的檢測(cè)中，現(xiàn)將該病毒的綜合診斷和防控措施介紹如下：

1 臨床癥狀

牛病毒性腹瀉的發(fā)病率在5 %左右，死亡率在90 %以上，發(fā)病牛在3月齡到18月齡居多，發(fā)病牛主要表現(xiàn)為體溫升高至40℃～42 ℃，精神沉郁，少食，鼻眼有黏性分泌物，典型的臨床癥狀為水樣腹瀉，嚴(yán)重的可帶有血便。有的病牛出現(xiàn)腐蹄和跛行。本病常?？梢砸鹈庖咭种?，呈急性感染狀態(tài)，病毒感染導(dǎo)致淋巴組織破壞，免疫功能損傷，因而增強(qiáng)了其他病原體的致病性。與細(xì)菌性腹瀉鑒別主要通過(guò)大便常規(guī)檢查，細(xì)菌性腹瀉有白細(xì)胞和膿細(xì)胞，同時(shí)可以進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)進(jìn)行鑒別。

2 病理變化

剖檢可見(jiàn)病牛消瘦，消化道黏膜充血、出血，腸系膜淋巴結(jié)水腫增大，盲腸和結(jié)腸黏膜充血、出血。急性BVDV 感染可見(jiàn)胃腸道、體表和呼吸道的表皮損傷。

3 綜合診斷方法

牛病毒性腹瀉疾病的診斷可以通過(guò)臨床癥狀與病理變化做出初步診斷，但最后確診還要借助分子生物學(xué)等實(shí)驗(yàn)室診斷方法。

3.1 RT-PCR檢測(cè)方法

季新成[3]等針對(duì)不同基因型BVDV基因組高度保守的5’端非編碼區(qū)核苷酸序列，設(shè)計(jì)特異性引物（擴(kuò)增長(zhǎng)度為288 bp），同時(shí)為了指示假陰性結(jié)果，以牛GAPDH基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)基因，設(shè)計(jì)特異性引物（擴(kuò)增序列長(zhǎng)度為152 bp）。通過(guò)RT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了BVDV通用型內(nèi)標(biāo)雙重RT-PCR檢測(cè)方法，該方法可以監(jiān)測(cè)RNA 提取與RT-PCR反應(yīng)過(guò)程，指示假陰性結(jié)果的發(fā)生。該方法的檢測(cè)靈敏度約為102TCID50/ml，且具有較好的特異性和可重復(fù)性。通過(guò)對(duì)566份臨床樣品檢驗(yàn)，檢測(cè)到陽(yáng)性樣品19份，陽(yáng)性率為3.36 %。該方法可用于臨床樣品中BVDV檢測(cè)，并可對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制。

3.2 熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法

韓猛立[4]等根據(jù)BVDV 5’端非編碼區(qū)核苷酸序列，軟件分析后設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，建立了一種快速定量檢測(cè)BVDV的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法。該方法檢測(cè)豬瘟病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛輪狀病毒及牛冠狀病毒沒(méi)有交叉反應(yīng)，具有高度的特異性；在102～108拷貝/μl模板范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，所制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0. 998，最低可檢測(cè)下限可達(dá)到102拷貝/ μl，具有靈敏度高的特點(diǎn)；不同情況下進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)，變異系數(shù)均小于1.5 %，具有重復(fù)性好的特點(diǎn)。該檢測(cè)方法可用于臨床樣品的檢測(cè)，適用于BVDV 的臨床快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

3.3 抗原捕獲ELISA檢測(cè)方法

范晴[5]等用兔抗BVDV多抗作為包被抗體，BVDV NS3單克隆抗體作為捕獲抗體，建立了檢測(cè)BVDV抗原的捕獲ELISA方法，該方法對(duì)牛輪狀病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛分枝桿菌無(wú)特異性交叉反應(yīng)，其最低可檢測(cè)7.9×103個(gè)TCID50的病毒含量，與常規(guī)RT-PCR方法相比較，符合率為100 %。BVDV抗原捕獲ELISA方法快速、特異、敏感，可用于BVDV抗原的快速檢測(cè)。

3.4 RT-LAMP檢測(cè)方法

范晴[6]等根據(jù)BVDV的5’端非編碼區(qū)序列，分別在保守區(qū)的8個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)LAMP特異性引物（2對(duì)特異性引物和1對(duì)環(huán)引物），對(duì)反應(yīng)條件和試劑濃度進(jìn)行優(yōu)化，建立了BVDV的RT-LAMP快速檢測(cè)方法。該方法特異性好，檢測(cè)其他對(duì)照病毒均為陰性；靈敏度高，最低可檢測(cè)到1個(gè)拷貝的陽(yáng)性質(zhì)粒，可通過(guò)觀察渾濁度或加入染料后直接判定擴(kuò)增結(jié)果。該方法簡(jiǎn)便、快速、特異性好、靈敏度高，適合基層和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

4 防控措施

BVDV預(yù)防的關(guān)鍵在于加強(qiáng)牛的日常飼養(yǎng)管理。新生犢牛的飼養(yǎng)首先要保證出生后半小時(shí)內(nèi)吃到初乳，這對(duì)新生犢牛極其重要，定時(shí)定量喂養(yǎng)，保持舍內(nèi)溫度，衛(wèi)生，防止消化道疾病發(fā)生，加強(qiáng)新生牛的飼養(yǎng)管理。懷孕母牛的飼料配比要適當(dāng)，保證蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和維生素含量，保持良好的營(yíng)養(yǎng)水平，保證產(chǎn)后乳汁分泌良好，牛舍環(huán)境要清潔、干燥，衛(wèi)生，定期消毒。母牛產(chǎn)犢過(guò)程中的分泌物，排泄物要及時(shí)清除，徹底打掃衛(wèi)生和消毒。該病目前無(wú)特效藥，一旦感染發(fā)病只能對(duì)癥輔助治療，同時(shí)給予抗病毒的藥物輔助治療，增強(qiáng)病牛的抵抗力。目前，國(guó)際上用于BVD的防控措施主要是鑒別和撲殺持續(xù)性感染動(dòng)物，其次是疫苗免疫[7]。國(guó)內(nèi)本病的防控建議根據(jù)不同牛場(chǎng)的規(guī)模、養(yǎng)殖密度、血清抗體陽(yáng)性率情況制定不同的防疫對(duì)策。在牛養(yǎng)殖密度低、BVDV抗體陽(yáng)性率低的地方，禁用弱毒疫苗，定期監(jiān)測(cè)牛血清抗體，逐步淘汰隱性感染牛。在牛養(yǎng)殖密度高、BVDV抗體陽(yáng)性率高的地方，可以通過(guò)疫苗免疫控制疫病暴發(fā)流行，對(duì)發(fā)病牛要及時(shí)隔離治療，逐步淘汰達(dá)到牛場(chǎng)逐步凈化的目標(biāo)。

[1] 王龍，梁霄勇，季新成，等. 新疆部分地區(qū)牛病毒性腹瀉病毒的分離、鑒定及分子流行病學(xué)調(diào)查[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，52（2）：334-338.

[2] 姚偉.遼寧地區(qū)規(guī)?；膛?chǎng)牛病毒性腹瀉-黏膜病血清學(xué)調(diào)查[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2015，（4）：36-40.

[3] 季新成，段琛，王克棟，等. 牛病毒性腹瀉病毒內(nèi)標(biāo)雙重RTPCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，35（1）：17-21.

[4] 韓猛立，黃新，鐘發(fā)剛，等. 牛病毒性腹瀉病毒SYBR Green I實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，51（2）：333-339.

[5] 范晴，謝芝勛，謝志勤，等. 牛病毒性腹瀉病毒抗原捕獲ELISA方法的建立[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015，36（2）：21-24.

[6] 范晴，謝芝勛，劉加波，等. 牛病毒性腹瀉病毒RT-LAMP檢測(cè)方法的建立[J].生物技術(shù)通訊，2010，（2）：248-251.

[7] 王煒，武華. 牛病毒性腹瀉病毒生物學(xué)特性、危害及防控[J]. 中國(guó)奶牛，2014，（23-24）：22-26.

達(dá)熱瑪（1982-），女，青海祁連人，本科，助理獸醫(yī)師，研究方向:動(dòng)物疾病診療。