附子炮制品水煎液對(duì)比格犬心臟急性毒性研究

張 雪 宋玉琴 楊雨婷 賀 抒 謝曉芳彭 成

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院／中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137

附子炮制品水煎液對(duì)比格犬心臟急性毒性研究

張 雪 宋玉琴 楊雨婷 賀 抒 謝曉芳*彭 成

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院／中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137

目的：比較附子不同炮制品 （刨附片、炮天雄、黑順片）對(duì)比格犬的心臟急性毒性的影響。方法：比格犬16只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、刨附片組、炮天雄組、黑順片組，按照4g生藥／kg灌胃比格犬濃縮液，檢測(cè)灌胃前和灌胃后1h，1d、3d、7d和14d后比格犬體重、體溫變化和心電圖心率變化，并測(cè)定血液中乳酸脫氫酶 （LDH）和肌酸激酶同工酶 （CK－MB）的含量。結(jié)果：給藥后1h內(nèi)黑順片組犬出現(xiàn)嘔吐，其余組未觀察到癥狀；給藥后14d內(nèi)比格犬體重、體溫正常，給藥組乳酸脫氫酶和肌酸激酶同工酶含量，心電圖心率與空白組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。結(jié)論：刨附片，炮天雄，黑順片水煎液按照4g生藥／kg給犬灌胃，沒(méi)有明顯心臟毒性。

刨附片；炮天雄；黑順片；比格犬；急性毒性

附子為毛茛科（Ranunculaceae）植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.的子根的加工品［1］。附子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味辛、甘，性大熱，有毒，被譽(yù)為 “亂世之良將，回陽(yáng)救逆之第一品，補(bǔ)命門(mén)真火第一要藥”。但因其性剛烈迅捷，歷代醫(yī)家及本草著作皆言附子 “有毒”，用之不當(dāng)，易出現(xiàn)嚴(yán)重的毒副作用［2］。研究表明附子主要活性成分為二萜類(lèi)生物堿，包括雙酯型、單酯型和脂性生物堿。其中雙酯型生物堿毒性最大［3－4］，其毒性主要作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、和肌肉組織［5］。因此如何合理使用附子成為研究熱點(diǎn)。《本草問(wèn)答》記載，“四川彰明縣采制附子，必用鹽腌，其腌附子之鹽，食之毒人至死，并無(wú)藥可解，可知附子之毒甚矣。然將腌附子之鹽，放于竹筒中用火煅過(guò)，則無(wú)毒，入補(bǔ)腎藥，又溫而不烈，反為良藥”。表明附子經(jīng)加工炮制后，可降低毒性，便于內(nèi)服，為回陽(yáng)救逆第一品，廣受醫(yī)生和患者青睞。目前，附子作為一種中藥商品，其最大的特點(diǎn)在于規(guī)格較多，不同的商品體現(xiàn)了精湛復(fù)雜的產(chǎn)地加工和炮制技術(shù)，一些炮制品甚至被制備藥膳或外形美觀的保健食品，如炮天雄、刨附片等。為了確保附子炮制品的安全使用，本實(shí)驗(yàn)就附子的炮制品刨附片、炮天雄及黑順片 （大中張）的水煎液對(duì)比格犬的心臟急性毒性進(jìn)行研究。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物 比格犬，雌雄各半，7.5～10.0kg，7～8月齡，由四川養(yǎng)麝研究所比格犬繁育中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SCXK（川）2009－01。檢疫后備用。

1.2 藥物 刨附片、炮天雄、黑順片（大中張）飲片，均由四川省好醫(yī)生藥業(yè)有限公司提供，均按以下方法制備水煎液：第一次以10倍量水煎5個(gè)h，過(guò)濾后再以8倍量水煎3h，混合兩次水煎液，濃縮。試驗(yàn)前各藥物均濃縮成4.0g生藥／m l。

1.3 試劑 乳酸脫氫酶（LDH，批號(hào)：130706）、肌酸激酶同工酶（CK－MB，批號(hào)：228320）試劑盒均由上海華臣生物試劑有限公司提供。

1.4 儀器 7180型全自動(dòng)生化分析儀（日本日立）；ACCESS型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀（德國(guó)貝克曼公司）；PC－80B型快速心電檢測(cè)儀 （深圳科瑞康實(shí)業(yè)有限有公司）；電子體溫計(jì)。

2 方法

2.1 分組與給藥 經(jīng)預(yù)試無(wú)法測(cè)定各試驗(yàn)藥物灌胃比格犬的LD50，故進(jìn)行最大給藥量測(cè)定。取健康、合格比格犬16只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。隨機(jī)分為4組，即空白組、刨附片組、炮天雄組、黑順片組，每組4只犬，雌雄各半。給藥前禁食不禁水12h，測(cè)定體重、肛溫、心電圖 （肢體II導(dǎo)聯(lián)）。然后灌胃給藥，其中空白組給予蒸餾水，其余各給藥組給予相應(yīng)藥液4g生藥／kg，給藥體積均為20ml／kg。然后密切觀察犬的活動(dòng)、對(duì)外界反應(yīng)、分泌物等一般狀態(tài)，隨后常規(guī)飼養(yǎng)14d，每日觀察1次。并于給藥后1h及1、3、7、14d時(shí)測(cè)定體重、肛溫和心電圖變化，同時(shí)取血測(cè)定血清中LDH、CK－MB含量。

2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包建立數(shù)據(jù)庫(kù)后，采用配對(duì)t檢驗(yàn)對(duì)同組動(dòng)物給藥前后進(jìn)行比較，采用單因素方差分析比較組間的變化。P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)比格犬一般狀態(tài)的影響 觀察給藥后犬的活動(dòng)，發(fā)現(xiàn)3個(gè)給藥組犬在給藥后短時(shí)間內(nèi)表現(xiàn)為精神不振或煩躁，尤其以黑順片組犬表現(xiàn)明顯，且黑順片組3只犬均出現(xiàn)不同程度嘔吐，在給藥后10～20min出現(xiàn)，為白色泡沫；隨后未見(jiàn)明顯異常反應(yīng)，進(jìn)食正常；其余組未觀察到嘔吐癥狀，進(jìn)食正常。

3.2 對(duì)比格犬體重和肛溫的影響 附子不同炮制品灌胃后比格犬后經(jīng)過(guò)14d的觀察，發(fā)現(xiàn)附子不同炮制品組和空白組的犬體重基本保持同步增長(zhǎng)的變化，與空白組相比，未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。給藥后藥物對(duì)比格犬肛溫基本無(wú)影響，結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

表1 刨附片、炮天雄和黑順片水煎液對(duì)比格犬體重的影響 （kg，±s）

組別 n 給藥前給藥后70±0.49 8.90±0.34刨附片 4 8.08±1.04 8.16±1.08 8.36±1.24 8.37±1.14 8.11±0.98 8.38±1.12炮天雄 4 8.05±0.74 8.21±0.76 8.28±0.72 8.25±0.80 7.99±0.48 8.37±0.58黑順片 4 8.87±0.46 8.95±0.50 8.95±0.54 8.97±0.66 8. 1h 1d 3d 7d 14d空白 4 8.65±0.40 8.75±0.39 8.79±0.44 8.89±0.52 8. 84±0.25 8.87±0.42

表2 刨附片、炮天雄和黑順片水煎液對(duì)比格犬肛溫的影響 ±s，℃）

組別 n 給藥前給藥后49 38.45±0.66 38.20±0.50刨附片 4 38.53±0.46 38.98±0.26 39.00±0.33 38.60±0.59 38.08±0.22 38.28±0.15炮天雄 4 38.48±0.30 38.80±0.34 38.90±0.24 38.63±0.28 38.40±0.29 37.97±0.64黑順片 4 38.58±0.21 38.78±0.29 38.73±0.36 38.48±0. 1h 1d 3d 7d 14d空白 4 38.35±0.34 38.78±0.46 38.70±0.35 38.40±0. 36 38.30±0.35 38.15±0.30

3.3 對(duì)比格犬心電圖的影響 刨附片、炮天雄、黑順片水煎液對(duì)比格犬的心電圖心率影響不大，其中刨附片組在給藥1小時(shí)后心率顯著加快（P＜0.05），其余組變化不顯著（P＞0.05）；給藥后14d刨附片組與空白組相比Q－T波明顯延長(zhǎng)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；其余各組的犬Q－T波沒(méi)有明顯差異（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3、4、5。

表3 刨附片、炮天雄和黑順片水煎液對(duì)比格犬心率的影響 （次／分，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05。

組別 n 給藥前給藥后.00±14.07 104.00±23.99 92.50±17.56刨附片 4 120.00±19.24 127.75±8.34* 116.75±7.27 120.75±11.70 106.00±6.48 108.75±14.08炮天雄 4 108.75±20.27 114.25±6.95 113.50±25.41 103.50±22.05 106.25±19.36 111.25±29.30黑順片 4 103.00±5.35 90.25±20.66 101.00±11.16 97.0 1h 1d 3d 7d 14d空白 4 117.50±11.90 105.50±16.11 99.75±17.33 111 0±16.69 98.00±17.30 92.50±10.25

表4 刨附片、炮天雄和黑順片水煎液對(duì)比格犬心電圖QRS波的影響 （mv，±s）

組別 n 給藥前給藥后29±0.18 1.22±0.21刨附片 4 1.26±0.10 1.22±0.12 1.07±0.30 1.26±0.10 1.27±0.21 1.29±0.16炮天雄 4 1.00±0.38 1.12±0.42 1.11±0.26 1.10±0.46 1.13±0.43 1.10±0.48黑順片 4 1.12±0.38 1.10±0.33 1.15±0.40 1.05±0.32 1. 1h 1d 3d 7d 14d空白 4 1.09±0.16 1.11±0.11 1.03±0.20 1.10±0.24 1. 21±0.34 1.17±0.36

表5 刨附片、炮天雄和黑順片水煎液對(duì)比格犬心電圖Q－T波的影響 （s，±s）

注：與空白組相比，**P＜0.01。

組別 n 給藥前給藥后24±0.02 0.25±0.02刨附片 4 0.29±0.04 0.28±0.01 0.27±0.02 0.28±0.04 0.28±0.02 0.31±0.03**炮天雄 4 0.21±0.03 0.24±0.04 0.21±0.05 0.23±0.04 0.24±0.05 0.23±0.03黑順片 4 0.21±0.03 0.24±0.04 0.22±0.01 0.21±0.02 0. 1h 1d 3d 7d 14d空白 4 0.24±0.03 0.25±0.05 0.24±0.03 0.23±0.01 0. 21±0.03 0.23±0.02

3.4 對(duì)比格犬血清LDH、CK－MB的影響 比格犬被給藥后血清中的LDH含量有變化，但組間比較都沒(méi)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中黑順片的乳酸脫氫酶含量在給藥后1h，1d和14d均低于空白組，未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；而空白組和刨附片組和炮天雄組犬血清內(nèi)肌酸激酶同工酶穩(wěn)定，黑順片組比格犬的肌酸激酶同工酶在給藥后隨著時(shí)間的推移逐漸降低，與空白組相比，未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＞0.05），具體如表6、7。

表6 刨附片、炮天雄和黑順片水煎液對(duì)比格犬血清LDH含量的影響 （U／L，±s）

給藥后組別 n 00±69.56刨附片 4 119.25±62.10 226.50±201.47 147.25±87.74 177.00±87.01炮天雄 4 140.25±104.21 107.25±79.87 74.50±17.37 110.00±28.60黑順片 4 64.75±6.45 71.25±9.18 91.75±30.08 90.50±1 1h 1d 3d 14d空白 4 114.75±63.47 95.75±35.50 75.25±13.84 142. 0.63

表7 刨附片、炮天雄和黑順片水煎液對(duì)比格犬血清CK－MB含量的影響 （U／L，±s）

給藥后組別 n 3.30±1.95 2.63±0.97 2.93±0.73 3.00±1.79刨附片 4 2.88±1.57 2.33±1.10 2.45±1.21 3.00±0.67炮天雄 4 2.85±1.35 2.03±0.43 2.83±0.92 2.55±0.77黑順片1h 1d 3d 14d空白4 4 4.28±3.56 3.73±0.66 1.98±0.62 1.55±0.25

4 討論

附子為有毒中藥，其毒性主要是由雙酯型烏頭類(lèi)生物堿引起。研究表明2.5mg／m l以上濃度烏頭堿可影響體外大鼠胚胎生長(zhǎng)發(fā)育和器官形態(tài)分化，誘發(fā)以心臟和神經(jīng)系統(tǒng)為主的器官畸形，加入體外代謝活化系統(tǒng)S9可以減輕烏頭堿對(duì)大鼠胚胎的毒性作用［6］。經(jīng)炮制、水煎、合理配伍等，雙酯型烏頭類(lèi)生物堿含量下降，毒性也明顯降低。因此，臨床應(yīng)用通常選擇附子的炮制品，而附子的炮制品種類(lèi)也逐漸增多。附子在加工中，由于藥材使用的用途、方式的不同形成了不同的藥材商品規(guī)格，按照臨床使用情況分為可直接使用和半成品兩大類(lèi)。而直接使用的附子商品又按照使用目的的不同，其加工方式也不一樣。臨床處方使用多為黑順片、白附片等，制備藥膳或保健食品多為外形美觀的加工品，如炮附子 （炮天雄）、刨附片等［7］。研究發(fā)現(xiàn)，附子水煎醇沉液 （酯型生物堿烏頭堿的含量為0.0364%）給小鼠灌胃，LD50為31.24g／kg，換算成人臨床用量為240.31g／d。給藥后即可見(jiàn)部分動(dòng)物躁動(dòng)不安、呼吸增強(qiáng)、頭部顫動(dòng)繼而全身抽搐，繼而蜷臥，體表溫度下降，直至死亡。鏡檢可見(jiàn)中毒死亡小鼠肝臟、腎臟呈暗紅色，心肌有輕微瘀血，內(nèi)有少量積液，其余未見(jiàn)異常［8］。黑順片水煎液按15、30、45、60、75、90g／kg的劑量給小鼠灌胃，連續(xù)10d，60g／kg以上劑量組能使小鼠死亡率顯著增加，中毒反應(yīng)較多且較嚴(yán)重，對(duì)心電圖也有一定影響，對(duì)肝有一定損傷，還可顯著降低血尿素氮［9］。但研究集中在3種炮制品對(duì)小鼠的急毒情況，現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)主要探究其對(duì)犬的心臟急性毒性。

附子急性心臟毒性反應(yīng)表現(xiàn)特點(diǎn)為：先出現(xiàn)心率加快和心律不齊，皮膚、尾、足墊發(fā)紅，體熱，心前區(qū)搏動(dòng)明顯加快；逐漸轉(zhuǎn)為體涼，唇爪、尾部、耳、足墊蒼白，唇爪發(fā)紺；最后心前區(qū)搏動(dòng)減弱，心率減慢，死亡［10］。本實(shí)驗(yàn)為探討和比較附子不同炮制品 （刨附片、炮天雄、黑順片）對(duì)比格犬的急性心臟毒性，采用標(biāo)準(zhǔn)工藝煎煮刨附片、炮天雄、黑順片，其水煎液濃度濃縮為4.0g生藥／m l，按照4g生藥／kg劑量灌胃比格犬，擬人劑量為160g／次（人以60kg計(jì)），除黑順片組可觀察到嘔吐外，其余組未出現(xiàn)明顯反應(yīng)，在灌胃一次后14d內(nèi)比格犬的體溫體重均正常，各組犬心電圖心率均沒(méi)有明顯差異，對(duì)血液中乳酸脫氫酶和肌酸激酶同工酶也沒(méi)有顯著影響，說(shuō)明這3種附子的炮制品刨附片、炮天雄、黑順片安全性高，在劑量為4g／kg時(shí)，附子炮制品刨附片、炮天雄、黑順片對(duì)比格犬未見(jiàn)明顯心臟毒性，而刨附片和炮天雄相比黑順片在等劑量時(shí)安全性更高，這可能與炮制工藝相關(guān)。

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Studies on the Acute Toxicity of Aconitum Carmichaeli Debx Processed products Decoction in Heart of Beagle Dogs

Zhang Xue Song Yuqin Yang Yuting He Shu Xie Xiaofang*Peng Cheng
Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research Development and Utilization of Chinese Medicine Resources，Sichuan Province And Ministry of Science and Technology，Chengdu 611137，China

ObjectiveTo investigate and compare the different processed Aconitum carmichaeli（Paofupian，PaoTianxiong，Heishunpian）for acute cardiac toxicity in beagle dogs.Methodssixteen Beagle dogs，random ly divided into control group，Paofupian group，PaoTianxiong group，Heishunpian group，according to the 4 g crude drug／kg gavaging to Beagles，observe fourteen days，and detect theweight，temperature changing and ECG heart rate and blood lactatemeasurements dehydrogenase and creatine kinase MB before administration and atone hour、one day、three day、seven day、fourteen day after administration.Resultswithin one hour after administration，heishunpian group dogs bagan to vomite，the symptomswere notobserved in other groups；fourteen days after administration Beagle dogs’sweight，temperature are normal，comparing the administration groups to the control group，the lactate dehydrogenase and creatine kinase isoenzyme content，ECG heart rate have no significant difference.Conclusionthe different processed Aconitum carmichaeli（Paofupian，PaoTianxiong，Heishunpian）decoctions according 4g／kg orally to fill beagle dog’s stomach，have no significant cardiac toxicity.

Paofupian；PaoTianxiong；Heishunpian；beagle dog；acute toxicity

R285.1

A

1007－8517（2015）16－0021－03

2015.05.11）

國(guó)家“973”項(xiàng)目，基于西部道地藥材的創(chuàng)新藥物研究（2012CB723502）；國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目，西南區(qū)域附子、燈盞花等大宗中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高及其綜合利用（2011BAI13B05）。

張雪，女，碩士研究生，專(zhuān)業(yè)中藥藥理學(xué)，從事中藥藥理與毒理研究。

謝曉芳，女，博士，助理研究員，研究方向?yàn)橹兴幩幚砼c毒理研究。E－mail：xxfl4544＠163.com