分子分型方法在單核細胞增生性李斯特菌流行病學(xué)研究中的應(yīng)用

連 凱,葉舒揚,殷月蘭,焦新安

分子分型方法在單核細胞增生性李斯特菌流行病學(xué)研究中的應(yīng)用

連 凱,葉舒揚,殷月蘭,焦新安

單核細胞增生性李斯特菌(Lm)是一種重要的食源性人獸共患病病原菌，所引起的李斯特菌病雖然發(fā)病率低，但病死率高。傳統(tǒng)的Lm分型方法步驟繁瑣、重復(fù)性差、分辨率低。目前，多種針對Lm的分子分型方法逐漸完善，而且分辨力、分辨率、操作性和敏感性均優(yōu)于傳統(tǒng)分型方法。就目前Lm分子流行病學(xué)研究中常用的分子分型方法(PFGE分型、MLVA分型、MLST分型、MVLST分型、Lineage分型)闡述、比較，為Lm食源性疾病監(jiān)測、暴發(fā)的診斷及溯源提供參考。

單核細胞增生性李斯特菌；分子分型；流行病學(xué)；李斯特菌病

李斯特菌屬(Listeriaspp.)由7個種構(gòu)成,包括單核細胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes，簡稱Lm)、伊氏李斯特(L.ivanovii)、英諾克李斯特菌(L.innocua)、韋氏李斯特菌(L.welshimei)、塞氏李斯特菌(L.seeligeri)、格氏李斯特菌(L.grayi)、莫氏李斯特菌(L.murrayi)。其中Lm和伊氏李斯特菌均有致病性，伊氏李斯特菌主要引起動物李斯特菌病，而Lm除了感染動物外，還是引起人類李斯特菌病的主要病原菌。根據(jù)菌體(O)抗原和鞭毛(H)抗原的血清學(xué)反應(yīng), 將Lm分為13個血清型，分別為1/2a、1/2b、l/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e和7型，而95%以上的李斯特菌病是由1/2a、1/2b、l/2c和4b菌株感染所致。Lm引起的李斯特菌病具有低發(fā)病率、高致死率的特點，據(jù)統(tǒng)計，人李斯特發(fā)病率每百萬人在0.1～11.3例，死亡率為20%～30%[1]。新生兒、孕婦、老年人及免疫缺陷病人是李斯特菌感染的高危人群，易患腦膜炎、敗血病、流產(chǎn)和多器官功能障礙等侵襲性疾病[2]。近年來，因食品污染Lm而引起的食物中毒暴發(fā)事件日漸增多，已引起許多國家衛(wèi)生部門的廣泛關(guān)注。

1 Lm的流行病學(xué)

Lm在自然界中分布廣泛，存在于污泥、土壤、河水、青貯飼料中，可以在0-45 ℃、pH4.4～9.4、10%NaCl等環(huán)境中生長，對環(huán)境具有較強的抵抗力，也可寄生于昆蟲、魚、禽類及甲殼動物體內(nèi)，感染的宿主多達40多種，反芻動物是其易感宿主。自然條件下，Lm可使牛、羊等動物發(fā)病，引起腦膜腦炎、流產(chǎn)和急性敗血癥。動物李斯特菌病主要與動物食用污染的貯存飼料有關(guān)[3]，患病動物和帶菌動物是重要的傳染源，通過糞、尿、乳汁、以及眼、鼻和生殖道分泌物排出細菌，對農(nóng)場、屠宰場、污水、奶制品等造成污染[4]；并經(jīng)動物制品如生肉、熟肉、生奶、酸奶、冰激淋等的加工和銷售環(huán)節(jié)，傳染給人類，導(dǎo)致人的李斯特菌病[5-6]。

據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計：肉制品(30%以上)、禽產(chǎn)品(15%以上)、奶及奶制品(5%～10%)以及水產(chǎn)品(4%～8%)受到Lm不同程度的污染[7]。

中國食品中污染情況比較嚴重。在生肉、熟肉、生奶、酸奶、冰淇淋、生食水產(chǎn)品等樣品中都檢出了Lm[6]。國外常有由Lm引起的群發(fā)性食物中毒，其中不少為動物制品污染Lm所致。如2014年丹麥暴發(fā)了多起由香腸引起的中毒事件；2011年美國暴發(fā)了嚴重的食物中毒事件，最終發(fā)現(xiàn)香瓜是污染源[8]；1999-2000年間法國279人因食用凍豬舌而感染李斯特菌，其中85人死亡[9]；1995年瑞士西部暴發(fā)了一起軟質(zhì)奶酪引起的中毒事件[10]。李斯特菌病呈世界性分布，對人類健康造成極大的威脅，已引起世界各國的高度重視。

2 Lm分子分型技術(shù)

由Lm引起的食物中毒事件時有報道，而有效的分型方法對于控制疾病的暴發(fā)具有至關(guān)重要的作用。傳統(tǒng)的表型分型方法，如血清分型、噬菌體分型等，雖然操作簡單、方便，卻不能提供菌株間足夠的相關(guān)信息，對于生化特性、血清型相同的不同菌株分辨力低。而以DNA為基礎(chǔ)的分子分型技術(shù)，從遺傳學(xué)的角度對細菌的流行病學(xué)規(guī)律進行研究，具有快速、準確、操作性強和分辨率高等優(yōu)點，彌補了傳統(tǒng)分型方法的不足，因而在食源性疾病監(jiān)測、暴發(fā)的診斷及溯源等方面得到了廣泛應(yīng)用。

目前用于Lm的分子分型方法主要可以分為3類：(基于酶切技術(shù)的分型方法：擴增片斷長度多態(tài)性(Amplified fragment length polymorphism，AFLP)、限制性片段長度多態(tài)性(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)、核糖體分型(Ribotyping，RT)、脈沖場凝膠電泳(Pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)。(基于PCR的分型方法：多位點可變數(shù)串聯(lián)重復(fù)分析(Multiple-locus Variable-number Tandem-Repeats analysis，MLVA)、分子血清分型(Molecular Serotyping)、隨機引物擴增多態(tài)性DNA分析(Random amplification of polymorphic DNA analysis，RAPD)。(基于測序技術(shù)的分型方法：多位點序列分型(Multi-locus sequence analysis，MLST)、多重毒力基因位點序列分型(Multi-Virulence-Locus Sequence Typing，MVLST)。

2.1 脈沖場凝膠電泳(Pulsed-fieldgelelectrophoresis，PFGE) PFGE以細菌染色體的結(jié)構(gòu)特征為依據(jù)進行分型，不受表型的干擾，因其重復(fù)性好、分辨力強，被認為是分子分型的金標(biāo)準，可用于大分子DNA的分離，其分辨力是傳統(tǒng)瓊脂糖凝膠電泳的20倍，分辨范圍可達到10 Mb[11-12]。PFGE技術(shù)是利用限制性內(nèi)切酶對包裹在特殊瓊脂中細菌的進行消化，切割成大小不等的DNA片斷，然后利用脈沖場電泳將片段分離，經(jīng)染色脫色后，DNA片段在凝膠上按大小呈現(xiàn)特異的電泳圖譜，通過軟件可對菌株間圖譜的異同以及細菌的同源性進行分析，從而為追蹤溯源提供依據(jù)。陳偉偉[13]等用PFGE對福建省不同年份、不同地點的7株Lm分離株進行分型研究，結(jié)果顯示，7株分離株分為5個型，且其中兩個菌株型別一致，均來自同一廠家生產(chǎn)的凍雞肉。Fugett EB[14]等采用AscI和ApaI對不用來源的Lm進行PFGE分型分析，結(jié)果顯示從洛杉磯一起暴發(fā)病例中分離到的Lm菌株與瑞士分離到的Lm菌株屬于同一型。2011年，美國暴發(fā)了一次最為嚴重的由Lm引起的食物中毒事件，Lomonaco S[8]等利用PFGE對從病人、食物和環(huán)境中分離的Lm進行分型分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)從污染香瓜中分離到的Lm與病人Lm分離株具有高度相似的帶型，提示這些暴發(fā)病例可能與被Lm污染的香瓜有關(guān)。因此，采用PFGE不僅可以有效的對食品污染進行溯源，同時還可以比較不同疾病暴發(fā)菌株間的相關(guān)性。

雖然PFGE具有較強的分辨能力，但得到的結(jié)果是DNA條帶而不是DNA序列，帶型一樣的2個菌株可能存在分子量一樣但堿基序列不同的片段，因此不能提供有意義的進化分析；操作耗時、費力，并且缺乏標(biāo)準化操作規(guī)程，使得電泳帶型容易受到人為等多種因素的影響，同時不利于各實驗室間數(shù)據(jù)的交流和比較[15-16]。

2.2 多位點可變數(shù)串聯(lián)重復(fù)分析(Multiple-locus Variable-number Tandem-Repeats analysis，MLVA) MLVA是近年發(fā)展起來的以PCR為基礎(chǔ)的新技術(shù)，其基本原理是根據(jù)被檢測菌株基因組中不同位點可變串聯(lián)重復(fù)序列 ( variable number of tandem repeats，VNTR) 重復(fù)單元拷貝數(shù)的差異來實現(xiàn)對細菌的分型，主要是利用多重PCR方法對細菌染色體上多個VNTR位點進行擴增，并結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳方法精確測定VNTR位點的重復(fù)次數(shù)，之后通過聚類軟件對不同菌株VNTR位點重復(fù)次數(shù)進行聚類分析，可將菌株分為不同的基因型，從而確定不同菌株間的親緣進化關(guān)系[17]。Murphy[18]等第一次利用MLVA對45株食源Lm分離株進行分型分析，結(jié)果顯示MLVA成功的將從熏鮭魚中分離到的Lm與其他不相關(guān)食物分離到的Lm區(qū)分開；Dass[19]等采用MLVA來追蹤一冷凍熏鮭魚加工廠中Lm的傳播，共分離到124株Lm，分為8個MLVA型(Lma、Lmb、Lmc、Lmd、Lme、Lmf、Lmg和Lmi)，且成品冷凍煙熏鮭魚中主要攜帶兩類Lm：一類來源于原材料(Lma)，另一類來自于生產(chǎn)加工線(Lmc)，由此表明除了生產(chǎn)線外，原材料攜帶的Lm也可以通過生產(chǎn)加工線傳播并最終導(dǎo)致成品冷凍熏鮭魚的污染。這些對生產(chǎn)企業(yè)改進衛(wèi)生狀況以減少李斯特菌污具有重要指導(dǎo)意義。

與其他分子分型方法相比，MLVA具有以下優(yōu)點：(實驗操作簡便，該方法是基于PCR擴增，并結(jié)合電泳進行分析，整個過程只需數(shù)小時，且可實現(xiàn)高通量分析；可提供完整的數(shù)字化實驗結(jié)果，便于實驗室間進行比對。且有研究發(fā)現(xiàn)，MLVA對于4b型菌株的分辨力明顯高于PFGE、MLST、RT，其分辨力大小關(guān)系為MLVA>PFGE>MLST>RT[20]；而在另一研究中，研究者利用MLVA、PFGE同時對121株Lm臨床分離株進行分型比較，結(jié)果顯示PFGE的分辨力比較高[19]。但是在考慮到實驗室內(nèi)部進行比較的情況下，MLVA則比PFGE更為合適。雖然目前MVLA已廣泛應(yīng)用于多種細菌的分型研究，但其自身仍有一些不足：MLVA的引物設(shè)計首先需要全基因組序列信息，而已公布的參考菌株的全基因組序列太少，從而較難設(shè)計出高質(zhì)量特異性的引物；由于采用的儀器和電泳方法不同，導(dǎo)致了實驗結(jié)果間沒有可比性；MLVA實驗缺乏標(biāo)準菌株的建立，無法有效簡化實驗的標(biāo)準化控制，這也限制了MLVA技術(shù)在不同實驗室中的推廣應(yīng)用。

2.3 多位點序列分型(Multi-locus sequence analysis，MLST) 1998年Maiden[21]等首次提出多位點序列分型(Multi-locus sequence analysis，MLST)，該技術(shù)針對的是看家基因上存在的變異位點，通過對等位基因片段(allele)核苷酸序列進行測定來鑒定變異，從而揭示菌株間等位基因的多樣性及生物間的進化關(guān)系。由于看家基因是細菌生存、繁殖所必需的，且都具有保守性，所以在長期進化過程中改變較慢、相對穩(wěn)定，因此比較適合全球流行病學(xué)研究以及不同菌株間的遺傳進化關(guān)系。所選擇的位點序列通常位于看家基因內(nèi)部，長度約500 bp。經(jīng)過MLST分析后，每個等位基因位點被命名為一個基因序號，這些等位基因位點的信息構(gòu)成一個等位基因圖譜(allele profile)，即序列型(sequence type，ST)[21]。Salcedo等首次建立了Lm的MLST方案，確定了用于分型的7個管家基因(abcZ、bglA、cat、dapE、dat、ldh和lhkA)，為了方便進行不同實驗室間數(shù)據(jù)比較，巴斯德研究所建立了專門用于LmMLST分型的數(shù)據(jù)庫(http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlst/Lmono.html)。

由于等位基因之間的細微差異也會導(dǎo)致菌株間的ST不同，因此可通過比較每個菌株的ST型別來揭示它們之間的親緣關(guān)系，當(dāng)細菌發(fā)生變異時，等位基因上多個位點的差異與單個位點差異相比具有較遠的親緣關(guān)系。Wang[22]等對中國12個省的212株Lm進行MLST分型分析，結(jié)果顯示212株菌株可分為36個ST型，其中ST9(29.1%)比較占優(yōu)勢，且均是血清型1/2c菌株；同時通過繪制最小生成樹發(fā)現(xiàn)，有7個ST型(ST1-ST3、ST5、ST6、ST8、ST9)在國、內(nèi)外均屬于流行ST型，可引起母嬰感染或疾病暴發(fā)，提示加強對這些ST型菌株的監(jiān)控對于預(yù)防和控制李斯特菌病具有重要的指導(dǎo)意義。Knabel SJ[23]等利用MLST技術(shù)對71株Lm進行分析，將菌株分為17個ST型，繪制最小生成樹，并結(jié)合血清型進行分析，結(jié)果顯示共有49株菌株分布在CC8中，其中除一株菌株血清型為3a，其余菌株血清型均為1/2a。并與PFGE分型結(jié)果進行比較，認為MLST為Lm分型提供優(yōu)于血清分型和PFGE的分辨力。

MLST通過分析基因的核苷酸序列，可發(fā)現(xiàn)比電泳圖譜分析更多的等位基因，并通過構(gòu)建進化樹來推斷不同菌株間的遺傳進化關(guān)系，從而彌補了針對基因表達產(chǎn)物進行分型分析的技術(shù)的缺陷。此外，與PFGE等凝膠電泳方法相比，MLST是通過測定核苷酸序列進行的，操作簡便快速，且數(shù)據(jù)易驗證、保存和共享，是標(biāo)準化的技術(shù)，很好的解決了不同實驗室相互比較結(jié)果時存在的困難[24]。當(dāng)然，MLST擁有諸多優(yōu)點的同時，也存在一定的局限性：該方法對于血清型為4b的菌株分辨力較低；MLST的分辨力取決于看家基因的變異情況，因此基因位點的選擇對于分辨力有著很大的影響，看家基因變異程度低或無變異的菌株不適合采用MLST；高額的費用和所需的特定儀器也是限制MLST推廣普及的原因之一[25-27]。

2.4 多位點毒力序列分型(Multi-Virulence-Locus SequenceTyping，MVLST) MVLST是一種在MLST基礎(chǔ)上，用進化較快的毒力和毒力相關(guān)基因代替看家基因?qū)Σ≡⑸镞M行分型分析的方法，是近年來發(fā)展較快一種新型分型技術(shù)。當(dāng)需要了解Lm的地區(qū)流行狀況時，若待測菌株的看家基因序列變化較小，會導(dǎo)致MLST的分辨能力不足，因此不適合Lm的局部流行病學(xué)研究[28]。而Lm中的一些毒力基因和毒力相關(guān)基因經(jīng)常暴露于不斷變化的環(huán)境中，與看家基因相比，進化較快，因此這些基因具有較高的核苷酸序列多態(tài)性，在地區(qū)流行病學(xué)研究中具有較強的分辨能力[29]。Zhang[28]等在研究中發(fā)現(xiàn)MLST不能有效地區(qū)分血清型l/2b和4b菌株，因此提出了MVLST分型技術(shù)，同時與PFGE、RT和MLST的進行比較，結(jié)果顯示MVLST對血清型為l/2a和4b的菌株分辨力較強。Rocha[30]等對從患有腦膜炎的反芻動物中分離到的21株Lm進行MVLST分型，從而檢測流行性克隆菌株，并將分型結(jié)果與人源分離株進行比對。結(jié)果顯示60%的動物源分離株分布在ECI中，而ECI又與人類李斯特菌病的暴發(fā)相關(guān)，比如，1981年加拿大暴發(fā)的病例就與羊使用的飼料有關(guān)、1985年加利福尼亞暴發(fā)病例與使用的生牛奶相關(guān)，以上研究結(jié)果揭示反芻動物攜帶的Lm會導(dǎo)致人李斯特菌病的流行暴發(fā)。MVLST可以將流行不相關(guān)菌株區(qū)分開，又可以將流行相關(guān)菌株聚類在一起，Yi Chen[31]等指出MVLST在研究暴發(fā)菌株間的關(guān)系時有很好的鑒別能力，因此在地區(qū)流行病學(xué)研究中，MVLST將會是一種更簡便的分型技術(shù)。

2.5 遺傳譜系分型(Lineages)Lm作為一種食源性致病菌，一旦進入動物或人體體內(nèi)后，可引起嚴重的李斯特菌病，因此，為了制定有效的監(jiān)控、預(yù)防措施，需要充分的了解Lm遺傳學(xué)及生態(tài)學(xué)相關(guān)信息。早在1989年，Piffaretti[32]等報道了利用MLEE分型方法對175株不同來源的Lm進行分析，通過分析16個與代謝酶相關(guān)的等位基因的變異情況，將全部菌株分為45個ETs型，之后進行聚類分析，首次發(fā)現(xiàn)這些菌株可以分為兩個譜系(I和II)，其中譜系I包括血清型4b、1/2b和4a，譜系II包括血清型1/2a和1/2c；隨后Rasmussen[33]等基于flaA(flagellin)，hly，iap(p60)，23S rDNA的部分測序數(shù)據(jù)，通過毒力基因等位分析和核糖體分型發(fā)現(xiàn)Lm可以分為3個譜系(I、II和III)，其中譜系III由兩株血清型4a菌株構(gòu)成；最近的研究中，Orsi RH[34]等對不同來源Lm的3個染色體區(qū)域進行SNP分析，包括：prfA，plcA，hly，mpl，actA，plcB，Lmo0206；Lmo0298，Lmo0299，Lmo0300；inlA，inlB。結(jié)果顯示，Lm可以分為4個譜系(I，II，III和IV)，大多數(shù)Lm分離株屬于譜系I和譜系II。譜系I包括血清型1/2b、3b、3c和4b 4種菌株，譜系II包括血清型1/2a、1/2c和3a 3種菌株，其中血清型1/2b、4b、1/2a與人李斯特菌病相關(guān)。大多數(shù)人李斯特菌暴發(fā)病例常與譜系I菌株相關(guān)，人臨床分離株中譜系I的多于譜系II；譜系II菌株在食品中占主要優(yōu)勢，存在于多樣環(huán)境中，通常從動物及散發(fā)人李斯特菌病病例中分離得到。與譜系I相比，譜系II含有更多的質(zhì)粒，可以耐受有毒重金屬和細菌素。譜系II由于inlA和prfA的突變而使毒力減弱；譜系III和IV菌株則較為稀少，主要從動物中分離得到。由此可見，通過對Lm進行譜系分型分析，不僅可以促進對Lm遺傳進化方面的理解，還可以揭示不同血清型Lm在傳播以及致病力方面的不同。

3 結(jié) 語

Lm作為一種重要的人獸共患病的食源性致病菌，不僅影響人們的日常生活，甚至危及生命。由于病原微生物的表型變化落后于基因變化，因此，以表型特征為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)分型方法，如血清分型、噬菌體分型等，已不能滿足流行病學(xué)調(diào)查的需要。而基于DNA的分子分型技術(shù)，以其快速、準確、分辨率高等優(yōu)勢，將必然取代傳統(tǒng)分型方法成為Lm流行病學(xué)研究的重要工具。并且隨著技術(shù)的不斷標(biāo)準化和規(guī)范化，在了解菌株的親緣關(guān)系、追蹤傳染源、控制疫情的暴發(fā)和傳播等方面，分子分型技術(shù)將日益凸顯其重要作用，從而為食品安全控制帶來更多便利。

[1]Mead PS, Slutsker L, Dietz V. Food-related illness and death in the United States[J]. Emerg Infect Dis, 1999, 5(5): 607-625.

[2]Bell C, Kyriakides A.Listeria: a practical approach to the organism and its control in foods[M]. London: Blackwell Publishing, 2005.

[3]Borucki MK, Gay CC, Reynolds J, et al. Genetic diversity ofListeriamonocytogenesstrains from a high-prevalence dairy farm[J]. Appl Environ Microbiol, 2005, 71(10): 5893-5899. DOI:10.1128/AEM.71.10.5893-5899.2005

[4]Wang YC, Dong L, Yu HX. Research onListeriamonocytogenes[J]. J Med Pest Ctrl, 2012, 28(10): 1175-1177. (in Chinese) 王燕春, 董麗, 于慧霞. 關(guān)于單核細胞增生李斯特菌的探討和研究[J]. 醫(yī)學(xué)動物防制, 2012, 28(10): 1175-1177.

[5]Pagotto F, Ng LK, Clark C, et al. Canadian listeriosis reference service[J]. Foodbome Pathog Dis, 2006, 3(1): 132-137. DOI:10.1089/fpd.2006.3.132

[6]Wu SY, Li YH, Ran L, et al. Active surveillance onListeriamonocytogenesin seven kinds of food in 11 provinces of China in 2001[J]. Chin J Epidemiol, 2003, 24(8): 657-660. (in Chinese) 吳蜀豫, 李迎惠, 冉陸, 等. 中國2001年11省(市)食品中李斯特菌污染狀況的主動監(jiān)測[J]. 中華流行病學(xué)雜志, 2003, 24(8): 657-660.

[7]WHO. Anonymousl foodbornListeriareport of WHO informal working Group[R]. Geneva: WHO, 1988: 20.

[8]Lomonaco S, Verghese B,Gerner-Smidt P, et al. Novel epidemic clones ofListeriamonocytogenes, United States, 2011[J]. Emerg Infect Dis, 2013, 19(1): 147-150. DOI:10.3201/eid1901.121167

[9]de Valk H, Vaillant V, Jacquet C, et al. Two consecutive nationwide outbreaks of listeriosis in France, October 1999-February 2000[J]. Am J Epidemiol, 2001, 154(10): 944-950. DOI:10.1093/aje/154.10.944

[10]Sa RGW, Hu WZ, Jiang AL, et al. Research progress of pathogenic mechanism ofListeriamonocytogenes[J]. Sci Tech Food Ind, 2013, 1(34): 372-376. (in Chinese) 薩仁高娃, 胡文忠, 姜愛麗, 等. 產(chǎn)單核細胞增生性李斯特氏菌致病機制的研究進展[J]. 食品工業(yè)科學(xué), 2013, 1(34): 372-376.

[11]Sant’Ana AS, Igarashi MC, Landgraf M, et al. Prevalence, populations and pheno-and genotypic characteristics ofListeriamonocytogenesisolated from ready-to-eat vegetables marketed in Sao Paulo, Brazil[J]. Int J Food Microbiol, 2012, 155(1-2): 1-9. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2011.12.036

[12]Bender JB, Hedberg CW, Boxrud DJ, et al. Use of molecular subtyping in surveillance forSalmonellaentericasubsp serotype typhimurium[J]. N Engl J Med, 2001, 344(3): 189-195. DOI:10.1056/NEJM200101183440305

[13]Chen WW, Hong JC, Zhang QJ, et al. Virulence-associated genes and molecular subtyping ofListeriamonocytogenesin Foods[J]. Chin J Food Hyg, 2007, 19(1): 21-25. (in Chinese) 陳偉偉, 洪錦春, 張巧姬, 等. 單核細胞增生李斯特菌的毒力基因檢測及PFGE分型的研究[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志, 2007, 19(1): 21-25.

[14]Fugett EB, Schoonmaker-Bopp D, Dumas NB, et al. Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) analysis of temporally matchedListeriamonocytogenesisolates from human clinical cases, foods, ruminant farms, and urban and natural environments reveals source-associated as well as widely distributed PFGE types[J]. J Clin Microbiol, 2007, 45(3): 865-873. DOI:10.1128/JCM.01285-06

[15]Jiang L, Chen J, Xu J, et al. Virulence characterization and genotypic analyses ofListeriamonocytogenesisolates from food and processing environments in eastern China[J]. Int J Food Microbiol, 2008, 121(1): 53-59. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2007.10.007

[16]Murphy M, Corcoran D, Buckley J, et al. Development and application of multiple-locus variable number of tandem repeat analysis (MLVA) to subtype a collection ofListeriamonocytogenes[J]. Int J Food Microbiol, 2007, 115(2): 187-194. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2006.10.022

[17]Chen S, Li J, Saleh-Lakha S, et al. Multiple-locus variable number of tandem repeat analysis (MLVA) ofListeriamonocytogenesdirectly in food samples[J]. Int J Food Microbiol, 2011, 148(1): 8-14. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2011.04.014

[18]Murphy M, Corcoran D, Buckley JF, et al. Development and application of multiple-locus variable number of tandem repeat analysis (MLVA) to subtype a collection ofListeriamonocytogenes[J]. Int J Food Microbiol, 2007, 115(2): 187-94. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2006.10.02

[19]Dass SC, Abu-Ghannam N, Antony-Babu S, et al. Ecology and molecular typing ofListeriamonocytogenesin a processing plant for cold-smoked salmon in the Republic of Ireland[J]. Food Res Int, 2010, 43: 1529-1536. DOI:10.1016/j.foodres.2010.04.030

[20]Miya S, Kimura B, Sato M, et al. Development of a multilocus variable-number of tandem repeat typing method forListeriamonocytogenesserotype 4b strains[J]. Int J Food Microbiol, 2008, 124(3): 239-249. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2008.03.023

[21]Maiden MC, Bygraves JA, Feil E, et al. Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998, 95(6): 3140-3145.

[22]Wang Y, Zhao A, Zhu R, et al. Genetic diversity and molecular typing ofListeriamonocytogenesin China[J]. BMC Microbiol, 2012, 12: 119. DOI:10.1186/1471-2180-12-119

[23]Knabel SJ, Reimer A, Verghese B, et al. Sequence typing confirms that a predominantListeriamonocytogenesclone caused human listeriosis cases and outbreaks in Canada from 1988 to 2010[J]. J Clin Microbiol, 2012, 50(5): 1748-1751. DOI:10.1128/JCM.06185-11

[24]Qin L, Masaki H, Cotoh K, et al. Molecular epidcmiological study ofMoraxellaeatarrhalisisolated from nosoeomial respiratory infection patients in a community hospital in Japan[J]. Intern Med, 2009, 48(10): 797-803. DOI:10.2169/internalmedicine.48.2036

[25]Enright MC, Spratt BG. Multilocus sequence typing[J]. Trends Microbiol, 1999, 7(12): 482-487. DOI:10.1016/S0966-842X(99)01609-1

[26]Cai S, Kabuki DY, Kuaye AY, et al. Rational design of DNA sequence-based strategies for subtypingListeriamonocytogenes[J]. J Clin Microbiol, 2002, 40(9): 3319-3325. DOI:10.1128/JCM.40.9.3319-3325.2002

[27]Revazishvili T, Kotetishvili M, Stine OC, et al. Comparative analysis of multilocus sequence typing and pulsed-field gel electrophoresis for characterizingListeriamonocytogenesstrains isolated from environmental and clinical sources[J]. J Clin Microbiol, 2004, 42(1): 276-285. DOI:10.1128/JCM.42.1.276-285.2004

[28]Zhang W, Jayarao BM, Knabel SJ. Multi-virulence-locus sequence typing ofListeriamonocytogenes[J]. Appl Environ Microbiol, 2004, 70(2): 913-920. DOI:10.1128/AEM.70.2.913-920.2004

[29]Cai S, Kabuki DY, Kuaye AY, et al. Rational design of DNA sequence-based strategies for subtypingListeriamonocytogenes[J]. J Clin Microbiol, 2002, 40(9): 3319-3325. DOI:10.1128/JCM.40.9.3319-3325.2002

[30]Rocha PR, Lomonaco S, Bottero MT, et al. Ruminant rhombencephalitis-associatedListeriamonocytogenesstrains constitute a genetically homogeneous group related to human outbreak strains[J]. Appl Environ Microbiol, 2013, 79(9): 3059-3066. DOI:10.1128/AEM.00219-13

[31]Chen Y, Zhang W, Knabel SJ. Multi-virulence-locus sequence typing clarifies epidemiology of recent listeriosis outbreaks in the United States[J]. J Clin Microbiol, 2005, 43(10): 5291-5294. DOI:10.1128/JCM.43.10.5291-5294.2005

[32]Piffaretti JC, Kressebuch H, Aeschbacher M, et al. Genetic characterization of clones of the bacteriumListeriamonocytogenescausing epidemic disease[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1989, 86(10): 3818-3822.

[33]Rasmussen OF, Skouboe P, Dons L, et al.Listeriamonocytogenesexists in at least three evolutionary lines: evidence from flagellin, invasive associated protein and listeriolysin O genes[J]. Microbiology, 1995, 141(9): 2053-2061. DOI:10.1099/13500872-141-9-2053

[34]Orsi RH,den Bakker HC, Wiedmann M.Listeriamonocytogeneslineages: genomics, evolution, ecology, and phenotypic characteristics[J]. Int J Med Microbiol, 2011, 301(2): 79-96. DOI:10.1016/j.ijmm.2010.05.002

Yin Yue-lan, Email: yylan@yzu.edu.cn

Applications of molecular typing methods to the epidemiology ofListeriamonocytogenes

LIAN Kai,YE Shu-yang,YIN Yue-lan,JIAO Xin-an

(JiangsuKeyLaboratoryofZoonosis/JiangsuCo-InnovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseaseandZoonoses,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China)

Listeriamonocytogenes(Lm) is a gram-positive, facultative intracellular bacterium which is widely distributed in the environment, and can infect more than 40 kinds of animal.Lmis described as an important foodborne pathogen that can cause zoonotic listeriosis, with the characteristics of low morbidity and high mortality. Traditional typing methods forLmare complex, poor repetitiveness and low-resolution. Currently, more and more molecular typing methods for discrimination ofLmare being established, they become more sensitive and discriminative compared with the phenotypic subtyping methods and are widely used for typingListeriaisolates. In this study, five common molecular typing methods (PFGE, MLVA, MLST, MVLST, Lineage) are introduced and compared, providing valuable reference for tracing the source of pathogenicLmcontamination and transmission routes.

Listeriamonocytogenes; molecular typing method; epidemiology; listeriosis

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.08.015

國家自然科學(xué)基金(No.31472193)；江蘇省科技支撐計劃(No.BE2012367);江蘇省自然科學(xué)基金(No.BK2011446)聯(lián)合資助

殷月蘭，Email: yylan@yzu.edu.cn

揚州大學(xué)，江蘇省人獸共患病重點實驗室，江蘇省動物主要疫病防控協(xié)同創(chuàng)新中心， 揚州 225009

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31472193), the Jiangsu Key Technology R&D Program (No. BE2012367), and the Natural Science Foundation of Jiangsu Province (No. BK2011446)

R378

A

1002-2694(2015)08-0757-06

2014-09-10；

2015-01-26