腸道病毒2A蛋白酶與細(xì)胞蛋白相互作用的研究進(jìn)展

趙天生，方 舒，黃孝天，夏燕華

·綜 述·

腸道病毒2A蛋白酶與細(xì)胞蛋白相互作用的研究進(jìn)展

趙天生1，方 舒2，黃孝天1，夏燕華1

腸道病毒感染可導(dǎo)致多種重要的人類疾病，給人類健康和生命帶來(lái)極大的威脅。腸道病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞后會(huì)影響細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成、大分子轉(zhuǎn)運(yùn)、抗病毒反應(yīng)等過(guò)程，據(jù)研究這與腸道病毒2A蛋白酶作用于細(xì)胞蛋白有關(guān)。在此，我們對(duì)腸道病毒2A蛋白酶與宿主細(xì)胞蛋白間的相互作用進(jìn)行綜述，以便全面而深入的了解2A蛋白酶在腸道病毒致病過(guò)程中的重要作用，有助于更好的理解腸道病毒的致病機(jī)理，為防治腸道病毒感染提供新的思路。

腸道病毒；2A蛋白酶；蛋白相互作用

腸道病毒包括脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovirus, PV)、柯薩奇病毒(coxsackievirus, CV)、?？刹《?ECHO virus)和新腸道病毒(enterovirus, EV)等。這些病毒感染可導(dǎo)致多種重要的人類疾病，如脊髓灰質(zhì)炎、手足口病、病毒性腦膜炎、病毒性心肌病等。許多動(dòng)物病毒編碼蛋白酶，這些蛋白酶通常具有兩方面的功能，一方面裂解病毒多肽前體產(chǎn)生成熟蛋白，構(gòu)成病毒體或參與病毒復(fù)制；另一方面作用于細(xì)胞蛋白，細(xì)胞蛋白通常作為蛋白酶的作用底物，經(jīng)蛋白酶裂解后影響細(xì)胞的生命過(guò)程。腸道病毒編碼一種2A蛋白酶(2Apro)，該酶不僅參與病毒的生命周期，而且作用于多種細(xì)胞蛋白，影響宿主細(xì)胞的多種重要的生物學(xué)功能。

1 腸道病毒及其基因組結(jié)構(gòu)

腸道病毒具有相似的基因組結(jié)構(gòu)和組成?；蚪M為約7.4 kb的單股正鏈RNA，僅含一個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frame, ORF)，編碼約2 000個(gè)氨基酸組成的多聚蛋白。在基因組的5′ 端和3′ 端為保守的非編碼區(qū)(untranslated region, UTR)。3′UTR末端有一個(gè)長(zhǎng)度可變的多聚腺苷酸尾poly(A)，而5′ UTR共價(jià)結(jié)合一個(gè)小分子量蛋白質(zhì)VPg。多聚蛋白被病毒和細(xì)胞的蛋白酶水解成4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白VP1～VP4和7 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D。

2 2Apro在腸道病毒生命周期中的重要功能

2Apro屬于半胱氨酸蛋白酶家族[1]，約由150個(gè)氨基酸組成。突變分析表明，His20，Asp38和Cys109構(gòu)成了PV 2Apro的催化中心[2]。2AproC-端含有一個(gè)酸性結(jié)構(gòu)域，據(jù)研究EV71和 CVB3 2Apro在酵母細(xì)胞中表現(xiàn)出強(qiáng)烈的轉(zhuǎn)錄活性，而該酸性結(jié)構(gòu)域則是轉(zhuǎn)錄活性所必需的[3]。

2Apro的首要功能是參與病毒的多肽切割和蛋白成熟。腸道病毒的11個(gè)成熟蛋白是在2Apro和3Cpro的作用下分三步完成的：首先通過(guò)2Apro的自我切割使P1前體蛋白從腸道病毒多聚蛋白中釋放出來(lái)，進(jìn)而在3Cpro的作用下使多聚蛋白P2(2ABC) 和P3(3ABCD)分離，最后在2Apro和3Cpro的共同作用下形成單個(gè)成熟的病毒蛋白。除此之外，2Apro可穩(wěn)定病毒RNA、促進(jìn)負(fù)鏈RNA的合成和病毒蛋白的翻譯[4]。

3 腸道病毒2Apro對(duì)宿主細(xì)胞的重要作用

3.1 2Apro對(duì)細(xì)胞的毒性作用 研究發(fā)現(xiàn)，2Apro對(duì)多種細(xì)胞具有毒性作用。PV 2Apro在HeLa細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)可誘導(dǎo)CPE(如細(xì)胞變圓，脫落等)，PV 2Apro缺失突變株對(duì)HeLa細(xì)胞毒性明顯減弱[5]。CVB3 2Apro的長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)則可激活caspases，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。PV 2Apro的表達(dá)對(duì)酵母細(xì)胞具有強(qiáng)烈的毒性作用，表達(dá)5h后酵母細(xì)胞生長(zhǎng)受抑，細(xì)胞存活率急劇下降[7]。利用RNA干擾作用使2A表達(dá)沉默可明顯增強(qiáng)感染細(xì)胞的活力。該現(xiàn)象在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中尤為突出，CVB3 2A的沉默表達(dá)使小鼠組織中病毒的滴度顯著下降，組織損傷減輕并極大延長(zhǎng)了小鼠的存活時(shí)間[8]。

3.2 2Apro對(duì)細(xì)胞毒性作用的分子機(jī)制 腸道病毒 2Apro對(duì)宿主細(xì)胞的毒性作用與其作用于多種細(xì)胞蛋白有關(guān)。歸納起來(lái)，與2Apro相互作用的細(xì)胞蛋白有翻譯起始因子(eukaryotic initiation factor, eIF)4G、多聚腺嘌呤結(jié)合蛋白(poly(A)-binding protein, PABP)、核孔蛋白、細(xì)胞骨架蛋白等。2Apro與細(xì)胞蛋白的相互作用導(dǎo)致細(xì)胞的多種功能，如轉(zhuǎn)錄、翻譯、大分子轉(zhuǎn)運(yùn)和抗病毒反應(yīng)等受到影響。

3.2.1 2Apro切割eIF4G和PABP影響宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成 對(duì)于多數(shù)真核mRNAs，翻譯起始是從異源三聚體復(fù)合物eIF4F識(shí)別帽結(jié)構(gòu)(7mGpppN)和PABP開(kāi)始的。eIF4F由帽結(jié)合蛋白(cap-binding protein) eIF4E、DEAD-box 解旋酶eIF4A和翻譯起始因子eIF4G所構(gòu)成。其中，eIF4G是起始蛋白質(zhì)翻譯最重要的調(diào)節(jié)分子。腸道病毒感染可致宿主細(xì)胞蛋白合成快速終止和病毒mRNA翻譯的有效起始[9]。研究發(fā)現(xiàn)，在PV和CV感染細(xì)胞中，eIF4G的切割同步于細(xì)胞蛋白合成的終止，這種終止與eIF4F復(fù)合物中eIF4G的水解有關(guān)[10]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，eIF4G的水解是由2Apro所介導(dǎo)的[11-12]。早期研究者并未從PV感染細(xì)胞抽提物中共純化2Apro和eIF4G，猜測(cè)可能還要其他的翻譯因子被活化并參與2Apro對(duì)eIF4G的蛋白裂解。直到近年來(lái)，體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)均證明，PV、CV、EV 2Apro可直接切割eIF4G[13]。2A突變病毒株感染COS-1細(xì)胞后，eIF4G未發(fā)生水解[14]，至此證明腸道病毒可通過(guò)2Apro切割eIF4G影響宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成。

大多數(shù)真核mRNAs包含一個(gè)39nt的poly(A)尾。關(guān)于poly(A)尾，目前已知的功能是參與mRNA的核-質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)mRNA，以及增強(qiáng)mRNA翻譯。poly(A)尾在翻譯中的作用被認(rèn)為是由PABP所介導(dǎo)的。PABP是真核RNA結(jié)合蛋白家族中的代表，在連接40S核糖體亞單位和mRNA以及招募60S核糖體亞單位中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，只有通過(guò)poly(A)尾與PABP相連的mRNAs才能被翻譯[15]。向兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物(rabbit reticulocyte lysate，RRL)翻譯系統(tǒng)中加入poly(A)，具有帽和poly(A)尾結(jié)構(gòu)的mRNAs的翻譯受到抑制。這種抑制效應(yīng)可因加入過(guò)量PABP得到緩解，表明加入的poly(A)隔絕了內(nèi)源性PABP[16]。深入研究發(fā)現(xiàn)，CV感染細(xì)胞中，PABP同樣被2Apro切割，使宿主細(xì)胞蛋白翻譯受阻，這可能是腸道病毒感染影響宿主細(xì)胞翻譯的另一種機(jī)制[17]。

3.2.2 2Apro作用于核孔蛋白影響大分子的核-質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn) 由30多種核孔素(nucleoporins, Nups)構(gòu)成的核孔復(fù)合物(nuclear pore complex, NPC)是細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)(包括RNAs和蛋白質(zhì))運(yùn)輸?shù)闹饕ǖ?，也是病毒作用的主要目?biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，PV感染可改變大分子的細(xì)胞定位，如使核蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)[18]。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，PV 2Apro可誘導(dǎo)NPC嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)性損傷，其構(gòu)成成分Nup98、Nup153和Nup62先后不同程度的被2Apro降解，在蛋白質(zhì)核運(yùn)輸受阻的同時(shí)RNA的定位也發(fā)生紊亂[19-20]。影響核-質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)于腸道病毒的意義可能有兩點(diǎn)：細(xì)胞質(zhì)中核蛋白的增加可促進(jìn)病毒的復(fù)制，同時(shí)阻止轉(zhuǎn)錄因子入核可防止一系列抗病毒反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。

3.2.3 2Apro影響宿主細(xì)胞的抗病毒反應(yīng) 盡管細(xì)胞的翻譯過(guò)程、大分子運(yùn)輸受阻必然影響抗病毒基因的表達(dá)，但研究發(fā)現(xiàn)2Apro可直接作用于細(xì)胞免疫系統(tǒng)，影響細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)。PV1-3型和EV71均能在IFN-а預(yù)處理的細(xì)胞中復(fù)制，而2Apro的突變可使PV對(duì)IFN-а敏感[21]。RIG-I和RIG-I樣受體MDA5是天然抗病毒反應(yīng)中的關(guān)鍵分子，一旦識(shí)別到病毒RNA就會(huì)與線粒體抗病毒信號(hào) (mitochondrial anti-viral signaling, MAVS)相互作用，最終誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，腸道病毒感染時(shí)，MDA5以不同方式降解，如PV感染時(shí)MDA5的降解是由caspase和蛋白酶體所介導(dǎo)的，而CVB3感染時(shí)MDA5和 MAVS的切割都是由2Apro介導(dǎo)的[22-23]，說(shuō)明腸道病毒可直接作用于干擾素系統(tǒng)來(lái)拮抗細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)。

3.2.4 2Apro作用于細(xì)胞骨架蛋白dystrophin導(dǎo)致心肌病 人類擴(kuò)張型心肌病有兩種，一種是家族遺傳型，主要原因是細(xì)胞骨架蛋白dystrophin基因發(fā)生突變；另一種是獲得型，是由多因素造成的，其中約30%是由腸道病毒感染導(dǎo)致。研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論哪一種心肌病實(shí)際上都是細(xì)胞骨架性疾病，如細(xì)胞骨架蛋白dystrophin的移碼突變或錯(cuò)義突變都可導(dǎo)致心肌病的發(fā)生[24]。腸道病毒感染可致細(xì)胞骨架蛋白dystrophin降解，其作用主要是由2Apro所介導(dǎo)的[25]。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，CVB3 2Apro的確能切割人類和大鼠dystrophin，導(dǎo)致心肌細(xì)胞形態(tài)和功能的破壞，被認(rèn)為是形成擴(kuò)張型心肌病的主要原因[26]。CVB感染的小鼠模型中，過(guò)量表達(dá)2A蛋白可導(dǎo)致嚴(yán)重的心肌功能障礙和擴(kuò)張型心肌病[27]。

4 討 論

細(xì)胞蛋白網(wǎng)絡(luò)是一個(gè)復(fù)雜而又高度有序的整體，蛋白質(zhì)相互之間是相互關(guān)聯(lián)的，既有促進(jìn)也有制約作用，它們共同維護(hù)細(xì)胞的生命進(jìn)程。細(xì)胞被病毒感染后，某一種或幾種細(xì)胞蛋白受到病毒蛋白酶的水解作用，不僅影響該蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，同時(shí)會(huì)打破細(xì)胞蛋白網(wǎng)路的有序性，進(jìn)而影響整個(gè)細(xì)胞的生命進(jìn)程。為了給病毒生命周期創(chuàng)造一個(gè)積極的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，單個(gè)病毒蛋白能夠調(diào)節(jié)基因表達(dá)的多個(gè)步驟，如腸道病毒2Apro作用的細(xì)胞蛋白涉及到轉(zhuǎn)錄、翻譯和核-質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等。

病毒作為一種嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生微生物，其目的顯然不是為了殺死宿主細(xì)胞而使自身失去寄居的場(chǎng)所，其終極目標(biāo)是復(fù)制自我產(chǎn)生子代，而復(fù)制除了需要各種資源和能量外，還會(huì)受到來(lái)自細(xì)胞免疫系統(tǒng)的抗病毒作用。由于腸道病毒的翻譯起始過(guò)程不同于真核細(xì)胞，因此2Apro裂解eIF4G僅會(huì)關(guān)閉細(xì)胞蛋白合成而不會(huì)影響病毒的蛋白合成，因此可直接接管宿主細(xì)胞的蛋白合成機(jī)器，解決了復(fù)制所需要資源和能量的問(wèn)題。蛋白酶對(duì)宿主蛋白水解的同時(shí)會(huì)影響其他的細(xì)胞功能，如抗病毒反應(yīng)?？共《痉磻?yīng)中各種蛋白質(zhì)的合成由于eIF4G的水解而受到影響。天然免疫途徑的活化和抗病毒反應(yīng)的建立依賴于信號(hào)從核孔復(fù)合體轉(zhuǎn)運(yùn)到核膜。PV 2Apro水解核孔素破壞核孔復(fù)合體結(jié)構(gòu)，從而阻止大分子物質(zhì)的核-質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。轉(zhuǎn)運(yùn)受阻可抑制抗病毒信號(hào)的核輸出或阻止對(duì)病毒有害的細(xì)胞mRNA的輸出。因此，腸道病毒利用自身編碼的蛋白酶從不同水平阻止細(xì)胞基因表達(dá)，如翻譯，轉(zhuǎn)錄或蛋白和RNA在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)間的轉(zhuǎn)運(yùn)。除此之外，腸道病毒還可直接作用于干擾素產(chǎn)生過(guò)程中涉及到的重要分子如MDA5和 MAVS，直接影響細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)。由此可見(jiàn)，病毒蛋白酶在病毒的生命周期中起著極為重要的作用。

對(duì)病毒蛋白酶的研究有助于從分子水平理解病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的機(jī)制。更為重要的是，病毒蛋白酶可作為揭示其靶蛋白確切功能的一種工具。從這點(diǎn)來(lái)說(shuō)，腸道病毒2Apro不僅在處理腸道病毒多聚蛋白而且在與宿主細(xì)胞的相互作用中都起到了關(guān)鍵性作用。通過(guò)揭示腸道病毒2Apro靶蛋白，我們能夠制定與2Apro相互作用的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，從而有助于我們從分子水平深入理解病毒蛋白酶的功能及揭示腸道病毒的分子致病機(jī)制。

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Xia Yan-hua, Email: xiayanhua@ncu.edu.cn

Research progress on interaction between enterovirus 2A protease and cellular proteins

ZHAO Tian-sheng1,FANG Shu2,HUANG Xiao-tian1,XIA Yan-hua1

(1.MedicalCollege,NanchangUniversity,Nanchang330006,China; 2.UndergraduateofClinicalMedicine,Grade2011,MedicalCollege,NanchangUniversity,Nanchang330031,China)

Enterovirus infection can lead to a variety of important human diseases and bring great threat to human health and life. When enterovirus infects host cells, some cellular processes including protein synthesis, macromolecular transport and antiviral response will change, which is attributed to the role of viral 2A protease on cellular proteins. Here we summarized the interactions between viral 2A protease and cellular proteins, which is helpful to better understand the important function of 2A protease and the pathogenic mechanism of enterovirus and provide a new way for prevention and treatment of enterovirus infection.

enterovirus; 2A protease; protein interaction

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.09.014

江西省自然科學(xué)基金(20142BAB205070)和國(guó)家自然科學(xué)基金(81160196)聯(lián)合資助

夏燕華，Email: xiayanhua@ncu.edu.cn

1.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院，南昌 330006; 2.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院2011級(jí)臨床醫(yī)學(xué)系，南昌 330031

Funded by the Natural Science Foundation of Jiangxi Province (No. 20142BAB205070) and the National Natural Science Foundation of China (No. 81160196)

R373.2

A

1002-2694(2015)09-0850-04

2014-12-11；

2015-04-22