Th1/Th2平衡狀態(tài)與子宮內(nèi)膜息肉的相關(guān)性研究

李 慧，李曉紅，陸 洋，樊李平，李 瑾

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬寶安婦幼保健院 深圳市寶安區(qū)婦幼保健院生殖健康科，廣東 深圳518133)

Th1/Th2平衡狀態(tài)與子宮內(nèi)膜息肉的相關(guān)性研究

李 慧，李曉紅，陸 洋，樊李平，李 瑾

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬寶安婦幼保健院 深圳市寶安區(qū)婦幼保健院生殖健康科，廣東 深圳518133)

目的 通過檢測子宮內(nèi)膜息肉患者外周血輔助性T細(xì)胞(Th)中Th1/Th2平衡狀態(tài)，探討Th1/Th2與子宮內(nèi)膜息肉的相關(guān)性。方法 對25例子宮內(nèi)膜息肉患者(A組)行宮腔鏡下定位診刮活檢，病理診斷為子宮內(nèi)膜息肉；選擇20例孕前檢查婦科陰道B超未見異常的健康女性(B組)。對兩組均在非月經(jīng)期抽取空腹肘靜脈血，A組宮腔鏡術(shù)前取血。采用三色熒光標(biāo)記法流式細(xì)胞技術(shù)檢測兩組受檢者外周血Th0細(xì)胞(CD4+IFN-γ+IL-4+)、Th1細(xì)胞(CD4+IFN-γ+IL-4-)/Th2細(xì)胞(CD4+IFN-γ-IL-4+)。結(jié)果 兩組中Th0細(xì)胞比較無顯著性差異(P>0.05)。A組Th1細(xì)胞(33.33±8.68)%明顯高于B組(22.35±3.88)%，經(jīng)比較有顯著性差異(t=5.658，P<0.05)；A組Th2細(xì)胞(3.25±0.89)%低于B組(3.72±0.79)%，但經(jīng)比較無顯著性差異(P>0.05)；A組Th1/Th2比值(11.41±6.10)較B組(6.24±1.69)升高，經(jīng)比較有顯著性差異(t=4.047，P<0.05)。結(jié)論 子宮內(nèi)膜息肉與Th1/Th2平衡狀態(tài)有一定的關(guān)聯(lián)，這為研究子宮內(nèi)膜息肉的發(fā)生機(jī)制提供了新的思路。

子宮內(nèi)膜息肉；輔助性T細(xì)胞；Th1/Th2平衡；流式細(xì)胞儀

子宮內(nèi)膜息肉是由子宮內(nèi)膜腺體和含有厚壁血管的纖維化子宮內(nèi)膜間質(zhì)構(gòu)成的突出于子宮內(nèi)膜表面的良性結(jié)節(jié)。女性發(fā)病率約為25%[1]。子宮內(nèi)膜息肉的發(fā)病機(jī)理至今尚未明確，一般認(rèn)為與雌孕激素失衡及炎癥有關(guān)。另有觀點(diǎn)認(rèn)為子宮內(nèi)膜息肉是一種良性的子宮內(nèi)膜腫瘤，與直腸息肉一樣也是一種癌前病變的信號，子宮內(nèi)膜息肉的惡變率約為1%～3%[2]。

輔助性T細(xì)胞中Th1/Th2漂移是指Th1和Th2細(xì)胞的分化與功能互相制約，只有當(dāng)Thl/Th2處于動態(tài)平衡時，機(jī)體才處于健康狀態(tài)。Thl/Th2失衡會發(fā)生感染性疾病、過敏性疾病、自身免疫病以及腫瘤等。鑒于子宮內(nèi)膜息肉與炎癥及癌前病變有一定的關(guān)聯(lián)，本文檢測了子宮內(nèi)膜息肉患者外周血Th1/Th2平衡狀態(tài)，以探討TH1/Th2與子宮內(nèi)膜息肉的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2014年9至12月在深圳市寶安區(qū)婦幼保健院生殖健康科門診就診患者中經(jīng)陰道彩超檢查考慮子宮內(nèi)膜息肉，行宮腔鏡下定位診刮，經(jīng)過病理確診為子宮內(nèi)膜息肉的女性患者25例為子宮內(nèi)膜息肉組(A組)，年齡23～38歲，平均(29.2±3.9)歲；選取同期行孕前檢查的已婚健康女性20例為健康對照組(B組)，經(jīng)陰道婦科B超檢查結(jié)果未見異常，排除內(nèi)外科及婦產(chǎn)科疾病，年齡24～33歲，平均年齡(27.7±2.4)歲。兩組入選者年齡無顯著性差異(P>0.05)；之前未接受過任何治療，均無自身免疫性、過敏性疾病及急性炎性疾病，無糖尿病、高血壓、其他慢性病或近期服用激素類藥物治療。對入選者均避開月經(jīng)期，子宮內(nèi)膜息肉組患者在宮腔鏡術(shù)前均抽取空腹肘靜脈血2～3mL。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器

細(xì)胞刺激劑，布雷菲德菌素A(BFA)，紅細(xì)胞裂解液，異硫氫酸熒光素標(biāo)記的抗人CD4抗體(FITC anti-human CD4)，染色緩沖液，固定緩沖液，破膜洗液，藻紅素標(biāo)記的抗人白細(xì)胞介素-4抗體(PE anti-human IL-4)，別藻青蛋白標(biāo)記的抗人干擾素-γ抗體(APC anti-human IFN-γ)均購自美國Biolegend公司。流式細(xì)胞儀為美國BD公司 FACSCantoⅡ型，應(yīng)用BD FACSDiva軟件分析檢測數(shù)據(jù)。

1.2.2 外周血Th1/Th2細(xì)胞的檢測

1.2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 抽取靜脈血用肝素抗凝，3小時內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取無菌流式進(jìn)樣管，每管加入200μL肝素抗凝全血和200μL AIM-V無血清培養(yǎng)基。以細(xì)胞刺激劑置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育5小時。

1.2.2.2 細(xì)胞抗原染色 取兩只流式進(jìn)樣管，分別取刺激后血樣200μL，標(biāo)記為對照管和實(shí)驗(yàn)管。每管加入2mL紅細(xì)胞裂解液，室溫避光孵育10分鐘。經(jīng)2次離心棄上清后對照管和實(shí)驗(yàn)管各加入5μL FITC anti-human CD4，室溫避光孵育15分鐘。相繼加入細(xì)胞染色緩沖液，固定緩沖液分別離心，棄上清后，破膜洗液重懸細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)管加入PE anti-human IL-4和APC anti-human IFN-γ各5μL；對照管不加入抗體，室溫避光孵育20分鐘。繼以2mL破膜洗液重懸細(xì)胞，350g離心5分鐘，棄上清，重復(fù)洗滌2次。用500μL細(xì)胞染色緩沖液重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測。

1.2.2.3 流式細(xì)胞儀檢測 流式上機(jī)檢測采用三色熒光(FITC、PE、APC)流式細(xì)胞術(shù)。通過前向角散射/側(cè)向角散射(FSC/SSC)分群設(shè)門圈出樣本中T淋巴細(xì)胞，再對T淋巴細(xì)胞CD4/SSC分群設(shè)門圈出CD4+T淋巴細(xì)胞。使用BD FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀應(yīng)用BD FACSDiva軟件收集CD4+T淋巴細(xì)胞1～2萬并分析。結(jié)果表示為CD4+T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-4)的百分比。在本研究中，CD4+T淋巴細(xì)胞同時分泌IFN-γ和IL-4(CD4+IFN-γ+IL-4+)的細(xì)胞亞群定義Th0細(xì)胞，只分泌IFN-γ(CD4+IFN-γ+IL-4-)或IL-4(CD4+IFN-γ-IL-4+)的細(xì)胞亞群分別被定義為Th1和Th2細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

子宮內(nèi)膜息肉組(A組)與對照組(B組)比較，兩組中Th0細(xì)胞(CD4+IFN-γ+IL-4+)無顯著性差異(P>0.05)。A組外周血Th1細(xì)胞(CD4+IFN-γ+IL-4-)明顯升高，經(jīng)比較有顯著性差異(P<0.05)；Th2細(xì)胞(CD4+IFN-γ-IL-4+)B組高于A組，但兩組比較無顯著性差異(P>0.05)；Th1/Th2比值A(chǔ)組較B組升高，經(jīng)比較有顯著性差異(P<0.05)，見表1。

對T淋巴細(xì)胞CD4/SSC分群設(shè)門圈出CD4+T淋巴細(xì)胞見圖1、圖2中的第1圖；檢測到APC anti-human IFN-γ結(jié)合的Th1細(xì)胞(每組第2圖的Q1區(qū))，PE anti-human IL-4結(jié)合的Th2細(xì)胞(每組第2圖的Q3區(qū))，兼有APC、PE染色的Th0細(xì)胞(每組第2圖的Q2區(qū))。

圖1 A組CD4+T細(xì)胞中Th0、Th1、Th2細(xì)胞百分比

Fig.1 Percentages of Th0, Th1 and Th2 sub-groups in CD4+ T cells in group A

圖2 B組CD4+T細(xì)胞中Th0、Th1、Th2細(xì)胞百分比

Fig.2 Percentages of Th0, Th1 and Th2 sub-groups in CD4+ T cells in group B

3 討論

3.1 Th細(xì)胞的分類及功能特征

T淋巴細(xì)胞依據(jù)細(xì)胞表面分化抗原的不同可分為CD4+、CD8+兩大亞群，分別代表輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)和抑制/細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Ts/Tc)。CD4+T細(xì)胞(Th)產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫中起著重要的作用。根據(jù)分泌細(xì)胞因子的不同，CD4+細(xì)胞分為三大類，Th1細(xì)胞以產(chǎn)生IL-2、IFN-γ為主；Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4、IL-6和IL-10；Th0細(xì)胞可分泌兩類細(xì)胞因子。在正常情況下，Th1和Th2的前體細(xì)胞Th0細(xì)胞按一定比例向Th1和Th2細(xì)胞分化，兩者以相互拮抗和自身促進(jìn)的方式，形成復(fù)雜有序的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，分別行使各自不同的生理功能，調(diào)節(jié)正常的免疫應(yīng)答。在某些疾病的狀態(tài)下，Th0細(xì)胞受特異性抗原的刺激，使得Th1、Th2細(xì)胞某一亞群功能增強(qiáng)，另一亞群功能減弱，造成Th1/Th2平衡失調(diào)，產(chǎn)生細(xì)胞因子種類和數(shù)量的變化，結(jié)果進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞免疫及體液免疫的紊亂，引起異常免疫應(yīng)答。

3.2 子宮內(nèi)膜息肉與Th1/Th2漂移的關(guān)系

子宮內(nèi)膜息肉是較為常見的良性病變，本文中子宮內(nèi)膜息肉患者的Th1/Th2表現(xiàn)為Th1細(xì)胞優(yōu)勢。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜息肉的不孕患者無論是外周血還是內(nèi)膜組織中IFN-γ明顯高于非子宮內(nèi)膜息肉的不孕患者[2]。IFN-γ為Th1類細(xì)胞因子，另外巨噬細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞可分泌IFN-γ，IFN-γ可使致敏的T細(xì)胞從Th2經(jīng)Th0向Thl轉(zhuǎn)化；IFN-γ明顯升高提示Th1/Th2表現(xiàn)為Th1優(yōu)勢，與本文研究結(jié)果一致。機(jī)體對抗自身及外來抗原入侵過程中，以Th1型介導(dǎo)的細(xì)胞免疫為主，Th1類細(xì)胞因子IL-2可刺激MHC Ⅱ類抗原的表達(dá)，并產(chǎn)生多種淋巴因子，還具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(CTL)、NK和淋巴因子激活殺傷(LAK)等多種殺傷性細(xì)胞的分化和效應(yīng)功能。

IL-2能增加NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性，并誘導(dǎo)其產(chǎn)生IFN-γ和腫瘤壞死因子(TNF)-α等細(xì)胞因子。IFN-γ低水平時抑制腫瘤的生長，高水平時促進(jìn)腫瘤的生長[3]。Inagaki等(2003年)對子宮內(nèi)膜息肉患者的宮腔灌洗液進(jìn)行細(xì)胞因子的檢測，并以正常宮腔灌洗液作為對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)灌洗液中的IL-1、IFN-γ的水平均比正常對照組高。蔡惠蘭等[4]采用ELISA法檢測子宮內(nèi)膜息肉患者宮腔鏡術(shù)前及術(shù)后放置左炔諾酮宮內(nèi)緩釋系統(tǒng)治療1年后，宮腔灌洗液中IFN-γ、IL-6等細(xì)胞因子的變化情況，發(fā)現(xiàn)術(shù)后放置左炔諾酮宮內(nèi)緩釋系統(tǒng)治療的患者宮腔灌洗液IFN-γ含量明顯降低，IL-6含量明顯增高，說明內(nèi)膜息肉與IFN-γ和IL-6水平失衡，即Th1/Th2漂移有關(guān)。

越來越多的證據(jù)表明，慢性炎癥增加癌癥的風(fēng)險，人類大約20%的癌癥由慢性炎癥發(fā)展而來[5]。例如結(jié)直腸癌被認(rèn)為是由長期存在的腸道炎癥發(fā)展而來。Hanada等(2006年)有研究在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)依賴于IFN-γ自發(fā)生長的結(jié)直腸腫瘤。Cicinelli等(2005年)的一項(xiàng)對25 000例宮腔鏡檢查標(biāo)本分析顯示，慢性子宮內(nèi)膜炎與40%～50%的子宮內(nèi)膜異常增生，尤其是子宮內(nèi)膜息肉有關(guān)。Th1/Th2平衡向Th1漂移時，體內(nèi)細(xì)胞因子的改變、促炎癥作用的發(fā)生，可能使得子宮內(nèi)膜異常增生，導(dǎo)致息肉的形成。

3.3 孕酮與Th1/Th2的關(guān)系

在妊娠期，Th1/Th2向Th2漂移可使母體對胚胎產(chǎn)生免疫耐受，從而維持正常妊娠狀態(tài)[6]。孕酮及孕酮誘導(dǎo)的封閉因子是促進(jìn)Th1/Th2向Th2漂移的機(jī)制之一[7]。子宮內(nèi)膜息肉摘除術(shù)后復(fù)發(fā)率為3.7%～10%[8]。臨床主要以孕激素類藥物抑制子宮內(nèi)膜息肉的復(fù)發(fā)，推測孕酮類藥物的使用促進(jìn)Th1/Th2向Th2方向偏移，從免疫機(jī)理上阻斷子宮內(nèi)膜息肉的生長。

本文中子宮內(nèi)膜息肉患者外周血Th1/Th2平衡狀態(tài)向Th1漂移，提示子宮內(nèi)膜息肉與Th1/Th2平衡狀態(tài)有一定相關(guān)性，為子宮內(nèi)膜息肉發(fā)生機(jī)理的研究提出了新的方向，為子宮內(nèi)膜息肉的治療提供了更充分的依據(jù)。但是Th1/Th2漂移在子宮內(nèi)膜息肉發(fā)生發(fā)展中的具體分子機(jī)理尚需更深入的探討。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：安瑞芳]

Correlation between Th1/Th2 balance and endometrial polyps

LI Hui, LI Xiao-hong, LU Yang, FAN Li-ping, LI Jin

(DepartmentofReproductiveMedicine,MaternityandChildCareHospitalofBaoanDistrictinShenzhen,BaoanDistrictMaternityandChildCareHospitalAffiliatedtoJinanUniversity,GuangdongShenzhen518133,China)

Objective To investigate the relationship between Th1/Th2 lymphocyte balance in peripheral blood and endometrial polyps. Methods There were 25 women with endometrial polyps and diagnosed by pathology (group A) accepting hysteroscopic curettage biopsy. Without abnormal change in gynecological ultrasound results, another 20 healthy women receiving pre-pregnancy check without abnormal ultrasonic results were selected (group B). Fasting venous blood was sampled from all cases during non-menstrual period, and in group A blood samples were colleted before hysteroscope operation. The distributions of Th0 cells (CD4+IFN-γ+IL-4+) and Th1 (CD4+IFN-γ+IL-4-)/Th2 (CD4+IFN-γ-IL-4+) were determined by 3-colored fluorescence labeled flow cytometry in two groups. Results The level of Th0 cells was not significantly different between two groups (P>0.05). The level of Th1 cells in group A was 33.33±8.68%, which was significantly higher than that in group B (22.35±3.88%) (t=5.658,P<0.05). The level of Th2 cells in group A was lower than that in group B (3.25±0.89%, 3.72±0.79%), but the difference was not significant (P>0.05). Compared with group B, Th1/Th2 ratio was obviously higher in group A (11.41±6.10, 6.24±1.69) (t=4.047,P<0.05).Conclusion There is a correlation between endometrial polyps and the balance of Th1/Th2, which provides new idea in studying the mechanism of endometrial polyps.

endometrial polyps；T helper cells；Th1/Th2 balance; flow cytometry

2015-01-19

深圳市寶安區(qū)科技計(jì)劃社會公益資助項(xiàng)目(編號2014080)

李 慧(1979-)，女，主治醫(yī)師，碩士，主要從事生殖醫(yī)學(xué)的研究。

李 瑾，主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.05.010

R711.74

A

1673-5293(2015)05-0938-03