微小RNA作為感染性疾病標(biāo)志物的研究進(jìn)展

劉 冰， 張智曉， 劉 鋼

·綜述·

微小RNA作為感染性疾病標(biāo)志物的研究進(jìn)展

劉 冰， 張智曉， 劉 鋼

微小RNA； 感染性疾??； 標(biāo)志物

哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)非編碼RNA主要有短小干擾RNA(short interfering RNA，siRNA)、微小RNA(microRNA，miRNA)、核仁內(nèi)小分子RNA(small nucleolar RNAs，snoRNA)等[1]。miRNA基因構(gòu)成約3%人類基因組，而人類miRNA總基因數(shù)目有數(shù)千，據(jù)估計(jì)，單個(gè)的miRNA可調(diào)控?cái)?shù)百到上千目標(biāo)基因，因此，人類基因約30%～92%可能是由miRNA調(diào)控[2]。

1993年, Lee等[3]首先在秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了長(zhǎng)度為22 nt的非編碼小RNA——lin-4, 同時(shí)發(fā)現(xiàn)lin-4 RNA在lin-14基因的3′UTR(非翻譯區(qū))內(nèi)存在著互補(bǔ)位點(diǎn)。進(jìn)一步研究表明, lin-4 RNA通過與lin-14基因的3′UTR特異性結(jié)合降低了LIN-14蛋白的表達(dá)水平, 但對(duì)lin-14基因的mRNA水平影響并不顯著,而lin-4 RNA便是現(xiàn)在所熟知的miRNA[4]。

miRNA是一類非編碼小RNA,在不同的真核生物之間高度保守。miRNA通常編碼于基因間，經(jīng)過精細(xì)的轉(zhuǎn)錄和加工而成，由RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生初級(jí)產(chǎn)物[5]。pri-miRNA在核酸酶Drosha和其輔助因子Pasha的作用下被處理成由70個(gè)核苷酸組成的pre-miRNA, 經(jīng)exportin 5等蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中,另一個(gè)核酸酶Dicer將其剪切成約22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的miRNA雙鏈, 其中一條為成熟的miRNA分子, 成熟的miRNA分子在細(xì)胞內(nèi)與Argonaute蛋白等形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC), 并作用于特異mRNA的3′UTR, 從而抑制翻譯過程或直接降解mRNA[6]。

1 miRNA 在感染性疾病發(fā)生中的可能機(jī)制

miRNA在病原體-宿主相互作用中調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答呈復(fù)雜性、雙向性。一方面，微生物編碼的miRNA參與調(diào)節(jié)微生物在宿主體內(nèi)的復(fù)制、存活，甚至損害宿主防御系統(tǒng)；另一方面，宿主合成自身miRNA，靶向作用于病原微生物毒力因子基因或者對(duì)病原微生物有關(guān)鍵作用的自身基因，以抑制病原微生物在體內(nèi)增殖，參與抗微生物免疫[7]。

1.1 miRNA與膿毒癥

膿毒癥是指由感染引起的全身炎性反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，膿毒癥的發(fā)生和發(fā)展與機(jī)體的免疫功能紊亂密切相關(guān)。因miRNA對(duì)機(jī)體免疫有特殊的調(diào)控作用，故在膿毒癥發(fā)病機(jī)制的研究中受到越來越多的關(guān)注。

早期診斷膿毒癥的標(biāo)志物包括C反應(yīng)蛋白、細(xì)胞因子(IL-l、IL-6、IL-10和TNFα)、趨化因子(IL-8、MPC-1和G-CSF)、降鈣素原等，特別是降鈣素原曾經(jīng)被認(rèn)為是膿毒癥的潛在標(biāo)志物[8]。但近來有文獻(xiàn)稱降鈣素原不能區(qū)分膿毒癥和非感染性的SIRS，因而不能作為診斷膿毒癥的特定指標(biāo)[9]。研究者對(duì)來自膿毒癥、SIRS和正常人的血清中miRNA(miR-132、miR-146a、miR-155、miR-223、miR-15b、miR-126、Let-7i)進(jìn)行分析，得出miR-146a和miR-223在膿毒癥組中有明顯的減少，受試者工作特征曲線(ROC)曲線下面積miR-146a、miR-223和IL-6各自為0.858、0.804和0.785，作為膿毒癥新的診斷標(biāo)志物，miR-146a和miR-223具有高特異度和高靈敏度[10]。

Vasilescu 等[11]首先對(duì)比了膿毒癥患者白細(xì)胞miRNA 表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)在所有膿毒癥患者中均出現(xiàn)變化的miRNA 有4 個(gè)，miR-150 和miR-342-5p下調(diào)，miR-182和miR-486上調(diào)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)血漿miR-150的含量與患者序貫性器官衰竭評(píng)分(SOFA) 分值呈負(fù)相關(guān)， 其中促炎因子TNFα 和抗炎因子IL-10、IL-18在膿毒癥患者的血漿中均顯著上升，其含量與miR-150 的血漿含量呈負(fù)相關(guān)，利用血漿IL-18 和miR-150 的比值，進(jìn)一步可以區(qū)分miR-150 含量不同的膿毒癥患者。

循環(huán)血液中miR-150、miR-146a和miR-223皆可作為膿毒癥患者的血清標(biāo)志物[12]。Wang等[13]研究證實(shí)，miR-146a可以作為區(qū)分膿毒癥和非膿毒癥的潛在標(biāo)志物，有望用于臨床膿毒癥診斷。Wang 等[14]經(jīng)過綜合研究發(fā)現(xiàn)， 血液中miR-146a和 miR-223 含量能有效地區(qū)分感染和非感染原因?qū)е碌哪摱景Y和SIRS患者，當(dāng)特異度為100%時(shí)，其靈敏度分別是63.3%和80%。

綜上所述，膿毒癥患者外周血中miR-146a、miR-223、miR-150和miR-342-5p含量減少，而miR-182和miR-486含量增加。

最近的研究表明，90%血清miRNA結(jié)合到蛋白質(zhì)復(fù)合物，如Ago2，RNA結(jié)合蛋白核磷蛋白1 (NPM1) 和高密度脂蛋白[15]。這項(xiàng)研究證實(shí)了實(shí)驗(yàn)性膿毒癥引起循環(huán)miRNA時(shí)間依賴性上調(diào)，這些miRNA有miR-16、miR-17、miR-20a、miR-20b、miR-26a、miR-26b、miR-106a、miR-106b、miR-195和miR-451。Wang等[16]的研究結(jié)論指出miR-16、miR-15a、miR-193b*和miR-483-5p與膿毒癥的診斷相關(guān)。血清中6種miRNA(miR-223、miR-15a、miR-16、miR-122、miR-193b*和miR-483-5p)編碼的蛋白質(zhì)為膿毒癥的標(biāo)志物，該蛋白對(duì)膿毒癥28 d病死率預(yù)測(cè)價(jià)值比SOFA和APACHE Ⅱ評(píng)分要高[17]。Roderburg等[18]的研究首次證實(shí)重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)患者的血清中miRNA測(cè)量值的預(yù)后價(jià)值。入院后的miR-150血清濃度與ICU膿毒癥等患者的生存和長(zhǎng)期生存均密切相關(guān)，低miR-150水平表示預(yù)后不良。

1.2 miRNA與結(jié)核

miRNA在機(jī)體抗感染免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。幽門螺桿菌(Helicobaherpylori，HP)、沙門菌(Salmonella)、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌(L．monocytogenes，LM)、分枝桿菌等幾種常見細(xì)菌感染免疫中，miRNA調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答機(jī)制研究也取得了重要進(jìn)展。

不同的miRNA，如miR-29a、miR-155、miR-155*、 miR-125b、 miR-3179a和miR-147可以是用于診斷結(jié)核的潛在生物標(biāo)志物，這些miRNA生物標(biāo)志物已被一部分獨(dú)立的科研團(tuán)隊(duì)所驗(yàn)證，但有待進(jìn)一步確證[19]。Wu等[20]研究也證實(shí)miR-155、miR-155*可能是潛在的結(jié)核診斷的標(biāo)志物。Wiwanitkit等[21]研究表明 miR-155、miR-155*是活動(dòng)性結(jié)核很好的診斷標(biāo)志物，并且miR-21在鏈霉素治療肺結(jié)核中起到了重要的作用。Zhang等[22]研究證實(shí)miR-378、miR-483-5p、miR-22、miR-29c、miR-101和miR-320b 6種血清miRNA的測(cè)定可以區(qū)分肺結(jié)核患者和健康人群。Qi等[23]研究提示 miR-361-5p、miR-889、miR-576-3p可作為快速診斷結(jié)核感染潛在的非侵襲性分子標(biāo)志物。Singh等[24]研究也提到miR-99B可能用于結(jié)核病的診斷和治療。Spinelli等[25]研究中結(jié)核病患者胸腔積液的單核細(xì)胞中miR-223、miR-421、miR-144*表達(dá)下調(diào)，外周血中單核細(xì)胞的miR-424升高。有研究表明 miR-29a表達(dá)在肺結(jié)核感染、發(fā)病過程中可能起到重要作用[26]，在抗結(jié)核感染中也起到了重要的作用[27]。Yi等[28]研究進(jìn)一步說明miR-29a在抗結(jié)核免疫反應(yīng)中起到負(fù)向調(diào)節(jié)作用。

綜合以上研究結(jié)果，miR-155、miR-155*作為結(jié)核診斷標(biāo)志物的研究較多，而且miR-29a可能在結(jié)核診斷和治療中起到重要的的作用。

1.3 miRNA與肝炎

肝臟中含有大量的miR-122，Bihrer等[29]從患有慢性丙型肝炎的患者和正常人中分別抽取血清進(jìn)行miR-122檢查，同時(shí)對(duì)患者組進(jìn)行肝臟組織學(xué)檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢性丙型肝炎患者血清中miR-122水平明顯高于正常對(duì)照組，并且miR-122水平與肝臟炎性反應(yīng)程度指標(biāo)具有相關(guān)性。因此，血清miR-122可作為慢性丙型肝炎壞死性炎性反應(yīng)的生物標(biāo)志物。還有研究小組研究了乙型肝炎患者以及乙肝病毒標(biāo)志陽(yáng)性的肝癌患者血清中miRNA。Li等[30]選取正常對(duì)照組210例，乙型肝炎患者135例，丙型肝炎患者48例，乙型肝炎病毒標(biāo)志陽(yáng)性的肝癌患者120例，使用 Solexa測(cè)序及實(shí)時(shí)定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)驗(yàn)證分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)16種有明顯差異的miRNA，其中13種血清miRNA(miR-375、miR-92a、miR-10a、miR-223、miR-423、miR-23b、miR-23a、miR-342-3p miR-99a、miR-122a、miR-125b、miR-150、let-7c)可以作為乙型肝炎的生物標(biāo)志物，3種可以作為乙型肝炎病毒標(biāo)志陽(yáng)性肝癌標(biāo)志物的miRNA(miR-375、miR-25、let-7f)。

1.4 miRNA與神經(jīng)系統(tǒng)感染

病毒性腦炎是世界各地常見的腦部病毒感染，并且可由多種病毒引起，如蟲媒病毒、皰疹病毒，甚至艾滋病病毒。其中，1型單純皰疹病毒(HSV-1)具有嗜神經(jīng)性，能引起感染并且終身潛伏在神經(jīng)組織。與阿爾茨海默病類似，HSV-1感染與炎性反應(yīng)信號(hào)顯著上調(diào)相關(guān)，其中花生四烯酸的一個(gè)特定成員的表達(dá)增加已有報(bào)道。有研究也報(bào)道了在宿主的免疫調(diào)控和炎性反應(yīng)中miR-146a的作用[31]。Provost[32]研究顯示miR-342-3p可能成為動(dòng)物和人類朊蛋白病的新型標(biāo)志物。

2 檢測(cè)方法

miRNA檢測(cè)方法大體可以歸為2類：一類是不需要樣本擴(kuò)增的探針直接雜交法；另一類是基于樣本的miRNA擴(kuò)增法[33]。

檢測(cè)循環(huán)miRNA的方法主要有：高通量測(cè)序法、miRNA芯片法、Northern blot 法、qRT-PCR 法。新一代的測(cè)序技術(shù)在序列未知的情況下可以對(duì)miRNA進(jìn)行分析，在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)和鑒定新的miRNA分子，但測(cè)序法價(jià)格昂貴，不適合普通實(shí)驗(yàn)室開展。miRNA芯片是通過對(duì)樣本中已知miRNA序列進(jìn)行的研究，得出特定的表達(dá)譜，但很難區(qū)分前體miRNA和成熟miRNA，所以芯片結(jié)果需要用qRT-PCR 進(jìn)行確認(rèn)。Northern blot 法步驟煩瑣，需要較多的樣本且靈敏度較低，不適合大批量臨床樣本檢測(cè)。qRT-PCR 是研究miRNA最常用的方法，可以對(duì)循環(huán)miRNA定性或者定量檢測(cè)，此法操作簡(jiǎn)便、快速，且具有較高的靈敏度和特異度[34]。

3 應(yīng)用前景

大量的研究表明，miRNA控制一些重要的病理生理過程，如細(xì)胞增殖、黏附、凋亡和血管生成。miRNA深度測(cè)序的最新發(fā)展已經(jīng)改變了miRNA的身份，特別是那些有潛在診斷或預(yù)后價(jià)值的miRNA[35]。

病毒利用miRNA調(diào)節(jié)自身和宿主細(xì)胞的基因表達(dá)，因此利用反義寡核苷酸對(duì)抗病毒miRNA或宿主細(xì)胞miRNA，可以作為抗病毒的治療策略。miRNA干擾途徑可以通過合成與pri-miRNA、pre-miRNA或成熟miRNA分子完全互補(bǔ)的抗miRNA反義寡核苷酸(anti-miRNA oligonucleotides, AMO)分子來實(shí)現(xiàn)。目前最有效的AMO為與成熟miRNA分子完全互補(bǔ)的AMO分子[36]。Iannaccone等[37]研究表明抗miRNA物質(zhì)和miRNA類似物對(duì)感染、炎性反應(yīng)和惡性疾病中異常miRNA的調(diào)節(jié)有望成為相應(yīng)疾病有效的治療措施。

miRNA介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)是治療病毒感染性疾病的一個(gè)很有發(fā)展?jié)摿Φ氖侄?。但是miRNA作為基因治療方法要應(yīng)用于臨床治療，仍有很多技術(shù)問題需要解決。例如一些miRNA的識(shí)別靶點(diǎn)因其二級(jí)結(jié)構(gòu)或高度褶疊而被遮蓋，一些mRNA與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物而隱藏了其miRNA序列的識(shí)別位點(diǎn)，還有如何準(zhǔn)確地將miRNA投送入感染細(xì)胞中等[38]。

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Research update of microRNA as a marker of infectious diseases

LIU Bing, ZHANG Zhixiao, LIU Gang

. (Department of Infectious Diseases, Children′s Hospital, Capital Medical University, Beijing 100045, China)

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院感染科，北京 100045。

劉冰(1991—)，男，首都醫(yī)科大學(xué)2009級(jí)七年制臨床醫(yī)學(xué)(兒科方向)學(xué)生。

劉鋼，E-mail：liugang10@hotmail.com。

R51

A

1009-7708(2015)04-0391-04

2014-07-23

2014-09-22