氯胺酮復(fù)合丙泊酚對(duì)大鼠抑郁改善作用及對(duì)STAT3信號(hào)通路表達(dá)的影響*

孫媛，王莉，王欣，毛瑞芬

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院麻醉科，石家莊 050031)

大腦處理情感的關(guān)鍵部位為邊緣系統(tǒng)，其主要構(gòu)成部分為杏仁核，杏仁核參與了機(jī)體情緒和行為的調(diào)節(jié)，為抑郁癥患者發(fā)病主要腦區(qū)[1-2]。研究顯示，抑郁癥患者杏仁核內(nèi)部分細(xì)胞因子發(fā)生過(guò)量表達(dá)，造成炎癥反應(yīng)信號(hào)路徑活化[3]。Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(the Janus kinase/signal transducer and activator of transcriptions，JAK/STAT)信號(hào)路徑為主要炎癥細(xì)胞因子將胞內(nèi)信號(hào)激活的轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑。大量研究顯示，JAK/STAT信號(hào)路徑可參與抑郁癥神經(jīng)細(xì)胞分化、增殖、凋亡核神經(jīng)突觸可塑性等病理進(jìn)程[4-5]。丙泊酚有抗驚厥作用，氯胺酮是N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受體拮抗藥，被廣泛用于危重患者和小兒麻醉手術(shù)。研究顯示，氯胺酮不僅有麻醉作用，還有快速抗抑郁作用，對(duì)難治性抑郁具有一定療效[6]。CHEN等[7]研究顯示，鏈脲佐菌素所致糖尿病的大鼠較正常大鼠抑郁表征明顯。筆者在本研究考察氯胺酮復(fù)合丙泊酚麻醉對(duì)鏈脲佐菌素所致大鼠抑郁癥狀的改善作用及對(duì)STAT3信號(hào)通路表達(dá)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)Wistar雄性大鼠，6周齡，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(川)2018-33，體質(zhì)量80～120 g，平均(108.17±6.37) g。常規(guī)飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)，大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠5只，室溫22～26 ℃，相對(duì)濕度55%～65%，晝夜循環(huán)，保持光照12 h，大鼠灌胃、添加飼料及換水等由專人負(fù)責(zé)。

1.2試藥與儀器 鏈脲佐菌素(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：050814)，白細(xì)胞介素-6(IL-6)、IL-1β及糖蛋白130(glycoprotein 130,gp130)試劑盒(購(gòu)自武漢華美生物公司，批號(hào)分別為1903052，1812006，1901007)，氯胺酮(福建古田制藥廠，批號(hào)：181213)，丙泊酚(意大利AstraZeneca公司，批號(hào)：A1890)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒(杭州聯(lián)科生物公司，批號(hào)：181014)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子-3(total-STAT3)、Janus激活酶2(total-Jak2)試劑盒(武漢優(yōu)爾生科技公司，批號(hào)分別為1901139，1902221)。

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(型號(hào)：DHG-9023A)、數(shù)字顯示隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)：PYX-DHS)、漩渦混合器(型號(hào)：XW-80A)、離心機(jī)(型號(hào)：TGL-168)由美國(guó)KIMBLE公司生產(chǎn)；全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)(型號(hào)：TSJ-Ⅱ)由常州中威電子儀器廠生產(chǎn)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、氟西汀組及麻醉組，每組15只。麻醉組、模型對(duì)照組及氟西汀組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素60 mg·kg-1。藥物導(dǎo)致糖尿病，進(jìn)而產(chǎn)生抑郁。28 d后麻醉組大鼠腹腔注射氯胺酮(10 mg·kg-1)和丙泊酚(80 mg·kg-1)，氟西汀組灌胃氟西汀溶液0.2 mg·(100 g)-1，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組腹腔注射等劑量0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)7 d。

1.4觀察指標(biāo) ①曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，給藥后1 d所有大鼠置于操作間，光線適度，環(huán)境安靜。待測(cè)前將大鼠分別置于新鼠籠，適應(yīng)5 min，再將大鼠置于曠場(chǎng)箱中央方格，大鼠頭部方向一致，記錄5 min，再將大鼠取出，曠場(chǎng)箱采用清水與75%乙醇清洗后檢測(cè)第2只大鼠，記錄大鼠直立次數(shù)、穿格數(shù)和修飾次數(shù)。

②曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)后將大鼠斷頸處死，選取前額皮質(zhì)，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法檢測(cè)IL-6與IL-1β含量。

③Western blotting法檢測(cè)大鼠前額皮質(zhì)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)蛋白表達(dá)，選取坐骨神經(jīng)組織，研磨，經(jīng)組織裂解后上樣電泳，起始電壓80 V，溴酚藍(lán)染料前緣進(jìn)入到分離膠上緣后電壓提升到100 V，溴酚藍(lán)泳出分離膠下緣后電泳結(jié)束。半干電轉(zhuǎn)移儀于聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜內(nèi)行蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移，恒流30 mA，連續(xù)90 min。PVDF膜取出后采用5%TBST緩沖液(TBST Buffer)脫脂奶粉封閉，震蕩60 min。結(jié)束封閉后采用TBST漂洗液洗膜10 min，3次，膜轉(zhuǎn)移到雜交袋內(nèi)，加入適量漂洗液稀釋抗體，封口后4 ℃下孵育過(guò)夜；TBST漂洗液洗膜10 min，3次，再加入漂洗液稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，震蕩60 min。PVDF膜放置在電化學(xué)發(fā)光(electrochemi luminescence，ECL)顯色液內(nèi)震蕩溫育5 min，暗室下曝光、顯影及定影。清水沖洗，晾干掃描，Image-Pro Plus(IPP)軟件對(duì)掃描圖像目的條帶行灰度分析。

④選取杏仁核組織，ELISA法檢測(cè)total-STAT3、TNF-α、total-Jak2及gp130含量，試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品稀釋后加至酶標(biāo)板標(biāo)準(zhǔn)品孔，大鼠杏仁核組織研磨后的上清液樣品加入樣品孔，每孔10 μL，膠紙將反應(yīng)孔封住，37 ℃下孵育2 h，洗板5次，再加入生物素化抗體工作液10 μL，37 ℃下孵育1 h，洗板5次，加入酶結(jié)合物工作液10 μL，37 ℃下避光孵育30 min，洗板5次，每孔加入顯色液10 μL，37 ℃下避光孵育20 min，最后加入終止液，混勻后檢測(cè)吸光度(A450)值，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以A值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)樣品A值于標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)查看其濃度。

2 結(jié)果

2.1曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見表1。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠直立次數(shù)、穿格數(shù)和修飾次數(shù)減少；與模型對(duì)照組比較，氟西汀組、麻醉組大鼠直立次數(shù)、穿格數(shù)和修飾次數(shù)增加，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 4組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中直立次數(shù)、穿格數(shù)和修飾次數(shù)比較

組別直立次數(shù)穿格個(gè)數(shù)修飾次數(shù)正常對(duì)照組8.02±2.1956.30±10.757.16±1.83模型對(duì)照組3.99±2.05①14.93±10.28①1.45±1.69①氟西汀組10.10±2.21②54.20±10.18②6.83±1.58②麻醉組9.26±2.18②52.17±10.46②6.40±1.76②

①與正常對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，P<0.05。

①Compared with normal control group，P<0.05；②Compared with model control group，P<0.05.

2.2前額皮質(zhì)IL-6與IL-1β含量 見表2。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組前額皮質(zhì)IL-6與IL-1β含量升高；與模型對(duì)照組比較，氟西汀組、麻醉組大鼠前額皮質(zhì)IL-6與IL-1β含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3前額皮質(zhì)BDNF表達(dá)情況 正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、氟西汀組及麻醉組前額皮質(zhì)BDNF表達(dá)分別為(100.00±0.00)%、(61.07±3.29)%、(86.31±3.15)%及(84.19±3.26)%。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組前額皮質(zhì)內(nèi)BDNF表達(dá)降低；與模型對(duì)照組比較，氟西汀組、麻醉組大鼠前額皮質(zhì)內(nèi)BDNF表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4杏仁核total-STAT3、TNF-α、total-Jak2及gp130含量 見表3。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組total-STAT3、TNF-α及gp130含量升高；與模型對(duì)照組比較，氟西汀組、麻醉組total-STAT3、TNF-α及gp130含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 4組大鼠前額皮質(zhì)內(nèi)IL-6與IL-1β含量比較

組別IL-6IL-1β正常對(duì)照組60.03±6.1559.27±4.10模型對(duì)照組81.37±6.30①80.25±4.17①氟西汀組61.82±6.26②62.15±4.20②麻醉組63.25±6.31②64.26±4.39②

①與正常對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，P<0.05。

①Compared with normal control group，P<0.05；②Compared with model control group，P<0.05.

表3 4組大鼠杏仁核total-STAT3、TNF-α、total-Jak2及gp130含量比較

組別total-STAT3/(ng·mL-1)TNF-α/(pg·mL-1)正常對(duì)照組2.83±1.01133.52±16.81模型對(duì)照組6.19±1.36①239.08±16.37①氟西汀組3.10±1.25②176.81±16.29②麻醉組3.58±1.07②186.62±16.40②組別total-Jak2gp130(ng·mL-1)正常對(duì)照組1.01±0.6827.18±4.08模型對(duì)照組1.64±0.70116.03±4.36①氟西汀組1.21±0.69②64.39±4.21②麻醉組1.25±0.7168.05±4.72②

①與正常對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，P<0.05。

①Compared with normal control group，P<0.05；②Compared with model control group，P<0.05.

3 討論

CHEN等[7]研究發(fā)現(xiàn)，鏈脲佐菌素所致糖尿病大鼠較正常大鼠抑郁表現(xiàn)明顯。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠直立次數(shù)、穿格數(shù)和修飾次數(shù)減少；與模型對(duì)照組比較，麻醉組大鼠直立次數(shù)、穿格數(shù)和修飾次數(shù)增加，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示鏈脲佐菌素致大鼠糖尿病能構(gòu)建抑郁模型。

糖尿病為臨床常見病，相關(guān)流行病學(xué)研究顯示，世界范圍內(nèi)5%～7%人罹患糖尿病[8]。當(dāng)前，糖尿病所致認(rèn)知功能受損、抑郁等腦功能障礙逐漸受到關(guān)注。WAYHS等[9]研究顯示，糖尿病所致抑郁模型動(dòng)物海馬組織的氧化應(yīng)激指標(biāo)水平顯著增高。此外有研究顯示，羅格列酮為臨床常用增強(qiáng)胰島素敏感、治療胰島素抵抗類藥物，可治療糖尿病所致抑郁[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病模型大鼠前額皮質(zhì)IL-6、IL-1β表達(dá)明顯升高，可能與激活炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激有關(guān)。丙泊酚有抗驚厥作用，氯胺酮具有確切抗抑郁作用，本研究結(jié)果顯示，經(jīng)氯胺酮和丙泊酚干預(yù)后，大鼠前額皮質(zhì)IL-6與IL-1β含量降低，與相關(guān)研究結(jié)果一致[11]。此外，筆者在本研究對(duì)氯胺酮與丙泊酚對(duì)糖尿病大鼠抑郁癥狀、相關(guān)因子表達(dá)改變進(jìn)行分析。NIBUYA等[12]研究顯示，急慢性應(yīng)激反應(yīng)均可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)BDNF表達(dá)降低，同時(shí)抗抑郁藥物能夠?qū)DNF降低起干預(yù)作用。本研究結(jié)果顯示，氯胺酮聯(lián)合丙泊酚的抗抑郁作用也可能與前額皮質(zhì)BDNF升高有關(guān)。

正常生理情況下，中樞神經(jīng)TNF-α能夠?qū)λ?、學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)元突觸可塑性等進(jìn)行調(diào)節(jié)，病理狀況下，中樞膠質(zhì)細(xì)胞尤其為小膠質(zhì)細(xì)胞可分泌大量TNF-α，參加發(fā)生中樞精神障礙性疾病[13-14]。TNF-α參加精神障礙性疾病機(jī)制有以下幾個(gè)因素，一為TNF-α可將相關(guān)信號(hào)路徑激活，造成神經(jīng)元變性或凋亡，如p38 MAPK、NF-κB、Jnk、ERK等通路；二為導(dǎo)致神經(jīng)突觸抑制性與興奮性比例不平衡。但JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑不但為主要跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑，也是激活機(jī)體炎性細(xì)胞因子最關(guān)鍵路徑。研究表明，TNF-α能借助細(xì)胞膜表層gp130蛋白激活JAK/STAT信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)[15]。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組total-STAT3、TNF-α及gp130含量升高；與模型對(duì)照組比較，麻醉組大鼠total-STAT3、TNF-α及gp130含量降低，提示氯胺酮聯(lián)合丙泊酚可降低JAK/STAT信號(hào)通路內(nèi)STAT3蛋白表達(dá)，抑制TNF-α過(guò)表達(dá)，改善大鼠抑郁癥狀。

綜上所述，氯胺酮復(fù)合丙泊酚麻醉可顯著改善鏈脲佐菌素所致大鼠抑郁，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)JAK/STAT信號(hào)路徑、降低炎癥細(xì)胞因子含量有關(guān)。本研究?jī)H檢測(cè)了大鼠STAT3與JAK2蛋白含量改變情況，未檢測(cè)磷酸化STAT3與JAK2蛋白，一定程度難以反映STAT3與JAK2蛋白活化情況。今后還需對(duì)此模型磷酸化STAT3與JAK2蛋白進(jìn)行探究。