生長(zhǎng)分化因子9對(duì)卵巢功能的影響和調(diào)控

張印峰，王會(huì)妍，張?jiān)粕?/p>

卵泡是卵巢的主要組成部分，其形成、發(fā)育和功能是影響卵巢功能的關(guān)鍵因素之一。哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞在卵泡中的發(fā)育過(guò)程涉及一系列細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，其中卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞之間的雙向通訊是一個(gè)重要的組成部分，包括營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及信號(hào)的交換，在卵泡形成的整個(gè)階段，通過(guò)神經(jīng)-內(nèi)分泌以及旁分泌/自分泌因子組成的復(fù)雜調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)協(xié)同作用，卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞之間實(shí)現(xiàn)同步化通訊，協(xié)調(diào)生長(zhǎng)分化。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor beta，TGF-β）超家族是哺乳動(dòng)物中最大的蛋白分泌者家族，其成員包括TGF-β、抗苗勒管激素（AMH）、激活素、抑制素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）和生長(zhǎng)分化因子（growth differentiation factor，GDFs）等，這些蛋白以前肽前體形態(tài)合成，而后作為同源二聚體或異源二聚體被進(jìn)一步加工和分泌。近年來(lái)，作為卵母細(xì)胞源性的蛋白家族成員，GDF-9和BMP-15（又稱GDF-9B）的生物和生理特性受到了廣泛的研究，在多種哺乳動(dòng)物中均發(fā)現(xiàn)這兩種因子可在卵泡發(fā)育階段調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞及卵泡膜細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和功能，并在卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟中發(fā)揮關(guān)鍵作用，從而影響卵巢功能，是哺乳動(dòng)物生殖系統(tǒng)中重要的影響因子。

1 GDF-9的發(fā)現(xiàn)及一般概述

早在1993年，GDF-9作為TGF-β超家族的新成員被發(fā)現(xiàn)，McPherron等[1]以已知TGF-β家族成員保守序列為模板，設(shè)計(jì)寡核苷酸引物克隆cDNA而獲得的，人GDF-9基因定位于5q31.1染色體上，包含2個(gè)外顯子，長(zhǎng)度分別為397 bp和968 bp及1個(gè)1.6 kb內(nèi)含子。有研究發(fā)現(xiàn)GDF-9蛋白的mRNA在雌鼠卵母細(xì)胞卵泡形成過(guò)程中均有表達(dá)，在始基卵泡中低表達(dá)或無(wú)表達(dá)，在發(fā)育卵泡的所有階段中強(qiáng)表達(dá)，在排卵的卵母細(xì)胞中亦有表達(dá)[2]。Ahmad等[3-4]的研究發(fā)現(xiàn)，在多種哺乳動(dòng)物的進(jìn)化演變過(guò)程中，與TGF-β家族其他成員相比，GDF-9基因表現(xiàn)出極大的變異和迅速的演變。該研究對(duì)32種哺乳動(dòng)物進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析，結(jié)果顯示人科分支中GDF-9基因核苷酸序列的多個(gè)密碼子位點(diǎn)受到了陽(yáng)性選擇，其中如丙氨酸、精氨酸、賴氨酸等對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)具有重要作用，這也提示了GDF-9蛋白的重要性和特殊功能，及其在哺乳動(dòng)物生殖中的重要意義。

2 GDF-9的信號(hào)通路

GDF-9特異性結(jié)合于跨膜絲氨酸-蘇氨酸激酶受體ALK5[5]及BMPRⅡ[6]，當(dāng)與GDF-9結(jié)合時(shí)，這兩型受體形成異源二聚體復(fù)合物，Ⅱ型受體（BMPRⅡ）激活Ⅰ型受體（ALK5和ALK6）。Ⅰ型受體一旦被激活，可使受特異性受體調(diào)控的SMAD蛋白（RSMAD）磷酸化，通過(guò)與普通SMAD（Co-SMAD或SMAD4）相互作用傳導(dǎo)信號(hào)入核，隨后這種SMAD復(fù)合體轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)與特異性轉(zhuǎn)錄因子相互作用以調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，引發(fā)相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。這個(gè)過(guò)程受Ⅰ型受體以及Smad2、Smad3蛋白的共同調(diào)控。

3 GDF-9在卵泡發(fā)育中的作用

早期針對(duì)卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞之間雙向溝通的研究多集中在顆粒細(xì)胞及卵丘細(xì)胞對(duì)卵母細(xì)胞的調(diào)節(jié)和營(yíng)養(yǎng)作用，而最近有更多的研究證實(shí)，卵母細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生可溶性因子影響顆粒細(xì)胞的增殖、分化及功能并發(fā)揮關(guān)鍵作用。20世紀(jì)70年代研究顯示，去除卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞會(huì)破壞卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程，使格拉夫卵泡自發(fā)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)黃體[7]，而近20年研究發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞可通過(guò)分泌卵母細(xì)胞源性因子調(diào)節(jié)卵泡的生長(zhǎng)分化及決定自身命運(yùn)，包括GDF-9、BMP-15等在內(nèi)的卵母細(xì)胞分泌因子（oocyte secreted factors,OSFs）在卵泡發(fā)育過(guò)程中的各個(gè)方面發(fā)揮重要作用，例如調(diào)節(jié)促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)，控制卵巢功能相關(guān)因子的產(chǎn)生，有助于調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞代謝和凋亡。

3.1 GDF-9參與調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育、卵丘擴(kuò)張 GDF-9參與了初級(jí)卵泡向次級(jí)卵泡轉(zhuǎn)化階段的發(fā)育過(guò)程。Diaz等[8]在小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，GDF-9參與調(diào)節(jié)小鼠顆粒細(xì)胞的分化，特別是竇前顆粒細(xì)胞向卵丘細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。卵丘擴(kuò)張的過(guò)程表現(xiàn)為卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）中產(chǎn)生富含透明質(zhì)酸的細(xì)胞外基質(zhì)，透明質(zhì)酸是COCs細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，是透明質(zhì)酸合酶2（HAS2）的下游產(chǎn)物，其表達(dá)受黃體生成激素（LH）水平升高影響而下調(diào)。目前研究發(fā)現(xiàn)包括GDF-9在內(nèi)的卵母細(xì)胞源性因子通過(guò)內(nèi)分泌、旁分泌機(jī)制來(lái)調(diào)控卵丘擴(kuò)張的過(guò)程[9]。

3.2 GDF-9參與調(diào)節(jié)相關(guān)功能蛋白、因子的產(chǎn)生GDF-9可與BMP-15協(xié)同作用調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞中某些蛋白的表達(dá)，包括抑制素、LH受體、酪氨酸激酶受體（Kit）配體（KITL）等。KITL在卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育中至關(guān)重要，其表達(dá)水平受旁分泌因子和內(nèi)分泌激素水平控制，已證實(shí)GDF-9抑制顆粒細(xì)胞中KITL的表達(dá)[10]。GDF-9除了可以促進(jìn)顆粒細(xì)胞的有絲分裂外，在調(diào)節(jié)激素[如卵泡刺激素（FSH）、胰島素-Ⅰ和雄激素等]水平方面亦發(fā)揮作用[10]。另外還發(fā)現(xiàn)GDF-9可促進(jìn)影響排卵的重要因子前列腺素E2（PGE2）的生成[11]。

3.3 GDF-9參與調(diào)控生殖系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá) 學(xué)者們認(rèn)為GDF-9與卵丘擴(kuò)張相關(guān)基因HAS2和PTX3的上調(diào)有關(guān)[12]，可促進(jìn)HAS2表達(dá)、透明質(zhì)酸合成，從而參與調(diào)節(jié)卵丘細(xì)胞表型、促進(jìn)卵丘擴(kuò)張。Li等[13]發(fā)現(xiàn)在雞的卵泡中，GDF-9可通過(guò)促進(jìn)FSH受體及StAR基因的表達(dá)發(fā)揮其調(diào)節(jié)孕酮的作用，表明GDF-9還參與了與排卵和黃素化有關(guān)的靶基因的調(diào)控。目前已基本確定卵巢衍生的TGF-β超家族成員在抑制顆粒細(xì)胞產(chǎn)生孕激素及隨后的黃素化中發(fā)揮不可或缺的作用，是卵巢功能重要的調(diào)節(jié)因子。

3.4 GDF-9參與調(diào)控卵巢細(xì)胞代謝、凋亡 GDF-9與調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的糖酵解和膽固醇合成有關(guān)，這是丙酮酸、乳酸和膽固醇生物合成途徑中的產(chǎn)物經(jīng)間隙連接滋養(yǎng)卵母細(xì)胞的必要過(guò)程[14]。另外，研究發(fā)現(xiàn)GDF-9等卵母細(xì)胞源性因子對(duì)促進(jìn)顆粒細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)及抑制顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞中的促凋亡蛋白Bax的表達(dá)也有保護(hù)作用[15]。學(xué)者們將卵母細(xì)胞從COCs中移除后發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞的凋亡水平增加，而將卵母細(xì)胞加回顆粒細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境后，這種情況被逆轉(zhuǎn)，表明GDF-9在防止顆粒細(xì)胞凋亡中起重要作用。Li等[13]的研究還發(fā)現(xiàn)GDF-9可促進(jìn)顆粒細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，調(diào)節(jié)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，加強(qiáng)DNA復(fù)制并抑制凋亡。

4 GDF-9在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程的作用

卵母細(xì)胞的核質(zhì)成熟過(guò)程驅(qū)動(dòng)其本身減數(shù)分裂、受精并支持胚胎形成的早期胚胎發(fā)育能力，而存在于卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞之間的雙向通訊對(duì)卵母細(xì)胞的核質(zhì)成熟過(guò)程是必需的[16]。研究證明，卵母細(xì)胞產(chǎn)生的GDF-9等因子可誘導(dǎo)卵丘細(xì)胞中正向調(diào)節(jié)因子的產(chǎn)生，反過(guò)來(lái)作用于其本身。

有研究分別在牛[17]、小鼠[18]、山羊[19]和豬[20]中證實(shí)，在體外培養(yǎng)成熟（IVM）過(guò)程使用重組GDF-9或去顆粒細(xì)胞裸卵處理COCs可使個(gè)體的囊胚形成率和產(chǎn)仔量增加，這意味著與體內(nèi)成熟的COCs相比，體外成熟的卵母細(xì)胞也許不能分泌支持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、成熟的因子，此類受損的卵母細(xì)胞重新經(jīng)卵巢源性因子處理后，可恢復(fù)良好的發(fā)育能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，GDF-9及其與BMP-15協(xié)同在提高卵母細(xì)胞減數(shù)分裂能力中的作用也許與促進(jìn)卵母細(xì)胞中更好的核質(zhì)成熟、防止透明帶硬化、正確的受精模式和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶高表達(dá)有關(guān)[21]。Monte等[22]在體外培養(yǎng)綿羊的次級(jí)卵泡中發(fā)現(xiàn)，外源性補(bǔ)充GDF-9可促進(jìn)卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)、增強(qiáng)線粒體功能及減數(shù)分裂恢復(fù)能力。Garcia等[23]將雌性狗的卵母細(xì)胞作為研究對(duì)象，也發(fā)現(xiàn)GDF-9對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育成熟有促進(jìn)作用。

5 GDF-9與女性生殖內(nèi)分泌功能的臨床聯(lián)系

通過(guò)上述兩方面作用，GDF-9作為人類女性生殖功能調(diào)節(jié)因子之一，對(duì)顆粒細(xì)胞分化、卵泡形成及卵母細(xì)胞發(fā)育成熟等具有重要意義。GDF-9的異常表達(dá)可能與女性生殖內(nèi)分泌失調(diào)，及隨之引發(fā)的不孕存在一定的聯(lián)系。

卵巢功能關(guān)鍵基因的變異與多囊卵巢綜合征（PCOS）發(fā)生有關(guān)。有研究在PCOS患者中發(fā)現(xiàn)了GDF-9基 因 的 非 同 義 突 變（N5L，L40V，M45V，D57Y，R146C，Y342F，S425R，S428T），GDF-9的缺陷可能減少顆粒細(xì)胞凋亡率和減慢顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)率，從而增加異常發(fā)育卵泡的數(shù)量，但PCOS患者與正常女性的突變率比較并無(wú)顯著差異[24]。Kim等[25]在小鼠中的研究發(fā)現(xiàn)慢性雄激素刺激可通過(guò)下調(diào)GDF-9而誘導(dǎo)竇卵泡生長(zhǎng)停滯及PCOS相關(guān)表型。但關(guān)于GDF-9表達(dá)異常對(duì)PCOS致病的作用及具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

早發(fā)性卵巢功能不全（POI）是一種嚴(yán)重影響女性生殖健康的卵巢功能障礙性疾病，有著多種復(fù)雜的致病因素，其中遺傳因素在POI的發(fā)生中至關(guān)重要，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)GDF-9基因變異在POI表型中發(fā)生率升高[26]。在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，GDF-9基因的K67E、P103S和S428T變異會(huì)引起GDF-9前蛋白錯(cuò)誤折疊，導(dǎo)致成熟蛋白顯著減少甚至幾乎消失[27]。2017年一項(xiàng)中國(guó)POI患者全外顯子組測(cè)序的最新研究顯示，NOBOX基因一個(gè)新的純合截?cái)嘧儺悋?yán)重破壞了GDF-9基因的轉(zhuǎn)錄活性，可能通過(guò)降低GDF-9表達(dá)而導(dǎo)致POI發(fā)生[28]。還有研究報(bào)道POI患者中存在一些BMP-15基因的突變，此類突變會(huì)降低BMP-15與GDF-9之間的協(xié)同作用，引起POI[29]。除GDF-9本身的表達(dá)異常之外，其結(jié)合受體的異常表達(dá)也可間接地影響卵巢功能，研究顯示，人顆粒細(xì)胞中ALK6的失調(diào)與卵巢儲(chǔ)備功能下降和與年齡相關(guān)的生育力衰退有關(guān)[30]。

6 GDF-9與BMP-15的協(xié)同作用

GDF-9和BMP-15具有高度的氨基酸同源性和相似的蛋白結(jié)構(gòu)。這兩種因子都與卵巢的表達(dá)模式和功能密切相關(guān)，并相互協(xié)同作用。越來(lái)越多的證據(jù)表明GDF-9和BMP-15之間存在協(xié)同關(guān)系，形成GDF-9/BMP-15異源二聚體，作為有效調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞功能和提高卵母細(xì)胞質(zhì)量的因子發(fā)揮作用[31]。

GDF-9和BMP-15分別與顆粒細(xì)胞中相應(yīng)的受體結(jié)合，導(dǎo)致下游基因發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，通過(guò)miRNA-375發(fā)揮作用，影響Ⅰ型受體ALK4和Ⅱ型受體BMPRⅡ的表達(dá)水平以及SMAD信號(hào)通路的激活，進(jìn)而影響卵丘細(xì)胞的增殖、擴(kuò)張和凋亡[32]。Hobeika等[33]在人顆粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，GDF-9及BMP-15的聯(lián)合應(yīng)用可通過(guò)SMAD2/3及SMAD3信號(hào)通路有效地增強(qiáng)FSH刺激芳香化酶CYP19A1啟動(dòng)子活性的效應(yīng)，提高CYP19A1的mRNA及蛋白水平，從而提高人顆粒細(xì)胞雌激素的生成。

7 結(jié)語(yǔ)

卵巢卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞及其周圍顆粒細(xì)胞之間存在著復(fù)雜的細(xì)胞對(duì)話、通訊及相互作用的聯(lián)系網(wǎng)絡(luò)，卵母細(xì)胞源性因子組成的BMP/GDF系統(tǒng)調(diào)節(jié)控制著顆粒細(xì)胞的分化和功能、細(xì)胞間通訊、類固醇激素生成、COCs形成及擴(kuò)張、卵母細(xì)胞質(zhì)量和發(fā)育成熟能力、排卵以及黃素化。GDF-9作為其中的一個(gè)重要成員，發(fā)揮著不可或缺的作用。了解GDF-9作用的生物、生理學(xué)基礎(chǔ)及相關(guān)影響因素，對(duì)于深入了解卵巢結(jié)構(gòu)、功能，為一些生殖內(nèi)分泌疾病所致不孕的女性患者制定最佳的臨床輔助生殖技術(shù)治療具有十分重要的意義，如使用藥物調(diào)節(jié)GDF-9相關(guān)信號(hào)通路中的蛋白表達(dá)或在卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)體系中加入GDF-9也許會(huì)為輔助生殖方面的治療提供新的方法。