半滑舌鰨腸黏液非特異免疫相關(guān)酶對黃芪多糖的免疫應(yīng)答

■ 劉金海 陳 恒 羅小麗 管 健 黃 輝

（1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建廈門 361021；2.集美大學(xué)水生生物技術(shù)研究所，福建廈門 361021；3.農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點實驗室，福建廈門 361021）

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）屬鰈形目舌鰨科舌鰨屬，俗稱“龍脷”、牛舌頭、鰨目、鰨板、鰙鰨、細(xì)鱗、鰨米等，為名貴暖溫性底棲大型海水魚類，主要分布于我國的渤海、黃海海域。半滑舌鰨生長快、經(jīng)濟價值高，是理想的人工養(yǎng)殖種類。近年來，半滑舌鰨養(yǎng)殖技術(shù)方面的報道較多，而中草藥及其多糖提取物作為一種新型綠色免疫增強劑也逐漸成為研究熱點。黃芪多糖(APS)是從黃芪根部分離出的多糖組分，具有廣泛的免疫增強和抗病毒作用，其來源豐富，作為一種新型的免疫增強劑，在畜禽中得到了廣泛的應(yīng)用，但在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用還較少。本試驗以半滑舌鰨為研究對象，通過在其基礎(chǔ)餌料中分別添加6個不同水平的APS，檢測分析其腸黏液中LSZ、POD、AKP和ACP的活性，來探討半滑舌鰨腸黏液非特異免疫相關(guān)酶對不同劑量及不同作用時間的APS的免疫應(yīng)答，為APS在半滑舌鰨養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗用魚

半滑舌鰨活魚[（5.8±1.5）g]購買于福建省東山縣“祥源匯水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司”，試驗用魚分為7組，即1個對照組和6個試驗組。每個試驗組設(shè)3個重復(fù)，每重復(fù)投放15尾半滑舌鰨魚。

1.2 試驗藥品

APS（大連容海生物科技有限公司）、溶壁微球菌（中科院微生物研究所）、過氧化物酶測定試劑盒(南京建成生物工程研究所）、氯化鈉、瓊脂、牛肉膏、蛋白胨、肝素鈉（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）等。

1.3 試驗設(shè)備與用具

醫(yī)用型凈化工作臺（SW-CJ-ZFD）、紫外-可見分光光度計（UV-9600）、恒溫培養(yǎng)箱（SPX-100B-Z）、數(shù)顯式恒溫水浴鍋（HH·S21-6S）、離心機（80-3）、混勻機（QL-811）、烘干箱（DHG-9070A）和高壓滅菌鍋（YXQ-LS-50 SII）等。

1.4 試驗方法

1.4.1 試驗用魚養(yǎng)殖管理

采用單因素6水平3重復(fù)的方法，第1組為對照組，飼喂常規(guī)餌料，第2～6組飼喂試驗餌料。半滑舌鰨暫養(yǎng)期間投喂基礎(chǔ)(常規(guī))餌料，試驗開始后，對照組投喂常規(guī)餌料，試驗組投喂試驗餌料。每天于傍晚6：00和夜間10：00投喂餌料兩次，1 h后吸掉殘餌。試驗開始時測定半滑舌鰨腸黏液LSZ、POD、AKP和ACP等酶活性底值，隨后每隔18 d檢測1次，共測6次，試驗周期為90 d。

1.4.2 常規(guī)餌料的配制

按照常規(guī)餌料配方（見表1），先將魚粉、沙蠶粉、豆粉、淀粉、礦物鹽、酵母粉和預(yù)混料等粉狀成分按所需用量混合均勻，再將攪碎的牡蠣肉、魚油與粉狀料混勻，最后制粒備用。

1.4.3 試驗餌料的配制

杭州畫院現(xiàn)任執(zhí)行院長張子翔說：“打造美術(shù)重鎮(zhèn)，弘揚先進文化，配合中心工作，服務(wù)社會公益。在當(dāng)下中國畫院整體的發(fā)展態(tài)勢中，杭州畫院負(fù)載著人們對杭州文化發(fā)展的期待。”

依據(jù)試驗餌料配方（見表2），制作試驗餌料。用粉碎機將常規(guī)餌料制成粉狀，然后與黃芪多糖與面粉混勻，之后將血紅蟲、雞蛋和水用豆?jié){機打碎混勻，最后將上述粉料和液料混合均勻，至餌料用手揉起可成團狀且不散為宜。用制粒機將調(diào)和好的試驗餌料制成2號顆粒，于烘箱中40℃烘干備用。

表1 常規(guī)餌料配方

1.4.4 培養(yǎng)基的配制

使用002營養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基，把3.0 g蛋白胨、0.9 g牛肉膏、1.5 g NaCl、0.3 L蒸餾水放入500 ml錐形瓶中，然后加熱到完全溶解，用NaOH調(diào)整pH值至7.0，最后放入高壓蒸汽滅菌鍋中，121℃滅菌20 min。滅完后，把培養(yǎng)基取出，等溫度下降到大約60℃時，分別倒斜面和平板上。

1.4.5 微生物的培養(yǎng)

把1.0634溶壁微球菌凍干粉從冰箱中取出并消毒。敲下安瓿管頂部，用移液槍吸取0.3～0.5 ml適宜的液體培養(yǎng)基滴入安瓿管中，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解成懸濁液，吸取全部菌體懸濁液，接種于3支試管斜面培養(yǎng)基上，放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。再以活化細(xì)菌為菌種，進行擴大培養(yǎng)，以后每3 d重新接種一次，確保菌種處于增長期狀態(tài)，試驗前24 h，再培養(yǎng)試用菌。

表2 試驗餌料成分（每100 g含量）

1.4.6 腸黏液LSZ活性的測定

用移液槍分別取100 μl腸黏液和100 μl肝素鈉加入于1.5 ml離心管中混勻，3 000 r/min、離心10 min，將培養(yǎng)24 h的溶壁微球菌用生理鹽水（0.85%）配制成菌懸液（OD570=0.05），取4 ml該菌懸液與100 μl的樣本上清液，于試管中混合混勻，取一半測Abs(A1)，另一半于培養(yǎng)箱中37℃保溫30 min，取出后立即進行10 min冰浴，終止反應(yīng)，均勻后測Abs（A0）。

1.4.7 過氧化物酶（POD）活性、堿性磷酸酶（AKP）活性和酸性磷酸酶（ACP）活性的測定

POD、AKP和ACP的活性均使用由南京建成生物技術(shù)研究所生產(chǎn)的試劑盒進行測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 APS對半滑舌鰨腸黏液溶菌酶活性的影響（見表3）

表3 半滑舌鰨腸黏液溶菌酶（LSZ）活性（IU，X±SE）

由表3可知，各試驗組半滑舌鰨腸黏液LSZ活性隨試驗時間延長基本呈先增后減的變化趨勢，18 d后，各試驗組半滑舌鰨腸黏液LSZ活性均極顯著高于對照組（P＜0.01），試驗中半滑舌鰨腸黏液LSZ活性隨APS添加劑量增高，而較早達到較高水平，之后便出現(xiàn)下降趨勢。試驗結(jié)束時，各試驗組半滑舌鰨腸黏液LSZ活性均極顯著高于對照組（P＜0.01），其中尤以第2、3組作用效果最好。

2.2 APS對半滑舌鰨腸黏液過氧化物酶活性的影響（見表4）

表4 半滑舌鰨腸黏液過氧化物酶（POD）活性（IU，X±SE）

由表4可知，在同劑量APS作用下，第1、2組半滑舌鰨腸黏液POD活性隨時間延長呈逐步增強的變化趨勢，第3、4組呈先降后增的變化趨勢，第5、6組呈先增后減的變化趨勢，其中，第2組在18 d后極顯著高于對照組(P＜0.01)，第5、6組則于36 d后極顯著高于對照組(P＜0.01)，第1組則于54 d后極顯著高于對照組(P＜0.01)；試驗中半滑舌鰨腸黏液POD活性隨APS添加劑量增高而較早達到較高水平，之后便持續(xù)下降。試驗結(jié)束時，各試驗組半滑舌鰨腸黏液POD活性均極顯著高于對照組(P＜0.01)，其中尤以第1、2組作用效果最好。

2.3 APS對半滑舌鰨腸黏液堿性磷酸酶活性的影響（見表5）

表5 半滑舌鰨腸黏液堿性磷酸酶（AKP）活性（IU，X±SE）

由表5可知，第2、3、4組半滑舌鰨腸黏液AKP活性隨時間延長均呈先增后減的變化趨勢，第1組呈先降后增的變化趨勢，第5、6組呈先降后增之后再次降低的變化趨勢；半滑舌鰨腸黏液AKP活性隨APS添加劑量增高，而較早達到較高水平，之后便逐漸下降。試驗結(jié)束時，第2、3、4、5組半滑舌鰨腸黏液AKP活性均極顯著高于對照組（P＜0.01），其中尤以第2、3組作用效果較好。第1、6兩組半滑舌鰨腸黏液AKP活性與對照組相比較無顯著差異（P＞0.05）。

2.4 APS對半滑舌鰨腸黏液酸性磷酸酶活性的影響（見表6）

表6 半滑舌鰨腸黏液酸性磷酸酶（ACP）活性（IU，X±SE）

試驗中，第1、2組半滑舌鰨腸黏液ACP活性隨時間延長呈逐步增強的變化趨勢，18 d后極顯著高于對照組（P＜0.01）；其余各組半滑舌鰨腸黏液ACP活性則隨時間延長呈先增后減的變化趨勢，試驗中半滑舌鰨腸黏液ACP活性隨APS添加劑量增高而較早達到較高水平，隨后逐漸下降。試驗結(jié)束時，各試驗組半滑舌鰨腸黏液ACP活性均極顯著高于對照組（P＜0.01）；其中尤以第2組作用效果較好。

3 討論

3.1 APS對半滑舌鰨腸黏液LSZ活性的影響

溶菌酶（LSZ）是吞噬細(xì)胞殺菌的物質(zhì)基礎(chǔ)，它是動物機體許多組織重要的非特異性免疫因子。在動物免疫研究中，LSZ活性是衡量動物體非特異性免疫力的一個重要量化指標(biāo)。袁呂江等發(fā)現(xiàn)，魚腥草素同系物能夠提高小鼠血清溶菌酶活性，且隨濃度增加增幅加大，最大可達20%。體外試驗時，在低濃度時魚腥草素同系物明顯提高溶菌酶的活性，超過一定濃度時則表現(xiàn)出抑制溶菌酶的活性。本研究發(fā)現(xiàn)，半滑舌鰨腸黏液中LSZ活性，各試驗組基本呈先增后降的變化趨勢，且中低劑量APS可較大程度提高LSZ活力。這與袁呂江研究的小鼠LSZ的活力隨魚腥草同系物濃度低促高抑的結(jié)論基本一致。

3.2 APS對半滑舌鰨腸黏液POD活性的影響

過氧化物酶（POD）普遍存在于真核生物的各類細(xì)胞中，尤其是在肝細(xì)胞和腎細(xì)胞中數(shù)量特別多。研究發(fā)現(xiàn)，POD活性與生物的非特異免疫功能水平有一定程度的關(guān)聯(lián)。顧華杰等為探究灰樹花多糖對吉富羅非魚免疫細(xì)胞和抗氧化酶活性的影響，在飼料中分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、0.05%、0.20%灰樹花多糖，結(jié)果表明，灰樹花多糖對吉富羅非魚血清、肝臟中過氧化物酶活性有顯著促進作用，且表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)，且過氧化氫酶活性受多糖的促進作用隨時間延長逐漸減弱。本研究發(fā)現(xiàn)，低劑量的APS（300 mg/kg≤APS≤600 mg/kg）對半滑舌鰨腸黏液POD活性具有逐漸增強作用，中劑量的APS（900 mg/kg≤APS≤1 200 mg/kg）具有先抑后促的作用，高劑量的APS（1 500 mg/kg≤APS≤1 800 mg/kg）具有先抑后促隨后再次抑制的作用；54 d后，所有試驗組黏液POD活性極顯著高于對照組(P＜0.01)，且低劑量組（300 mg/kg≤APS≤600 mg/kg）效果較好；高劑量的APS（1 500 mg/kg≤APS≤1 800 mg/kg）對半滑舌鰨腸黏液POD活性的提高在54 d時達到最強，其后逐漸下降，這與顧華杰等研究結(jié)果基本一致。但由于兩試驗中飼料所添加的物質(zhì)和劑量均不同，故兩試驗中的POD活性對各自物質(zhì)的免疫應(yīng)答程度也有所不同。

3.3 APS對半滑舌鰨腸黏液AKP活性的影響

堿性磷酸酶（AKP）是廣泛分布于人體及動物體的肝臟、骨骼、腸、腎等組織經(jīng)肝臟向膽外排出的一種酶。這種酶能催化核酸分子脫掉5'磷酸基團，從而使DNA或RNA片段的5'-P末端轉(zhuǎn)換成5'-OH末端。但它不是單一的酶，而是一組同功酶。張桐等為觀察飼料中添加不同水平的維生素D3對松浦鏡鯉幼魚體成分、血清鈣磷和堿性磷酸酶活性的影響，分別投喂維生素D3添加量為0、200、400、800、1 600、3 200 IU/kg及1×105IU/kg的7種飼料，試驗時間為56 d，結(jié)果表明，隨著維生素D3添加量的增加，全魚鈣磷含量、血清鈣磷離子濃度和堿性磷酸酶活性均有先升高后降低的趨勢，且當(dāng)飼料中維生素D3添加量達到800 IU/kg時血清中的堿性磷酸酶活性最高。本研究發(fā)現(xiàn)，第2、3、4組半滑舌鰨腸黏液AKP活性隨時間延長均呈先增后減的變化趨勢，第1組呈先降后增的變化趨勢，第5、6組呈先降后增之后再次降低的變化趨勢；試驗中隨APS添加劑量增高，半滑舌鰨腸黏液AKP活性達到較高水平時間也較早，之后便逐漸下降。低劑量APS組（300 mg/kg≤APS≤600 mg/kg）半滑舌鰨腸黏液AKP活性至72 d時達最大值，中高劑量APS組（900 mg/kg≤APS≤1 800 mg/kg）半滑舌鰨腸黏液AKP活性則至36 d時達最大值，隨后均呈下降趨勢。本研究與張桐等的研究結(jié)果基本一致，但AKP活性達最高值時添加物的量有所不同，這可能是兩試驗的研究對象不同所致。

3.4 APS對半滑舌鰨腸黏液ACP活性的影響

酸性磷酸酶（ACP）主要存在于動物體的巨噬細(xì)胞，定位于溶酶體內(nèi)。酸性磷酸酶是一種在酸性條件下催化磷酸單酯水解生成無機磷酸的水解酶。國內(nèi)外在對水產(chǎn)動物ACP的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)功能及催化機理方面作了大量的研究工作。牟海津等采用1.0%的蟲草多糖或海藻多糖作為免疫藥物，對櫛孔扇貝進行注射刺激后，發(fā)現(xiàn)血清中的ACP活性有顯著提高，血細(xì)胞中的ACP活性也有所增加，而肝臟提取液中該酶活性的變化不很明顯。本研究發(fā)現(xiàn)，低劑量APS（300 mg/kg≤APS≤600 mg/kg）作用下，半滑舌鰨腸黏液ACP活性隨時間延長呈逐步增強的變化趨勢；隨APS添加劑量的增加，中高劑量（900 mg/kg≤APS≤1 800 mg/kg）的APS可以使半滑舌鰨腸黏液ACP活性呈先增后減的變化趨勢，APS劑量越高其腸黏液ACP活性越較早達到最大值，隨后越較早對其腸黏液ACP活性的提高產(chǎn)生抑制作用，這與牟海津等的研究結(jié)果有所不同，可能是由于研究對象、組織以及作用時間不同所致。

4 小結(jié)

① APS對半滑舌鰨腸黏液LSZ、POD、AKP、ACP四種酶的活性具有顯著的影響，低劑量的APS對其具有增強的作用，高劑量的APS對其具有先增強后抑制的作用。

② 半滑舌鰨腸黏液中LSZ、POD、AKP、ACP四種酶活性對APS的應(yīng)答時序有所不同，第36 d時，900 mg/kg組半滑舌鰨腸黏液AKP活性對APS的應(yīng)答達到最強，之后便逐漸降低；54 d時，900 mg/kg組半滑舌鰨腸黏液LSZ活性、900 mg/kg組和1 200 mg/kg組ACP活性對APS的應(yīng)答達到最強，之后便逐漸降低；至90 d時，300 mg/kg組和600 mg/kg組半滑舌鰨腸黏液中POD活性對APS的應(yīng)答才最終達到最強。

③從節(jié)約餌料成本及提高半滑舌鰨腸黏液免疫活性的角度出發(fā)，建議在餌料中添加APS的較佳劑量為600 mg/kg。

（參考文獻18篇，刊略，需者可函索）