羥基紅花黃色素A 在Caco-2 細胞單層的吸收機制研究

□楊 梅 趙瑞亭

紅花中羥基紅花黃色素A(簡稱羥基紅花素)是紅花主要的活性成分，是查耳酮類化合物，具有擴張冠脈、抗氧化、保護心肌、降血壓、免疫抑制及腦保護等多種藥理學(xué)功效，是用于治療冠心病、心絞痛等心腦血管疾病的有效藥物。目前其臨床劑型為注射劑，口服劑型未見報道，其口服吸收程度及具體的吸收機制還不明確。但在許多口服中藥復(fù)方制劑中以紅花浸膏為原料，很多證據(jù)顯示羥基紅花黃色素A對多種疾病的治療有益，證實了羥基紅花黃色素A 口服吸收的可能性。

Caco-2 細胞(the human colon adenocarcinoma cell lines 的簡稱)模型是最近十幾年來國外廣泛采用的一種研究藥物腸吸收的體外模型，在吸收過程研究中，比較簡單，重復(fù)性較好，應(yīng)用范圍較廣。目前利用Caco-2 細胞模型研究了許多化學(xué)合成藥的吸收機制，對中藥及有效成分的研究也有一些進展，但對紅花或羥基紅花黃色素A 的研究未見報道，用Caco -2 模型研究羥基紅花黃色素A 的吸收機制，有助于為口服羥基紅花黃色素A 劑型設(shè)計、處方和工藝的篩選提供依據(jù)，具有理論意義和實用價值。

一、材料

(一)細胞株。Caco -2 細胞(code HTB037，ATCC，American Type Culture Collection，Rockville，MD)。實驗中所用代數(shù)在40 到50 代之間。

(二)主要試劑。羥基紅花黃色素A 購自山東綠葉;MEM/EBSS NEAA 培養(yǎng)基、0．25%胰酶消化液、胎牛血清、丙酮酸鈉(11．0mg/ml)購自Hyclone 公司;N -2 -羥乙基哌嗪- N’-2乙磺酸鈉(Hepes)、L-谷氨酰胺、青、鏈霉素購自南京博全科技有限公司;碳酸氫鈉分析純購自上海虹光化工廠;維拉帕米購自連云港恒瑞制藥廠。

二、實驗方法

(一)細胞培養(yǎng)。Caco-2 細胞培養(yǎng)在T -75 培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液為MEM/EBSS NEAA，在37℃含5% CO2培養(yǎng)箱中全濕度培養(yǎng)。細胞接種24 小時后更換培養(yǎng)液，以去除死細胞殘渣。以后隔日換液，約5天后細胞融合達90%后傳代，用37℃預(yù)熱的消化液(胰蛋白酶(0．05%)+EDTA﹒2Na(0．53 mmol/L ))在室溫下消化2～3 分鐘，傳代比率1:3。實驗時細胞接種在24 孔Millicell 插入式培養(yǎng)皿中，接種密度7 ×104個/mL，每孔400 μL，基底側(cè)加入培養(yǎng)液600 μL，接種24 小時后更換培養(yǎng)液，接下來一周隔天換液，一周后每日換液。細胞培養(yǎng)21天后待用，以跨膜電阻作為細胞單層形成的指標(biāo)，電阻≥600Ω·cm2時，便可以開始用于轉(zhuǎn)運實驗。

(二)AP→BL 轉(zhuǎn)運實驗。用生長了21～24天的符合上述條件的Caco-2 細胞單層來研究羥基紅花黃色素A 在Caco -2細胞單層上的轉(zhuǎn)運。實驗前用pH7．4 T．M．溶液輕輕沖洗2～3次(每孔800μL ，頂側(cè)300μL，基底側(cè)500μL)，然后用pH7．4 T．M．溶液于37℃浸泡30min，以除去細胞表面的附著物。小心吸去孔內(nèi)T．M．溶液，在頂側(cè)加入T．M．溶液配制的供試液400μL，基底側(cè)加入600μL 空白pH7．4T． M． 溶液或含抑制劑的pH7．4T．M．溶液作為接收液。置于37℃含5% CO2培養(yǎng)箱中，于給藥30、60、90、120、150min 于下層取樣150μL，并補充空白pH7．4 T．M．溶液。每個濃度三個復(fù)孔。樣品-20℃保存，待測。

(三)BL→AP 轉(zhuǎn)運實驗。同上法洗滌Caco -2 細胞單層，在基底側(cè)加入T．M．溶液配制的供試液600μL，頂側(cè)加入400μL空白pH7．4T．M．溶液或含抑制劑的pH7．4T．M．溶液作為接收液。置于37℃含5% CO2培養(yǎng)箱中，于給藥30、60、90、120、150min 于頂側(cè)取樣150μL，并補充空白T． M． 溶液。每個濃度三個復(fù)孔(即n=3)。樣品-20℃保存，待測。

(四)攝取實驗。胰酶消化的細胞，用4℃的pH7．4T．M．溶液沖洗3 次(每孔800μL ，頂側(cè)300μL，基底側(cè)500μL)，以終止Caco-2 細胞攝取。在攝取了羥基紅花黃色素A 的Caco -2 細胞中加入蒸餾水(每孔500μL，頂側(cè)200μL，基底側(cè)300μL)，于-70℃、37℃反復(fù)凍融3 次，破碎細胞。-20℃保存，待測。

(五)羥基紅花黃色素A 轉(zhuǎn)運或攝取樣品的測定。轉(zhuǎn)運樣品12，000rpm 離心10min，取上清液HPLC 法測定濃度。

攝取樣品用過濾器(孔徑0．22μm)過濾，12，000rpm 離心10min，取上清液HPLC 法測定濃度。

液相條件:色譜柱:島津shim-pack CLC-ODS 柱(150mm×6mm，5μm);流速:0．8 m l·min-1;檢測波長:403nm;柱溫:40℃。流動相:甲醇-乙腈-1．2%KH2PO4水溶液(24:2:74)。

羥基紅花黃色素A 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:經(jīng)高效液相分析，以樣品中羥基紅花黃色素A 量為縱坐標(biāo)，峰面積為橫坐標(biāo)，求得的直線回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。Y=0．3262X-0．0435，R2=0．9992，羥基紅花黃色素A 在0．57～660 ng 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相應(yīng)峰面積為1．85～2050．8;精密度、樣品穩(wěn)定

性考察均符合規(guī)定。

三、實驗結(jié)果

(一)不同pH對羥基紅花黃色素A 細胞轉(zhuǎn)運的影響。分別用pH4、5、6 和7．4 含200μg·ml-1 羥基紅花黃色素A 濃度的供試液，進行細胞轉(zhuǎn)運實驗。在pH7．4～pH4 范圍內(nèi)，羥基紅花黃色素A AP→BL方向轉(zhuǎn)運的表觀滲透系數(shù)Papp 為1．5 ×10-8±1．10 ×10-8～1．10 ×10-7±0．12 ×10-7cm·s-1(n =3)，隨pH 的降低而顯著性增加，在pH5～6之間有極顯著性增大，pH低于5 時，Caco-2 細胞跨膜電阻值有明顯下降。表明羥基紅花黃色素A 在Caco-2 單層細胞模型的滲透性與pH 有關(guān)，見圖1。

圖1 不同PH 的200μg·ml-1 Hya對Caco-2 轉(zhuǎn)運的影響

圖2 不同濃度的Hya對Caco-2 細胞轉(zhuǎn)運和攝取的影響

(二)濃度對羥基紅花黃色素A 細胞轉(zhuǎn)運和攝取的影響。當(dāng)pH6 時，AP→BL方向轉(zhuǎn)運在100～800μg·ml-1的濃度范圍內(nèi)，Papp 無顯著性差異，即無濃度依賴性。表明在100～800μg·ml-1的濃度范圍內(nèi)羥基紅花黃色素A 以被動擴散為主。在同一濃度范圍內(nèi)，BL→AP方向轉(zhuǎn)運的表觀滲透系數(shù)Papp 在整個濃度范圍內(nèi)也無顯著性變化。在100～800μg·ml-1的濃度范圍內(nèi)，Papp(BL→AP)/Papp(AP→BL)在0．59～1．10之間，表明羥基紅花黃色素A 在BL→AP與AP→BL方向轉(zhuǎn)運速度是接近的(圖2)。攝取實驗中，在100～800μg·ml-1 的濃度范圍內(nèi)，BL→AP方向的細胞內(nèi)對羥基紅花黃色素A 的滯留量極顯著性大于AP→BL方向(圖2)。

(三)維拉帕米對羥基紅花黃色素A 細胞轉(zhuǎn)運和攝取的影響。在供試液和接收液中含100μmol·L-1維拉帕米時，200μg·ml-1羥基紅花黃色素A 的表觀滲透系數(shù)BL→AP與AP→BL方向均極顯著性增加，增加的比例相似。攝取實驗中BL→AP的細胞內(nèi)對羥基紅花黃色素A 的滯留量極顯著性增加。而AP→BL方向的細胞攝取無顯著性變化(圖3)。

圖3 維拉帕米羥基紅花黃色素A 細胞轉(zhuǎn)運和攝取的影響

(四)低鈉介質(zhì)與BSO對羥基紅花黃色素A 細胞轉(zhuǎn)運的影響。含200μg·ml-1羥基紅花黃色素A 供試液和接收液中的Na+濃度降低到20μmol·L-1(用K+調(diào)節(jié)至等滲)，羥基紅花黃色素A 的表觀滲透系數(shù)顯著性降低(Figure10)。當(dāng)200μg·ml-1羥基紅花黃色素A 供試液和接收液中加入500μmol·L-1BSO 時，羥基紅花黃色素A 的表觀滲透系數(shù)無顯著性變化(圖5)。

圖4 低鈉介質(zhì)與BSO對羥基紅花黃色素A 細胞轉(zhuǎn)運的影響

四、討論

常用中藥紅花為菊科一年生草本植物紅花的干燥管狀花，始載于《開寶本草》，在我國已有兩多年的栽培與用藥歷史，具有活血去瘀、通經(jīng)止痛之功效。紅花中羥基紅花黃色素A(簡稱羥基紅花素)是紅花主要的活性成分，是查耳酮類化合物，具有擴張冠脈、抗氧化、保護心肌等多種藥理學(xué)功效。目前其臨床劑型為注射劑，其口服吸收程度及具體的吸收機制還不明確。研究羥基紅花素的口服劑具有重要的臨床意義。

體外模型被廣泛用于闡明藥物分子的轉(zhuǎn)運機制以及確定某些影響藥物轉(zhuǎn)運特性的結(jié)構(gòu)特征。在本研究中采用了不同介質(zhì)PH 值、濃度、維拉帕米、低Na 介質(zhì)、丁硫氨酸亞砜胺(BSO)對羥基紅花黃色素A 在Caco -2 細胞單層的轉(zhuǎn)運和攝取的影響。實驗結(jié)果顯示，在pH7．4～pH4 范圍內(nèi)，羥基紅花黃色素A AP→BL方向轉(zhuǎn)運的表觀滲透系數(shù)有顯著性增大，在pH5～6之間有極顯著性增大，表明羥基紅花黃色素A 在Caco -2 單層細胞模型的滲透性與pH 有關(guān)。pH6 時，在100～800μg·ml-1的濃度范圍內(nèi)，Papp 無顯著性差異，即無濃度依賴性。表明在100～800μg·ml-1的濃度范圍內(nèi)羥基紅花黃色素A 以被動擴散為主。當(dāng)供試液和接收液中含100μmol·L-1維拉帕米時，羥基紅花黃色素A 由AP→BL方向Papp 極顯著性增加，證明在AP 細胞膜上存在P-gp 外排。羥基紅花黃色素A 由BL→AP方向細胞內(nèi)滯留顯著性增加，可能與P -gp 外排被抑制有關(guān)。當(dāng)供試液和接收液中含500μmol·L-1BSO 時，羥基紅花黃色素A 的Papp 在AP→BL方向無顯著性變化。表明羥基紅花黃色素A在腸道的吸收不受MRP2 外排的影響。當(dāng)供試液和接收液中的Na+濃度從154 mmol·L-1降低到20mmol·L-1(用K+調(diào)節(jié)至等滲)時，低濃度的Na +可以導(dǎo)致SGLT1 活性降低，葡萄糖轉(zhuǎn)運速度減慢。羥基紅花黃色素A 轉(zhuǎn)運速度顯著性降低，表明其吸收與SGLT1 有關(guān)。

本文研究并未結(jié)合劑型因素，但若可以結(jié)合劑型因素，有望為口服羥基紅花素劑型設(shè)計、處方和工藝的篩選提供依據(jù)。因此Caco-2 細胞模型在中藥口服吸收研究方面具有廣泛的應(yīng)用前景。