抗真菌藥物與Toll樣受體在固有免疫應(yīng)答中的作用

吳 婷，王 敏，蘇 欣，施 毅

近年來免疫抑制人群逐漸增加，真菌已成為此類人群罹患感染性疾病最主要的病原體。隨著全球真菌感染發(fā)病率的增加，致死率高，對真菌感染疾病認(rèn)識不足、診斷困難、抗真菌藥物療效有限且已出現(xiàn)耐藥的現(xiàn)狀都是臨床工作中面臨的困難，因此急需開拓新的治療方向以應(yīng)對真菌感染［1］?？拐婢幬锍藢φ婢闹苯託缱饔猛?，還可以通過激活機(jī)體固有免疫應(yīng)答而抵御真菌感染。故本文圍繞廣譜抗真菌藥物對固有免疫應(yīng)答的影響，尤其是抗真菌藥物與Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）在觸發(fā)固有免疫應(yīng)答間的關(guān)系作一綜述。

1 真菌與抗真菌藥物

1.1 真菌感染現(xiàn)狀

自然界中約存在150萬種真菌，其中僅150～400種能感染人類［2］。免疫抑制人群可發(fā)生從淺表至深部直至一系列機(jī)會性真菌感染。在地方性真菌病流行的發(fā)展中國家，免疫抑制和免疫健全人群都可罹患真菌感染［3］。在所有侵襲性真菌感染（invasive fungal infections，IFI）中，念珠菌是最主要的病原體，占70%～90%，其次是曲霉，占10%～20%，第3 位是隱球菌［4］。IFI具有高患病率和病死率，即使抗真菌治療能帶來獲益，但對有危險因素的患者而言真菌感染仍是醫(yī)院獲得性感染的第4大病原體［5］。

1.2 抗真菌藥物

兩性霉素B是多烯類抗真菌藥物，選擇作用于真菌細(xì)胞膜上的麥角固醇，在膜上形成微孔，使細(xì)胞內(nèi)K＋、核苷酸、氨基酸等物質(zhì)外滲，無用物質(zhì)或有毒物質(zhì)滲入而致真菌死亡。兩性霉素抗菌譜廣，作用于念珠菌、隱球菌、毛霉、曲霉等引起的系統(tǒng)性感染，是重癥真菌感染治療的基石［6］。脫氧膽鹽兩性霉素B（deoxycholate AmB）是兩性霉素B的常規(guī)劑型，脂質(zhì)體兩性霉素B（liposomal AmB）劑型易于吸收［5］。棘白菌素類是新型抗真菌藥物，能抑制1，3-β-葡聚糖合成酶而抑制真菌細(xì)胞壁1，3-β-葡聚糖合成，從而破壞真菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)致真菌破裂死亡［7］。1，3-β-葡聚糖不僅是細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，也是C型凝集素受體家族（C-type lectins receptors，CLR）中樹突狀細(xì)胞相關(guān)性C型植物血凝素1（Dectin-1）的配體，刺激宿主細(xì)胞TLR、CLR這類固有免疫受體，觸發(fā)免疫應(yīng)答［8］。棘白菌素類也能激活吞噬作用和促炎應(yīng)答，其抗菌譜覆蓋念珠菌、曲霉、肺孢菌等［7］。三唑類可用于系統(tǒng)性真菌感染，包括氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑和泊沙康唑。其能抑制羊毛甾醇14α-去甲基化酶素P450酶這一細(xì)胞色素P450蛋白超家族一員，從而抑制真菌細(xì)胞膜麥角固醇生物合成［9］。具有口服吸收特性的三唑類可用于治療輕癥或重癥真菌感染，如氟康唑治療念珠菌陰道炎，伏立康唑治療曲霉感染。

2 抗真菌藥物與固有免疫關(guān)系

眾所周知，微生物與抗菌藥物、微生物與免疫系統(tǒng)之間存在直接作用，此外，抗菌藥物對免疫系統(tǒng)也起直接調(diào)節(jié)作用，可表現(xiàn)在調(diào)節(jié)吞噬作用、趨化作用、內(nèi)毒素釋放、細(xì)胞因子產(chǎn)生、免疫抑制后造血干細(xì)胞恢復(fù)、增強(qiáng)或抑制細(xì)胞凋亡等方面。如抗菌藥物的代表喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類即具有多種免疫調(diào)節(jié)作用。

固有免疫是抵抗肺部真菌感染的第一道防線，抗真菌藥物能協(xié)同宿主吞噬細(xì)胞共同抵抗感染組織中的微生物［10］，在體內(nèi)、體外實驗中都表現(xiàn)出與效應(yīng)細(xì)胞的協(xié)同作用［4］。在無真菌感染條件下，單純給予兩性霉素B 刺激人原代單核細(xì)胞、THP-1 細(xì)胞、HEK293細(xì)胞可 生成炎 性因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8，細(xì)胞因子單核細(xì)胞趨化蛋白（MCP-1）、巨噬細(xì)胞炎性蛋白（MIP-1β）和IL-8，前列腺素（PG）和一氧化氮（NO）［11］。確診或擬診真菌感染的粒細(xì)胞缺乏患者，持續(xù)3 d給予兩性霉素B 后其血清中TNF-α、IL-6、IL-1-RA 增多［12］。上述結(jié)果提示兩性霉素B 可激活固有免疫反應(yīng)，刺激多種細(xì)胞因子、炎性因子產(chǎn)生。早在20 世紀(jì)90 年代，Garcha等［13］證實唑類藥物與小鼠巨噬細(xì)胞、人中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和單核細(xì)胞源的巨噬細(xì)胞協(xié)同殺滅真菌；Van′t Wout等［14］證實兩性霉素B、氟康唑、伊曲康唑能抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)念珠菌的芽管萌發(fā)；Roilides等［15］證實兩性霉素B、氟胞嘧啶、酮康唑、氟康唑、Sch-39304（三唑類）、西洛芬凈（LY121019）6種抗真菌藥物在體外中性粒細(xì)胞應(yīng)對念珠菌感染中起免疫調(diào)節(jié)作用。近期，陸續(xù)有報道新型抗真菌藥物唑類和棘白菌素類的免疫調(diào)節(jié)作用［16-17］。Choi等［16］證實抗菌藥物（莫西沙星）和抗真菌藥物可調(diào)節(jié)免疫，抗真菌藥物在體外應(yīng)對煙曲霉感染的免疫應(yīng)答時可發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

三類抗真菌藥物在殺滅真菌的同時與固有免疫系統(tǒng)協(xié)同作用，增強(qiáng)機(jī)體固有免疫系統(tǒng)對入侵病原體的抵御。TLR 類模式識別受體是這一過程中最重要的成分。TLR 在有免疫功能的組織及與外界環(huán)境相交通的呼吸道、胃腸道上都有表達(dá)，在免疫系統(tǒng)應(yīng)對病原體入侵時識別病原體。人類已發(fā)現(xiàn)10種TLR（TLR1～TLR10），可識別病原體表面的病原相關(guān)模式分子（pathogen associated microbial patterns，PAMP）或者危險相關(guān)模式分子（dangerassociated molecular patterns，DAMP）［18］。TLR1識別的PAMP 是革蘭陽性菌；TLR2 識別多種細(xì)菌、真菌、病毒和特定的內(nèi)源性結(jié)構(gòu)；TLR4 識別革蘭陰性菌的脂多糖；TLR9在多種免疫細(xì)胞如樹突狀細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞上表達(dá)，識別DNA 中非甲基化胞嘧啶核苷酸-鳥嘌呤核苷酸（CpG）序列［18］。

3 抗真菌藥物與TLR

3.1 兩性霉素B和TLR

由于兩性霉素B 是革蘭陽性細(xì)菌鏈霉菌的產(chǎn)物，因此推測固有免疫細(xì)胞可通過TLRs識別兩性霉素B。兩性霉素B 可刺激TLR1、TLR2 和TLR4。Sau等［19］研究發(fā)現(xiàn)TLR2和CD14受體對炎性因子TNF-α和IL-8的釋放起重要作用；TLR2也對IL-1β的釋放起作用。在無真菌感染情況下，TLR2-／-小鼠的 腹膜巨 噬細(xì)胞（peritoneal macrophages，PM）給予兩性霉素B 刺激后不能產(chǎn)生TNF-α、IL-1β和IL-8，而野生型小鼠經(jīng)兩性霉素B刺激后上述炎性因子生成增加。給TLR4突變的C3H／HeJ（TLR4mt）小鼠PM 以兩性霉素B 刺激，TNF-α生成受到抑制，但此現(xiàn)象僅在高劑量兩性霉素B（4 mg／L）給藥組時出現(xiàn)。TLR 應(yīng)對兩性霉素B刺激的反應(yīng)受CD14 影響，即兩性霉素B 刺激CD14-／-小鼠PM，CD4-／-細(xì)胞不 能產(chǎn)生TNF-α，但I(xiàn)L-1β生成不受此影響。上述現(xiàn)象均由脫氧膽鹽兩性霉素B觸發(fā)，脂質(zhì)體兩性霉素B 不能刺激PM 細(xì)胞因子的生成。原因系脂質(zhì)體兩性霉素B 中兩性霉素B 被包裹在脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)中，游離的、非脂質(zhì)體形式兩性霉素B 濃度低，不能有效刺激TLR2／CD14和其他受體［19］。

兩性霉素B對TLR1的作用由Razonable等［11］證實。抗 人TLR1 單克隆抗 體（anti-human TLR1 monoclonal antibody，anti-TLR1 MAb）處理THP-1細(xì)胞后，給予兩性霉素B刺激后IL-6、IL-8、TNF-α生成都較對照組減少；予TLR2-TLR1 配體Pam-3-Cys（tripalmitoyl cysteinyl lipopeptide）刺激，IL-8 生成減少；予TLR2配體肽聚糖（peptidoglycan，PNG）刺激，則 對IL-8 產(chǎn)生無影響。THP-1 細(xì)胞經(jīng)anti-TLR2 MAb處理后，再給予兩性霉素B后，IL-8的生成抑制作用弱于經(jīng)anti-TLR1 MAb 處理組；若 此時加入anti-TLR1 MAb，則IL-8的生成明顯抑制。綜上，結(jié)合Sau等［19］的研究表明TLR1參與到TLR2介導(dǎo)的兩性霉素B對細(xì)胞的激活作用。

Bellocchio等［20］證實人和小鼠中性粒細(xì)胞分別經(jīng)脫氧膽鹽兩性霉素B 或脂質(zhì)體兩性霉素B 處理后再予曲霉感染，致TLR2和TLR4表達(dá)上調(diào)。曲霉分生孢子和菌絲均能誘導(dǎo)TLR2增加，但僅菌絲誘導(dǎo)TLR4增加。兩性霉素B 不同劑型對中性粒細(xì)胞上TLR 信號通路的激活有選擇性：脫氧膽鹽兩性霉素B 優(yōu)先激活TLR2信號通路，增加TLR2和促炎因子TNF-α；脂質(zhì)體兩性霉素B 優(yōu)先激活TLR4信號通路，增加TLR4和抑炎因子IL-10，減少TNF-α的產(chǎn)生。對于TLR4-／-小鼠，脂質(zhì)體兩性霉素B 則起到脫氧膽鹽兩性霉素B 的作用，刺激TNF-α產(chǎn)生［20］。Matsuo等［21］用RAW264.7 cells單核細(xì)胞系證明兩性霉素B 磷酸化NF-κB 的p65（RelA），通過TLR2和NF-κB調(diào)節(jié)促炎因子產(chǎn)生。

Salvenmoser等［22］予兩性霉素B處理人中性粒細(xì)胞后再感染煙曲霉，僅TLR9表達(dá)上調(diào)。原因考慮是煙曲霉未甲基化的CpG DNA 是TLR9的天然配體，由Ramirez-Ortiz等［23］用如下實驗證實：對小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞（bone marrow-derived dendritic cells，BMDCs）和人漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（plasmacytoid dendritic cell，pDC）分別給予煙曲霉DNA 或富含CpG 的煙曲霉基因序列合成物，都能刺激TNF-α、IL-12p70、INF-γ生成；TLR9-／-的小鼠BDMCs生成TNF-α減少。綜上表明TLR9識別煙曲霉DNA，促進(jìn)炎性反應(yīng)因子分泌，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。

2 棘白菌素類與TLR

Salvenmoser等［22］予卡泊芬凈處理人中性粒細(xì)胞后再感染煙曲霉、念珠菌，結(jié)果示中性粒細(xì)胞應(yīng)對煙曲霉感染時增加TLR2表達(dá)，而應(yīng)對念珠菌感染時增加TLR4和TLR9表達(dá)。

Moretti等［24］證實卡泊芬凈抗真菌效應(yīng)與TLR2／Dectin-1、Dectin-1與TLR4、TLR9的關(guān)系。不同種 系Dectin-1-／-小鼠侵 襲性曲霉病（invasive aspergillosis，IA）模型給予低濃度（0.1 mg／kg）卡泊芬凈后，療效與遺傳背景相關(guān)：Dectin-1-／-C57BL／6小鼠經(jīng)卡泊芬凈治療后真菌生長受限、炎性反應(yīng)細(xì)胞招募減少，但療效不及野生組小鼠；而Dectin-1-／-BALB／c小鼠卻無此作用。免疫完整、環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)、骨髓移植3種IA 小鼠模型中，卡泊芬凈的抗真菌療效表現(xiàn)出“矛盾現(xiàn)象”（the Eagle effect）：低濃度（0.1 mg／kg）時抑制真菌生長，減少炎性反應(yīng)細(xì)胞招募；而高濃度時（5 mg／kg）則不能抑制真菌生長，增加炎性反應(yīng)細(xì)胞招募。但在Dectin-1-／-的2種種系小鼠中及TLR2-／-的C57BL／6小鼠IA 模型中卡泊芬凈的“矛盾現(xiàn)象”消失，即低濃度時不能抑制真菌生長，高濃度反而抑制真菌生長。綜上表明卡泊芬凈抗真菌作用依賴TLR2／Dectin-1。在TLR4-／-、TLR9-／-C57BL／6小鼠IA 模型中，TLR4-／-小鼠卡泊芬凈的“矛盾現(xiàn)象”也消失，表明TLR4部分參與卡泊芬凈TLR2／Dectin-1依賴的保護(hù)作用；對于TLR9-／-小鼠，低濃度和高濃度卡泊芬凈治療，均抑制真菌生長、減少炎性反應(yīng)細(xì)胞招募，表明TLR9抑制卡泊芬凈的抗曲霉作用［24］。

Moretti等［25］證實米 卡芬凈 治療小 鼠IA 時TNF-α減少，IL-10增加，具有免疫調(diào)節(jié)作用。IL-10-／-小鼠IA模型分別給予1 mg／kg和10 mg／kg米卡芬凈，2種濃度下肺組織菌落負(fù)荷均降低，但播散到腦組織的菌落負(fù)荷增加，病理炎性反應(yīng)加重，中性粒細(xì)胞招募增加、促炎因子TNF-α和IL-17增多，說明米卡芬凈的 抗炎作用需IL-10 參 與。在Dectin-1-／-、TLR2-／-、TLR3-／-、TLR4-／-、TLR9-／-、MyD88-／-（Dectin-1、TLR2、TLR4、TLR9的下游蛋白）及TRIF-／-（TLR3、TLR4的下游蛋白）的小鼠IA 模型分別給予1 mg／kg和10 mg／kg米卡芬凈治療，療效有差異：TLR2-／-小鼠在2種劑量下療效與野生組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義；在野生組中，1 mg／kg 米卡芬凈的療效與未治療組無差別，10 mg／kg米卡芬凈能降低菌落負(fù)荷，減輕組織炎性反應(yīng)，但 在Dectin-1-／-、TLR2-／-、TLR3-／-、TRIF-／-小鼠中該作用消失；2種劑量都使Dectin-1-／-、TRIF-／-小鼠肺部菌落增加，組織炎性反應(yīng)加重；僅10 mg／kg劑量使TLR3-／-小鼠療效惡化。上述結(jié)果表明低濃度（1 mg／kg）米卡芬凈激活Dectin-1／TRIF信號通路，而高濃度（10 mg／kg）米卡芬凈需要Dectin-1、TLR2、TLR3和TRIF共同參與才能起到保護(hù)性作用。給予TLR4-／-、TLR9-／-和MyD88-／-小鼠10 mg／kg治療，其療效與野生型相似，表明高濃度卡泊芬凈不依賴上述信號通路。高濃度米卡芬凈的抗真菌作用也體現(xiàn)在炎性反應(yīng)因子的表達(dá)上，10 mg／kg治療下Dectin-1-／-、TLR2-／-、TLR3-／-、TRIF-／-小鼠IL-10減少，除TLR3-／-小鼠外，其余小鼠促炎因子TNF-α增加。而TLR4-／-、TLR9-／-和MyD88-／-小鼠中IL-10 和TNF-α與野生組無差異。綜上，作者認(rèn)為，TLR2／Dectin-1 和TLR3／TRIF信號通路參與米卡芬凈的抗炎反應(yīng)［25］。

3 唑類藥物與TLR

有限的研究數(shù)據(jù)表明唑類藥物也觸發(fā)TLR 介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。Salvenmoser等［22］予伏立康唑預(yù)處理人中性粒細(xì)胞后感染煙曲霉致TLR2、TLR4、TLR9 表達(dá)上 調(diào)。Simitsopoulou 等［17］研究表 明THP-1單核細(xì)胞予煙曲霉及伏立康唑處理，均可誘發(fā)不同程度的抗真菌應(yīng)答：單獨給予煙曲霉菌絲或伏立康唑都可致THP-1細(xì)胞TLR2和TNF-α表達(dá)增加，且伏立康唑單獨作用效果強(qiáng)于煙曲霉菌絲單獨作用；二者共同刺激THP-1時TLR2和TNF-α增加最明顯。然而，無論是煙曲霉菌絲或伏立康唑單獨或聯(lián)合應(yīng)用都不能增加TLR4表達(dá)。此外，伏立康唑單獨刺激THP-1細(xì)胞致NF-κB核移位增多，強(qiáng)于煙曲霉菌絲的單獨作用；但同時給予伏立康唑和煙曲霉菌絲致NF-κB核移位量最多［17］。綜上，該研究證實伏立康唑激活TLR2信號通路、TNF-α和NF-κB，在應(yīng)對煙曲霉感染時通過免疫調(diào)節(jié)進(jìn)而增強(qiáng)應(yīng)答效力。

4 結(jié)語

兩性霉素B、棘白菌素類、唑類藥物三類抗真菌藥物的作用機(jī)制早已證實，但其通過觸發(fā)TLR 及其信號通路，以協(xié)同作用的方式增強(qiáng)固有免疫應(yīng)答、共同清除真菌感染的作用機(jī)制為抗真菌藥物的免疫治療提供新的思路，但目前尚缺乏臨床轉(zhuǎn)化研究。本文綜述了抗真菌藥物在體內(nèi)、體外實驗中對固有免疫調(diào)節(jié)作用的研究進(jìn)展，對于今后探索抗真菌藥物的免疫治療提供一定依據(jù)。

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