不同目標(biāo)血糖管理對膿毒癥大鼠肝臟損傷的影響

曾建瓊，程青虹，何永來，齊 研

膿毒癥是重癥監(jiān)護病房（ICU）最為常見的疾病，隨著病情發(fā)展，機體各臟器會受到不同的損傷，肝臟是膿毒癥狀態(tài)下最易受累的器官之一，肝功能不全是膿毒癥發(fā)展為多器官衰竭的早期表現(xiàn)之一［1］。肝臟中特有分布的肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶1（liver carnitine palmitoyltransferase 1，L-CPT-1）在病理狀況下對肝臟脂肪酸氧化有重要作用。L-CPT-1是決定長鏈脂酰輔酶A 轉(zhuǎn)入線粒體的限速步驟，并接受過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPAR-α）的調(diào)控［2］。高血糖是膿毒癥患者死亡危險因素，早期強化胰島素治療嚴(yán)格控制患者的血糖可降低其病死率［3］。本研究觀察胰島素控制不同目標(biāo)血糖水平對膿毒癥大鼠轉(zhuǎn)氨酶、血脂及肝臟中PPAR-α和L-CPT-1表達的影響，探討目標(biāo)血糖管理對膿毒癥肝損傷是否具有保護作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和儀器

40只SPF級健康雄性成年SD 大鼠，體重（300±20）g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗中心提供；游離脂肪酸（FFA）試劑盒，購自南京建成生物公司，批號A042；PPAR-a抗體，購自武漢博士德生物工程公司，批號10L180；CPT-1抗體，購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，批號MS1070；速效胰島素，國藥準(zhǔn)字H32020614，效價400 u／10 mL，由江蘇萬邦生物醫(yī)藥公司生產(chǎn)；乳酸鈉林格液，國藥準(zhǔn)字H20057107，由山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。使用的儀器包括：快速血糖儀（美國強生醫(yī)療器材有限公司）、WZS-50F6型微量注射泵（北京恒奧德儀器儀表有限公司）和Automatic analyzer7600-110 型生化分析儀（日本Olympus公司）。

1.2 動物分組及模型制備

1.2.1 實驗分組 40只SD 大鼠，隨機分為5組：假手術(shù)組僅做開、關(guān)腹處理；膿毒癥組給予手術(shù)后微量泵靜脈泵入與各血糖控制組等容量生理鹽水；膿毒癥血糖控制A 組、B組和C組分別為造模成功后血糖控制在4.4～6.1 mmol／L、6.2～8.3 mmol／L和8.4～10.0mmol／L水平。胰島素用法：15 u加生理鹽水20 mL，微量泵靜脈泵入，以快速血糖儀檢測血糖水平，及時調(diào)整微量泵速度。

1.2.2 膿毒癥大鼠模型建立 所有大鼠術(shù)前禁食12 h，不禁水，戊巴比妥鈉100 mg／kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定。頸、腹部備皮，右頸外靜脈置管用于輸液，以改良的盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)法制備大鼠膿毒癥模型。盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)具體方法：中、下腹正中切口2 cm，盲腸根部結(jié)扎，自制穿孔針在距盲腸末端1 cm 處戳孔，直徑0.5 cm，擠出約黃豆粒大小糞便，結(jié)扎離斷雙側(cè)大網(wǎng)膜，縫合關(guān)閉腹腔。術(shù)后立即皮下注射乳酸鈉林格液50 mL／kg，所有大鼠經(jīng)靜脈給予營養(yǎng)支持（蛋白質(zhì)占總供能的22.4%，脂肪占11.8%，碳水化合物占65.8%的比例配置［4］。模型成功標(biāo)準(zhǔn)：可達到動物全身炎性反應(yīng)綜合征參照標(biāo)準(zhǔn)［5］，且經(jīng)組織病理觀察可見膿毒性肝臟損傷。

1.3 標(biāo)本采集與處理

各組大鼠造模后12 h，分別作以下處理：①從右頸外靜脈取血1 mL，3 000 r／min，室溫下離心15 min后取血清分裝后存放于-80℃冰箱，以備檢測相應(yīng)指標(biāo)；②各組大鼠斷頭處死，迅速開腹留肝臟標(biāo)本2份，4%甲醛固定。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 肝功能及血脂檢測 采用Automatic analyzer7600-110 型生化分析儀檢測各組血清樣本中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）和FFA 的水平，F(xiàn)FA 的檢測嚴(yán)格按照檢測說明書操作。

1.4.2 肝臟病理形態(tài)學(xué)分析 將肝臟組織從4%甲醛中取出，行石蠟包埋、切片和HE 染色，觀察肝臟組織病理學(xué)改變及炎性細胞浸潤情況，參照文獻［6］的方法評判肝臟的病理損傷。

1.4.3 肝臟PPAR-α和CPT-1蛋白表達的檢測切片后免疫組化法染色，具體步驟：脫蠟、水化、抗原修復(fù)、顯色、復(fù)染、封片、鏡檢；采用平均陽性染色面積百分比法半定量分析PPAR-α及CPT-1 蛋白表達的部位及強弱。

1.5 統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，整體比較方差齊行單因素方差分析，方差不齊行秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝功能及血脂檢測

膿毒癥組與假手術(shù)組和各血糖控制組相比，ALT、AST 和FFA 的水平顯著增高（P＜0.05），A組較B、C 組明顯降低（P＜0.05），B 組低于C 組（P＜0.05），見表1。

2.2 肝組織病理學(xué)變化及組織病理評分分析

光鏡下假手術(shù)組肝小葉形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，肝小葉規(guī)則，肝細胞排列整齊，在中央靜脈周圍呈放射狀分布，肝細胞中央有大而圓的核，細胞質(zhì)均勻，未見脂肪變性和炎性細胞侵潤；膿毒癥組肝細胞損傷明顯比其他組嚴(yán)重，肝小葉結(jié)構(gòu)不清，細胞彌漫性水樣變性，脂肪變性明顯，肝血竇高度擴張充血，部分可見碎屑狀壞死，小葉內(nèi)及匯管區(qū)可見炎性細胞浸潤；而各血糖控制組上述病理變化亦存在，但較膿毒癥組明顯減輕，隨著血糖水平升高，其肝細胞水樣變性、脂肪變性、間質(zhì)炎性反應(yīng)及間質(zhì)充血均逐漸加重，A 組最輕，B 組次之，C 組最重，見圖1。根據(jù)參照文獻［6］的方法評判肝臟的病理損傷評分標(biāo)準(zhǔn)，5組均沒有出現(xiàn)肝細胞彌漫壞死或者橋接壞死，且只在膿毒癥組出現(xiàn)了碎屑狀壞死。肝病理組織損傷總評分膿毒癥組均明顯高于假手術(shù)組及各血糖控制組（P＜0.05），A 組較B、C 組明顯降低（P＜0.05），B組病理損傷評分低于C 組（P＜0.05）見表2。通過評分，與假手術(shù)組比較，血糖控制A、B、C 組及膿毒癥組，肝損傷程度呈逐漸加重趨勢。

表1 各組大鼠血清ALT、AST、FFA 的水平Table 1 Serum ALT，AST and FFA levels in rats after different interventions（mean±SD）

圖1 各組大鼠肝組織病理照片F(xiàn)igure 1 Pathological findings of liver damage in rats after different interventions（hematoxylin and eosin stain×400）

2.3 肝臟免疫組化染色分析PPAR-α、CPT-1蛋白表達部位及相對含量

陽性著色表現(xiàn)為胞質(zhì)染成棕黃色或棕褐色，CPT-1主要分布在匯管區(qū)及中央靜脈旁，見圖2。假手術(shù)組CPT-1 陽性細胞數(shù)分布在匯管區(qū)及中央靜脈旁，表達量較高，染色強度2～3，陽性細胞數(shù)為70%，平均染色積分6.73±1.54；膿毒癥組CPT-1陽性細胞數(shù)分布在匯管區(qū)及中央靜脈旁，低表達，染色強度0～1，陽性細胞數(shù)為16%，平均染色積分0.73±0.45；血糖控制A 組CPT-1陽性細胞數(shù)分布在匯管區(qū)及中央靜脈旁，表達量高，染色強度2～3，陽性細胞數(shù)為45%，平均染色積分4.90±1.37；血糖控制B 組CPT-1陽性細胞數(shù)分布在匯管區(qū)及中央靜脈旁，表達量較高，染色強度1～2，陽性細胞數(shù)為70%，平均染色積分3.85±0.83；血糖控制C 組CPT-1陽性細胞數(shù)分布在匯管區(qū)及中央靜脈旁，表達量較低，染色強度1，陽性細胞數(shù)為20%，平均染色積分1.3±0.46。PPAR-α分布在全小葉肝細胞，見圖3。假手術(shù)組PPAR-α陽性細胞數(shù)分布在全小葉肝細胞，表達量較高，染色強度3，陽性細胞數(shù)為70%，平均染色積分6.70±1.34；膿毒癥組PPAR-α陽性細胞數(shù)分布在匯管區(qū)及中央靜脈旁，表達量低，染色強度2～3，陽性細胞數(shù)為24%，平均染色積分2.10±1.55；血糖控制A 組PPAR-α陽性細胞數(shù)分布在全小葉肝細胞，表達量高，染色強度2，陽性細胞數(shù)為65%，平均染色積分5.55±0.85；血糖控制B組PPAR-α陽性細胞數(shù)分布在全小葉肝細胞，以匯管區(qū)表達明顯，表達量高，染色強度1，陽性細胞數(shù)為55%，平均染色積分3.03±1.15；血糖控制C組PPAR-α陽性細胞數(shù)分布在全小葉肝細胞，以中央靜脈周圍區(qū)表達明顯，表達量高，染色強度1，陽性細胞數(shù)為40%，平均染色積分2.33±0.69。膿毒癥組肝組織CPT-1及PPAR-α的表達明顯低于各血糖控制組，但與C組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），A組較B、C組明顯增高（P＜0.05），B組高于C組（P＜0.05），見表2。

圖2 各組大鼠肝臟CPT-1表達免疫組化染色照片F(xiàn)igure 2 Expression of liver carnitine palmitoyltransferase 1in rats after different interventions（immunohistochemical stain，×400）

圖3 各組大鼠肝臟PPAR-α表達免疫組化染色照片F(xiàn)igure 3 Expression of PPAR-αin liver of rats after different interventions（immunohistochemical stain，×400）

表2 各組大鼠CPT-1、PPAR-α及肝病理損傷評分的表達Table 2 Expression levels of CPT-1 and PPAR-αin the liver of rats and liver damage score after different interventions（mean±SD）

3 討論

膿毒癥是感染所致的全身炎性反應(yīng)綜合征，嚴(yán)重感染誘發(fā)膿毒癥，機體多處于應(yīng)激狀態(tài)，代謝發(fā)生劇烈的變化，表現(xiàn)為血糖升高、脂肪動員增強、蛋白質(zhì)分解增強［7］。在脂代謝方面，F(xiàn)FA 增多，F(xiàn)FA 主要參與氧化供能。本實驗通過盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)，制造與臨床感染相似的膿毒癥動物模型，組織病理學(xué)分析及血清ALT、AST、FFA水平測定觀察肝組織損傷的嚴(yán)重程度，結(jié)果表明膿毒癥組ALT、AST、FFA 較假手術(shù)組顯著增高，而且病理變化顯著，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細胞彌漫性水腫、脂肪變性，部分壞死，大量炎性細胞浸潤，這提示已造成一定程度的肝損傷。

CPT-1位于線粒體內(nèi)膜，是脂肪酸β氧化的限速酶。目前在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)CPT-1至少有2 種亞型：肝型（L-CPT-1）和心臟／肌肉型（M-CPT-1）。肝臟中主要表達L-CPT-1，有過氧化酶體增殖物調(diào)控元件（PPRE）結(jié)構(gòu)［8］。PPAR 是核激素受體超家族成員，是配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，分α、β、γ3種亞型［9］，肝臟是調(diào)節(jié)機體能量代謝的重要器官，3 種PPAR 在肝臟均有不同程度的表達，其中PPAR-α表達最為豐富，肝臟PPAR-α在血脂代謝中發(fā)揮重要作用，PPAR-α可被飽和或不飽和脂肪酸激活，在調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)、炎性反應(yīng)、免疫、纖維化、凋亡等方面發(fā)揮著重要作用［10-12］。盡管多項研究表明PPAR-α具有明確的抗炎作用，但在炎性反應(yīng)作為其主要病生理機制的膿毒癥肝損傷的發(fā)生發(fā)展過程中，PPAR-α的作用及機制目前尚無研究報道。PPAR-α主要表達于高脂肪酸β 氧化的組織，如肝臟、心臟、腎臟、骨骼肌、褐色脂肪組織，PPAR 被激活后可通過調(diào)節(jié)脂代謝相關(guān)酶類，如肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶I、脂酰輔酶A 脫氫酶、脂酰輔酶A 氧化酶的基因表達，促進脂質(zhì)分解以及脂肪酸的攝取、氧化和利用［13-14］。肝臟是氧化分解脂肪酸的主要場所，脂肪酸β-氧化可以供應(yīng)機體所需要的大量能量，當(dāng)脂肪酸β-氧化受損時，勢必影響能量的產(chǎn)生。此外，脂肪酸β-氧化受限會使游離脂肪酸在肝細胞內(nèi)堆積，進而導(dǎo)致肝脂肪變性、肝細胞壞死，從而影響肝功能［15］。肝臟中的CPT-1受PPAR-α調(diào)節(jié)，PPAR-α調(diào)控CPT-1 mRNA 表達的上 游基因，PPAR-α 被FFA 激活后將誘導(dǎo)L-CPT-1mRNA 的 表達，增 加L-CPT-1的合成，促進脂肪酸β氧化，減少脂肪酸在肝細胞內(nèi)的沉積，減輕肝細胞的脂肪變性［16］。本實驗結(jié)果顯示，膿毒癥組大鼠較各血糖控制組大鼠的PPAR-α和CPT-1的表達顯著降低，F(xiàn)FA 明顯升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示在膿毒癥狀態(tài)下，隨著炎性反應(yīng)加重，肝臟受損程度加重，PPAR-α和L-CPT-1表達明顯下降。PPAR-α和L-CPT-1的低表達，直接影響了脂肪酸轉(zhuǎn)運進入線粒體過程的進行，已進入細胞的脂肪酸及其活化產(chǎn)物脂酰輔酶A 沉積在胞漿內(nèi)，在線粒體的外膜外難以順暢地進入線粒體基質(zhì)中進行β氧化以實現(xiàn)能量生成，最終導(dǎo)致肝細胞出現(xiàn)脂肪變性，肝細胞水腫明顯，部分肝細胞壞死，炎性細胞浸潤，ATP 生成減少，能量代謝出現(xiàn)異常，糖原異生增多，進而肝功能異常，最終導(dǎo)致肝臟損傷。

高糖血癥是危重癥患者尤其是膿毒血癥患者常見的一種癥狀，高血糖對膿毒血癥患者產(chǎn)生不利影響，有研究顯示，高血糖持續(xù)時間與患者病情嚴(yán)重程度呈明顯正相關(guān)［17-18］。究其原因可能與以下因素有關(guān)：①持續(xù)高血糖影響巨噬細胞、中性粒細胞的功能，并損傷部分皮膚屏障的營養(yǎng)作用，從而增加了患者繼發(fā)感染的發(fā)病風(fēng)險，如果患者原發(fā)病較重，則感染一旦發(fā)生便難以控制；②高血糖可以促進機體內(nèi)的炎性反應(yīng)，加速膿毒癥患者病情的發(fā)展；③高血糖可直接影響重要臟器組織的修復(fù)功能。因此，改善膿毒癥患者的高血糖狀態(tài)對于疾病的治療極為重要。然而，常規(guī)胰島素治療對此類患者血糖水平的控制效果不佳，療效較差。因此，近年來，胰島素強化治療的觀點受到了國內(nèi)外廣大學(xué)者的重點關(guān)注。有學(xué)者認為，胰島素強化治療可以降低患者的病死率，改善患者的預(yù)后［19］。強化胰島素治療的主要目標(biāo)是要將血糖快速控制在一個理想的范圍內(nèi)，但對血糖水平控制的目標(biāo)范圍仍存在爭議。本研究采用完全隨機對照實驗設(shè)計，觀察目前爭議較集中的3個血糖控制水平對膿毒癥肝臟損傷的影響，結(jié)果顯示，各血糖控制組與膿毒癥組比較，AST、ALT 及FFA 明顯下降，且CPT-1及PPAR-α的表達增高，表明強化胰島素治療可明顯減輕肝臟功能的損傷及改善脂代謝。光鏡觀察可見各血糖控制組與膿毒癥組比較，肝臟病理損傷程度明顯減輕，進一步證實了強化胰島素治療可保護膿毒癥的肝臟損傷，肝臟病理損傷評分的比較證實了這些改變具有統(tǒng)計學(xué)意義。在3個不同血糖控制組間，隨著血糖水平升高，肝臟結(jié)構(gòu)與功能的損傷程度有加重趨勢，表明血糖控制水平不同，對膿毒癥肝損傷的保護效果不同，其中A 組的保護作用明顯優(yōu)于B、C組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，B組又優(yōu)于C 組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明血糖控制在4.4～6.1 mmol／L 保護作用最強。其機制可能為胰島素抑制了內(nèi)毒素和炎性因子的釋放，改善了膿毒癥肝臟的結(jié)構(gòu)及功能損傷，加速了FFA 的轉(zhuǎn)運，促進了PPAR-α和L-CPT-1的表達，從而促進了脂肪酸的β氧化。

綜上所述，我們可以認為：強化胰島素治療可能通過上調(diào)PPAR-α和CPT-1的表達，減輕膿毒癥的肝損傷，而血糖控制在4.4～6.1 mmol／L 對膿毒癥大鼠肝臟損傷保護作用最明顯，CPT-1和PPAR-α可能成為臨床上防治膿毒癥肝損傷的一個新的、重要的靶點。

［1］Kallinen O，Maisniemi K，B?hling T，et al.Multiple organ failure as a cause of death in patients with severe burns［J］.J Burn Care Res，2012，33（2）：206-211.

［2］Schoonjans K，Staels B，Auwerx J.Role of the peroxisome proliferator-activated receptor（PPAR）in mediating the effects of fibrates and fatty acids on gene expression［J］.J Lipid Res，1996，37（5）：907-925.

［3］Leonidou L，Michalaki M，Leonardou A，et al.Stressinduced hyperglycemia in patients with severe sepsis：a compromising factor for survival［J］.Am J Med Sci，2008，336（6）：467-471.

［4］李明龍，趙家軍，王明雁，等.長期蛋白飼養(yǎng)對正常大鼠葡萄糖刺激的胰島素分泌的影響［J］.山東大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2007，45（10）：977-980.

［5］盛志勇，胡森.多器官功能障礙綜合征［M］.北京，科學(xué)出版社，1999：18-63.

［6］Xie K，Yu Y，Zhang Z，et al.Hydrogen gas improves survival rate and organ damage in zymosan-induced generalized inflammation model［J］.Shock，2010，34（5）：495-501.

［7］陳淼，戴李華，盛穎.膿毒癥的三大物質(zhì)代謝變化和營養(yǎng)支持原則［J］.中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2007，16（6）：668-669.

［8］Rakhshandehroo M，Knoch B，Müller M，et al.Peroxisome proliferator-activated receptor alpha target genes［J］.PPAR Res，2010：612089.

［9］Kota BP，Huang TH，Roufogalis BD.An overview on biological mechanisms of PPARs［J］.Pharmacol Res，2005，51（2）：85-94.

［10］Contreras AV，Torres N，Tovar AR.PPAR-αas a key nutritional and environmental sensor for metabolic adaptation［J］.Adv Nutr，2013，4（4）：439-452.

［11］Roberts RA，Chevalier S，Hasmall SC，et al.PPARαand the regulation of cell division and apoptosis［J］.Toxicology，2002，181-182：167-170.

［12］Crisafulli C，Cuzzocrea S.The role of endogenous and exogenous ligands for the peroxisome proliferator-activated receptor alpha（PPAR-α）in the regulation of inflammation in macrophages［J］.Shock，2009，32（1）：62-73.

［13］Song S，Attia RR，Connaughton S，et al.Peroxisome proliferator activated receptor alpha（PPAR alpha）and PPAR gamma coactivator（PGC-1 alpha）induce carnitine palmitoyltransferase IA（CPT-1A）via independent gene elements［J］.Mol Cell Endocrinol，2010，325（1-2）：54-63.

［14］Seo YS，Kim JH，Jo NY，et al.PPAR agonists treatment is effective in a nonalcoholic fatty liver disease animal model by modulating fatty-acid metabolic enzymes［J］.J Gastroenterol Hepatol，2008，23（1）：102-109.

［15］Kneiseler G，Bachmann HS，Bechmann LP，et al.A rare case of propofol-induced acute liver failure and literature review［J］.Case Rep Gastroenterol，2010，4（1）：57-65.

［16］Musso G，Gambino R，Cassader M.Recent insights into hepatic lipid metabolism in non-alcoholic fatty liver disease（NAFLD）［J］.Prog Lipid Res，2009，48（1）：1-26.

［17］Gordon BS，Kelleher AR，Kimball SR.Regulation of muscle protein synthesis and the effects of catabolic states［J］.Int J Biochemi Cell Biol，2013，45（10）：2147-2157.

［18］閆柏剛，任小寶，趙曉東，等.胰島素強化治療對嚴(yán)重?zé)齽?chuàng)傷患者傷后蛋白質(zhì)代謝的影響［J］.燒傷外科雜志，2013，29（2）：181-184.

［19］劉漢成，周巖冰，陳棟，等.胰島素強化治療對胃癌根治術(shù)患者靜息能量代謝的影響［J］.中華外 科雜志，2011，49（9）：789-794.