水貂沙門(mén)氏菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

王海龍 秦國(guó)棟（山東省諸城市積溝畜牧獸醫(yī)站 262200）張敏敏（山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 271000）

水貂沙門(mén)氏菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

王海龍 秦國(guó)棟（山東省諸城市積溝畜牧獸醫(yī)站 262200）張敏敏（山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 271000）

目前，規(guī)模化養(yǎng)貂場(chǎng)一般采用抗生素治療水貂沙門(mén)氏菌病。但是由于抗生素的濫用以及不當(dāng)?shù)姆?，?dǎo)致細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，造成用藥浪費(fèi)，延誤水貂病情，使養(yǎng)殖戶(hù)遭受巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本試驗(yàn)通過(guò)藥物敏感性試驗(yàn)，為選用有效抗生素提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料來(lái)源

60只病死水貂樣本均來(lái)源于諸城市大森林養(yǎng)殖基地。臨床主要表現(xiàn)病初水貂不進(jìn)食，情緒也不穩(wěn)定，體溫增加，一般為41～42℃，并伴有呼吸困難；部分水貂伴有嘔吐和腹瀉，或者輕微的黃疸癥狀。大部分水貂出現(xiàn)上述癥狀一段時(shí)間內(nèi)就死亡。也有的水貂出現(xiàn)持續(xù)性腹瀉，糞便帶有血液；有的患貂出現(xiàn)化膿性結(jié)膜炎；咳嗽或嘔吐。有的水貂發(fā)出痛苦的叫聲，突然就昏迷抽搐，四肢做游泳狀滑動(dòng)。發(fā)病的水貂出現(xiàn)水腫癥狀。個(gè)別的貂沒(méi)有癥狀突然死亡。尸體消瘦，可視膜蒼白；肺臟萎縮、表面有黑色壞死斑，嚴(yán)重出血；心代償性增大；肝臟輕微腫大，表面有針尖大小出血點(diǎn)；胃干癟，粘膜脫落；腸系膜毛細(xì)血管充血；腸粘膜出血、脫落；脾臟輕微腫大，被膜緊張；腎臟稍微腫大，呈灰紅黃色被膜下有點(diǎn)狀出血。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

顯色培養(yǎng)基 （購(gòu)自青島海博生物公司； 批號(hào)：20130301）、膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基（DHL）（購(gòu)自上海一基生物科技有限公司；批號(hào)：20130311）、沙門(mén)菌屬志賀菌屬瓊脂 （SS）（購(gòu)自北京九州天瑞科技有限公司； 批號(hào)：20130312）、三糖鐵瓊脂 (TSI）（購(gòu)自上?？婆d生物科技有限司；批號(hào)：20130115）、生化常規(guī)微量鑒定管（購(gòu)自上海麗臣生物科技有限公司；批號(hào)：20130119）等。

1.1.3 藥敏試驗(yàn)紙片

由諸城市畜牧獸醫(yī)管理局實(shí)驗(yàn)室制作。

1.2 試驗(yàn)儀器

HT-SDC(SW-CJ-2F）超潔凈工作臺(tái)（濟(jì)南昊天科技發(fā)展有限公司）、MLS-3780高壓滅菌鍋（杭州亞旭生物科技有限公司）、DHP-9602恒溫培養(yǎng)（杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司）、冰箱、常用玻璃器皿等。

2 試驗(yàn)方法

2.1 病原菌分離鑒定

2.1.1 各種培養(yǎng)基的制備

顯色培養(yǎng)基、膽鹽硫乳瓊脂、三糖鐵瓊脂、按常規(guī)進(jìn)行配制，無(wú)菌檢查后，4℃保存?zhèn)溆肹1]。

2.1.2 涂片及染色

取采集的肺臟、肝臟、脾臟和腎臟病料刮取物涂片，干燥，革蘭氏染色。將抹片置于空氣中自然干燥；火焰固定，將已干燥的抹片菌膜向上，在火焰上緩緩來(lái)回通過(guò)3次（用手背觸及玻片反面，以不燙手為宜）。染色：①初染，在固定的抹片上，滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液染色1～2min，水洗。②媒染，再加革蘭氏碘溶液于抺片上，助染1～2min，水洗。③脫色，用95%酒精滴于載玻片上脫色約30s。應(yīng)將載玻片不時(shí)搖動(dòng)，至無(wú)色素脫下為止，水洗。④復(fù)染，用沙黃染液復(fù)染1min，水洗。⑤吸干或自然干燥。鏡檢觀察[2]。

2.1.3 分離培養(yǎng)與觀察

取采集的肺臟、肝臟、脾臟和腎臟病料刮取物，接種于顯色培養(yǎng)基、膽鹽硫乳瓊脂平板和SS營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況及菌落特征；同時(shí)，將上述內(nèi)臟組織樣本勻漿后制成懸液，將組織懸液樣本及上述血樣本分別接種于普通瓊脂平板37℃常規(guī)24h。待培養(yǎng)完畢后，再分離單獨(dú)菌落得到純培養(yǎng)物。挑選可疑的單菌落劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況及菌落特征，然后單個(gè)菌落抹片，進(jìn)行革蘭氏染色、顯微鏡觀察。從鑒別培養(yǎng)基上挑取2～3個(gè)疑似菌落接種于三糖鐵瓊脂斜面并刺穿至底層，在恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24h，觀察結(jié)果。

2.1.4 生化試驗(yàn)

用接種環(huán)從營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中挑選出具有代表性的菌落與微量發(fā)酵管中，置37℃培養(yǎng)12h觀察其生長(zhǎng)情況。甲基紅（MR試驗(yàn)）：用接種環(huán)從營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中挑選出具有代表性的菌落，接種到葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)管中培養(yǎng)36～48h，加入MR試劑5滴左右，觀察其變化。靛基質(zhì)試驗(yàn)：用接種環(huán)從營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中挑選出具有代表性的菌落，接種到蛋白胨水培養(yǎng)基中培養(yǎng)24～48h，試管中加入靛基質(zhì)數(shù)滴搖動(dòng)試管，觀察其變化情況。硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)：用接種環(huán)取少量培養(yǎng)物，接種到培養(yǎng)基中培養(yǎng)24～48h，觀察其變化。V-P試驗(yàn)：取一支葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)管先加V-P試劑甲液（6%的甲萘酚酒精溶液）3ml，再加V-P乙液（40%KOH溶液），充分搖勻靜止數(shù)分鐘，觀察其變化情況。

2.2 藥敏試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，將細(xì)菌均勻涂布在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，再將配制好的藥敏片貼于平板上，放在37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h后，測(cè)量?jī)蓚€(gè)平板上的抑菌圈直徑，取其平均值，結(jié)果判斷判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌直徑＜10mm為耐藥；抑菌直徑10～15mm為中度敏感；抑菌直徑15～20mm為高敏；抑菌直徑≥20mm為極敏。

3 試驗(yàn)結(jié)果及分析

3.1 涂片染色結(jié)果

革蘭氏染色之后，在油鏡下觀察可見(jiàn)大量?jī)啥蒜g圓、短小的革蘭氏陰性小桿菌，無(wú)芽孢，無(wú)莢膜。

3.2 分離培養(yǎng)結(jié)果

在顯色培養(yǎng)基上呈紫色；而SS瓊脂平板上呈圓形、微凸、邊緣整齊小菌落，菌落為白色半透明；另外在DHL瓊脂平板上呈圓形、微凸、邊緣整齊黑色的小菌落。分離菌株在三糖鐵瓊脂斜面中產(chǎn)酸、斜面變紅。

3.3 生化試驗(yàn)結(jié)果

該菌能分解葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇，不分解乳糖、蔗糖，靛基質(zhì)試驗(yàn)呈陰性，MR試驗(yàn)陽(yáng)性，V-P試驗(yàn)陰性，不分解尿素，能利用枸櫞酸鈉。

3.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

該沙門(mén)氏菌對(duì)環(huán)丙沙星、左旋氧氟沙星、克林霉素、頭孢曲松鈉為高敏，對(duì)萬(wàn)古霉素、硫酸粘菌素為中敏，對(duì)丁胺卡那霉素、氨芐西林、慶大霉素為低敏。

根據(jù)流行病學(xué)、病理剖檢變化及實(shí)驗(yàn)室診斷，可判斷該次疾病的流行是由沙門(mén)氏桿菌感染引起。根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，用0.5%鹽酸左旋氧氟沙星全群飲水治療，不能飲水的病貂肌肉注射頭孢曲松，經(jīng)3天的治療，病情得到有效的控制。

4 討論

（1）根據(jù)水貂的臨床癥狀、病理剖檢、細(xì)菌的分離鑒定和生化試驗(yàn)、判定水貂患病死亡是由于感染了沙門(mén)氏菌引起。

（2）由黃世娟等[3]人研究的雞沙門(mén)氏菌藥敏試驗(yàn)分離菌對(duì)壯觀霉素、卡那霉素、四環(huán)素高敏；對(duì)青霉素、利福平中敏；對(duì)環(huán)丙沙星、恩諾沙星、林可霉素低敏；對(duì)萬(wàn)古霉素、鏈霉素產(chǎn)生耐藥。由劉俊偉等[4]人研究的豬霍亂沙門(mén)氏菌對(duì)18種抗菌藥的敏感性試驗(yàn)豬霍亂沙門(mén)氏菌對(duì)左旋氧氟沙星、磷霉素鈉、頭孢噻呋敏感，對(duì)諾氟沙星和新霉素中敏，對(duì)頭孢唑啉、頭孢拉定、利福平、環(huán)丙沙星、卡那霉素、氨芐西林、慶大霉素、阿莫西林、恩諾沙星等耐藥。在趙波等[5]的研究中，其所分離多株沙門(mén)氏菌均表現(xiàn)出不同耐藥性，而其中羧芐西林的耐藥率最高。而本次藥敏試驗(yàn)結(jié)果與上述結(jié)果有一定的出入，這可能與不同養(yǎng)殖場(chǎng)用藥習(xí)慣有關(guān)。

（3）通過(guò)多次對(duì)諸城大森林養(yǎng)殖基地調(diào)查研究，養(yǎng)殖場(chǎng)備有大量的丁胺卡那霉素、氨芐西林、慶大霉素。養(yǎng)殖場(chǎng)人員在水貂發(fā)病時(shí)，并沒(méi)有做藥物敏感試驗(yàn)而盲目的濫投藥，致使本次試驗(yàn)中對(duì)丁胺卡那霉素、氨芐西林、慶大霉素低敏，正是因?yàn)轲B(yǎng)殖場(chǎng)用藥習(xí)慣使沙門(mén)氏菌產(chǎn)生耐藥的結(jié)果。

（4）通過(guò)多次試驗(yàn)采取對(duì)癥治療辦法具有一定的輔助治療作用，對(duì)體溫過(guò)高的水貂直腸給藥清瘟敗毒散；對(duì)腹瀉不止的可用烏梅散開(kāi)水沖調(diào)，候溫灌服；對(duì)水腫的病貂可將五苓散伴水飼喂具有較好的治療效果。

[1]胡桂學(xué).獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2006（9）:22-28.

[2]黃世娟,陳進(jìn)喜,彭定兵,等.雞沙門(mén)氏菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].廣西畜牧獸醫(yī),2011,27（4）:213-215.

[3]楊曉潔.梅花鹿單核細(xì)胞增生性李氏桿菌病的診治[J].畜牧與獸醫(yī),2007,39（7）:48.

[4]俊偉,張海棠,張志鵬,等.規(guī)?；i場(chǎng)豬霍亂沙門(mén)氏菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,40（4）:146-148.

[5]趙波,李波,王強(qiáng),等.靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物腸道沙門(mén)氏菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2013,40（1）:164-167.

王海龍（1963-），男，獸醫(yī)師，專(zhuān)科。

張敏敏（1989-），女，碩士研究生。