急性心肌梗死患者不同時期外周血LXA 4與CD 4+CD 25+CD 127-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平及相關(guān)性研究

柳洪杰 劉魯濱

1.北京市北安河社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心心血管內(nèi)科，北京100095;2.北京大學(xué)醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京100095

急性心肌梗死患者不同時期外周血LXA 4與CD 4+CD 25+CD 127-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平及相關(guān)性研究

柳洪杰1劉魯濱2

1.北京市北安河社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心心血管內(nèi)科，北京100095;2.北京大學(xué)醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京100095

目的通過檢測急性心肌梗死患者不同時期外周血脂氧素A4(LXA4)與CD4+CD25+CD127-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)水平，研究LXA4在急性心肌梗死患者中的作用及機制，探討其在此類疾病發(fā)病及預(yù)后中的作用。方法采用流式細(xì)胞分析法和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，檢測58例急性心肌梗死患者(AMI組)及30名健康體檢者(對照組)入院及48 h后外周血LXA4、CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞水平，并進行相關(guān)性分析。結(jié)果AMI患者入院時外周血CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞占CD4+CD25+T細(xì)胞的百分率顯著低于入院48 h及對照組(P＜0.05或P＜0.01);AMI患者入院48 h后的外周血CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞占CD4+CD25+T細(xì)胞的百分率顯著高于對照組(P＜0.01)。AMI患者入院時血漿LXA4水平顯著高于48 h后及對照組(P＜0.01或P＜0.05);AMI患者入院48 h后血漿LXA4水平顯著高于對照組(P＜0.01);AMI患者血漿LXA4水平與CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞百分率呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.738，P=0.002)。結(jié)論CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞及LXA4均在急性心肌梗死的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的免疫調(diào)節(jié)作用，在心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷中起到了保護細(xì)胞的作用。

急性心肌梗死;脂氧素A4;CD 4+CD 25+CD 127-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

冠心病的病理基礎(chǔ)為冠狀動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)及斑塊形成。炎癥機制在動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演重要角色［1］。炎癥細(xì)胞在不穩(wěn)定斑塊中積聚，釋放高水平的炎癥因子，誘導(dǎo)一系列的瀑布事件來放大免疫細(xì)胞浸潤，導(dǎo)致斑塊破裂，繼而引起急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)。研究表明，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)可能在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用［2］。炎癥的消退過程也和炎癥的發(fā)生一樣是個主動和程序化過程，內(nèi)源性炎癥消退機制成為近年來炎癥研究的新熱點［3］。近年來人們發(fā)現(xiàn)一類內(nèi)源性化學(xué)介質(zhì)，即特殊的促消退介質(zhì)(specialized pro-re-solving mediators，SPM)，脂氧素(lipoxin，LX)是其中研究的比較多的一種內(nèi)源性調(diào)節(jié)抗炎和促消退過程的關(guān)鍵介質(zhì)［4］，其分子結(jié)構(gòu)中有3個羥基和4個共軛雙鍵，包括LXA和LXB兩類。LXA4能降低炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，抑制中性粒細(xì)胞的趨化與活化，是重要的調(diào)節(jié)炎癥消退的抗炎介質(zhì)［5］。本研究通過測定急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)患者不同時期外周血脂氧素A4(LXA4)與CD4+CD25+CD127+Treg細(xì)胞水平，研究LXA4在AMI患者中的作用及機制，探討其在此類疾病發(fā)病及預(yù)后中的作用，從而為AMI治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機選擇2010～2014年于北京海淀醫(yī)院住院的58例AMI患者(AMI組)，其中，男35例，女24例;平均年齡(56.23±12.18)歲。選擇同期在北京海淀醫(yī)院進行健康體檢正常者(對照組)30名，其中，男19名，女性11名，平均年齡(58.61±10.14)歲。AMI患者均結(jié)合臨床行心肌酶、肌鈣蛋白Ⅰ等生化標(biāo)志物及冠狀動脈造影檢查確診。心肌梗死依據(jù)WHO診斷標(biāo)準(zhǔn):①典型胸痛癥狀持續(xù)＞30 min;②特征性心電圖變化;③心肌酶譜異常且有動態(tài)變化;3項中具有2項即可認(rèn)定。所有確診患者都采取相似的基礎(chǔ)藥物治療方案:阿司匹林、氯吡格雷、硝酸酯類、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑或血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑、利尿劑、β受體阻滯劑、鈣拮抗劑、他汀類藥物等。排除標(biāo)準(zhǔn):①嚴(yán)重心力衰竭、心肌病、心肌炎、心內(nèi)膜炎、先天性心臟病等其他心臟病;②風(fēng)濕性、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病或使用免疫抑制劑(如皮質(zhì)類固醇);③惡性腫瘤;④妊娠;⑤急、慢性感染，炎癥性疾病;⑥糖尿病、甲狀腺功能亢進癥或其他內(nèi)分泌疾病，近期使用過影響免疫反應(yīng)的藥物;⑦近期重大外傷及外科手術(shù)、近期消化道出血、出血性疾病、貧血者;⑧周圍血管疾病或周圍血管栓塞性疾病、腦卒中;⑨嚴(yán)重肝腎功能不全。所有患者均簽署了知情同意書。同時，剔除住院期間出現(xiàn)心力衰竭、心源性休克、再發(fā)心肌梗死、伴血流動力學(xué)障礙的心律失常、伴有心電圖缺血證據(jù)的心絞痛、心源性死亡等情況。兩組性別、年齡等一般情況比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 儀器與試劑

FC500型流式細(xì)胞儀為美國貝克曼庫爾特有限公司產(chǎn)品。主要試劑:人Treg染色試劑盒;異硫氰熒光素(FITC)標(biāo)記的鼠抗人單克隆抗體CD4 mAb(抗CD4 mAb)，規(guī)格100t;藻青蛋白-花青苷(PC5)標(biāo)記的鼠抗人單克隆抗體CD25 mAb(抗CD25 mAb)，規(guī)格100t;藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的鼠抗人單克隆抗體CD127 mAb(抗CD127 mAb)規(guī)格100t;購于美國eBioscienee公司。LXA4試劑盒購自美國A&D公司。

1.3 檢測方法

分別采集AMI患者入院時及48 h后清晨空腹靜脈血兩管，共5～8 mL(每管3～4 mL)。同時抽取對照組空腹靜脈血。LXA4測定:肝素抗凝，30min內(nèi)常規(guī)離心，分離血清，血清標(biāo)本凍存于-80℃超低溫冰箱待測。采用酶聯(lián)免疫吸附法的夾心法嚴(yán)格按照試劑說明書檢測。CD4+CD25+CD127-Treg表達(dá)率測定:EDTA抗凝，使用直接免疫熒光標(biāo)記法標(biāo)記細(xì)胞并進行流式細(xì)胞儀分析。操作步驟:取單克隆抗體CD4-FITC、CD25-PC5、CD127-PE及同型對照各20μL，加入100μL EDTA抗凝的外周血，室溫下避光孵育15 min，再加入紅細(xì)胞裂解液500μL，避光孵育10min;加入PBS洗2次，1500 r/min離心5 min，棄上清后加入適量PBS。流式細(xì)胞儀檢測并計算CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞百分率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，兩組間比較采用t檢驗;兩個正態(tài)分布的連續(xù)變量間相關(guān)關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析;以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AM I患者入院不同時期及對照組外周血CD 4+CD25+CD 127-Treg細(xì)胞占CD4+CD 25+T細(xì)胞的百分率及比較

AMI患者入院時外周血CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞占CD4+CD25+T細(xì)胞的百分率為(0.836±0.427)%，入院48 h后的外周血CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞占CD4+CD25+T細(xì)胞的百分率為(6.752±2.854)%，對照組外周血CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞占CD4+CD25+T細(xì)胞的百分率為(2.443±1.042)%。AMI患者入院時外周血CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞占CD4+CD25+T細(xì)胞的百分率顯著低于入院48 h及對照組(P＜0.05或P＜0.01);AMI患者入院48 h后的外周血CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞占CD4+CD25+T細(xì)胞的百分率顯著高于對照組(P＜0.01)。

2.2 AM I患者入院不同時期及對照組血漿LXA4水平及比較

AMI患者入院時外周血LXA4濃度為(32.851± 12.639)μg/L，入院48h后的外周血LXA4濃度為(16.471± 9.527)μg/L，對照組LXA4濃度為(7.142±5.918)μg/L。AMI患者入院時血漿LXA4水平顯著高于入院48 h后及對照組(P＜0.05或P＜0.01);AMI患者入院48 h后血漿LXA4水平顯著高于對照組(P＜0.01)。

2.3 相關(guān)性分析

AMI患者血漿LXA4水平與CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞百分率呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.738，P=0.002)。

3 討論

AS是一種炎癥性疾病，炎癥及免疫反應(yīng)在AS的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。AS斑塊形成是內(nèi)皮細(xì)胞損傷后炎性反應(yīng)的結(jié)果，機體存在精密地調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)的機制［6］。在冠狀動脈粥樣硬化中炎癥的激活不僅存在于血管病變，也包括活化外周血中的免疫細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)，尤其在AMI中不同的T細(xì)胞亞群在動脈粥樣硬化的進展中起著不同的作用［7］。CD4+CD25+Treg是一個具有獨特免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群，具有免疫抑制功能，它能通過分泌細(xì)胞因子及一系列信號通路介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)功能，在維持機體免疫平衡中起著重要作用［8］。LX是Serh在1984年發(fā)現(xiàn)的，是二十烷類家族中一類花生四烯酸的代謝產(chǎn)物，其分子結(jié)構(gòu)中有3個羥基和4個共軛雙鍵，包括LXA和LXB兩類。LXA4在感染、損傷和炎癥等過程中經(jīng)跨細(xì)胞途徑，由不同脂加氧酶(lipoxy genase，LO)順序催化花生四烯酸(arach idonic acid，AA)而合成。LXA4是脂加氧酶相互作用的產(chǎn)物，能降低炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，抑制中性粒細(xì)胞的趨化與活化，是重要的調(diào)節(jié)炎癥消退的抗炎介質(zhì)［9］。

AMI患者存在一種炎癥的高敏狀態(tài)，AMI患者炎癥通路的激活包括冠脈病變以及循環(huán)中的淋巴細(xì)胞比例改變，CD4+CD25+T細(xì)胞是其中最主要的一群。Foxp3是CD4+CD25+T細(xì)胞內(nèi)具有特征的標(biāo)志物，但是Foxp3定位在細(xì)胞內(nèi)且檢測過程復(fù)雜。近期發(fā)現(xiàn)，CD127(IL-7受體)與Foxp3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，因此在CD4+CD25+基礎(chǔ)上聯(lián)合CD127抗原的檢測，能夠很好地識別人CD4+CD25+T細(xì)胞［10］。本研究通過測定AMI患者不同時期外周血CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞占CD4+CD25+T細(xì)胞的百分率并與對照組進行分析比較，發(fā)現(xiàn)AMI患者入院時外周血CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞占CD4+CD25+T細(xì)胞的百分率顯著低于入院48 h及對照組，入院48 h后的外周血CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞占CD4+CD25+T細(xì)胞的百分率顯著高于對照組。提示CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞在AMT發(fā)生后數(shù)量顯著增加，可能在AMI急性期炎癥的消退及斑塊的穩(wěn)定中起到了積極作用。

LX分子中包含著典型的三羥基和四共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，根據(jù)分子中羥基位置和構(gòu)象的不同可分為四種: LXA4、LXB4、15-epi-LXA4和15-epi-LXB4［11］。人類LXA4受體(ALX)包括FPR1、FPRL-1/ALXR和FPR3三種，表達(dá)在各種白細(xì)胞上，如:中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、激活的T細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞［12］等。研究表明，LXA4一方面通過下調(diào)趨化因子和黏附分子的表達(dá)抑制中性粒細(xì)胞趨化、黏附和滲出，顯著減輕炎癥部位中性粒細(xì)胞的浸潤;另外一方面，LXA4還能抑制中性粒細(xì)胞的活性，包括抑制炎性刺激引起的中性粒細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生及炎性細(xì)胞因子的表達(dá)［13］。此外，LXA4可促進巨噬細(xì)胞吞噬凋亡的中性粒細(xì)胞，有效地避免凋亡中性粒細(xì)胞發(fā)生繼發(fā)性壞死以致炎性細(xì)胞內(nèi)容物的釋放，以及抑制促炎癥細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1等的表達(dá)。LXA4被認(rèn)為是機體內(nèi)最重要的促炎癥消退介質(zhì)。中性粒細(xì)胞的聚集和活化是心肌再灌注中炎癥損傷的主要因素之一，活化的中性粒細(xì)胞釋放各種細(xì)胞因子和活性氧，進一步加重和損傷心肌組織。一些針對中性粒細(xì)胞和細(xì)胞因子的治療也被證實可以減輕心肌再灌注損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，AMI患者入院時血漿LXA4水平顯著高于入院48 h后及對照組，入院48 h后血漿LXA4水平顯著高于對照組。AMI患者血漿LXA4水平與CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞百分率呈顯著負(fù)相關(guān)。提示CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞及LXA4在AMI中均起到了炎癥消退調(diào)節(jié)作用。

AMI死亡患者尸檢中發(fā)現(xiàn)，其心肌組織存在炎性浸潤，提示AMI與炎癥因子密切相關(guān)。目前可以明確的是AMI可以引起炎性反應(yīng)，從而導(dǎo)致組織壞死和炎癥細(xì)胞浸潤。炎癥因子在炎性反應(yīng)過程中釋放入血，其在血中的濃度可以反映機體炎癥的程度與階段。多種炎癥因子在AMI后的變化及其對轉(zhuǎn)歸的影響是目前研究的熱點。本研究顯示，CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞及LXA4均在AMI的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的免疫調(diào)節(jié)作用，在心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷中起到了保護細(xì)胞的作用，但具體機制及作用通路尚需進一步研究。

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Serum LXA4 and CD4+CD25+CD127-regulatory T cell levels of patients with acute myocardial infarction in different stages and its correlation analysis

LIU Hongjie1LIU Lubin2

1.Department of Cardiovascular Internal Medicine,Beijing Bei＇anhe Community Health Service Center,Beijing 100095,China;2.Department of Endocrine,Peking University Hospital,Beijing 100095,China

ObjectiveTo assay the serum LXA4 and CD4+CD25+CD127-regulatory T cells(Treg)levels of patients with acute myocardial infarction(AMI)in different stages,study the function and mechanism of LXA4 in patients with AMI, discuss its effect in the pathogenesis and prognosis of AMI.MethodsFlow cytometry and enzyme-linked immunosorbent analysis(ELISA).Methodswere used to detect the level of LXA4 and CD4+CD25+CD127-Treg in 58 patients with AMI(AMI group)at the moment of the admission and 48 hours after admission.At the same time 30 cases of normal controls(control gorup)were detected.Then the results were compared.ResultsThe percentage of CD4+CD25+CD127-Treg cells of CD4+CD25+T cells in the AMI patients at admission was significantly lower than the percentage of 48 hours after admission and the control group(P＜0.05 or P＜0.01).The percentage of CD4+CD25+CD127-Treg cells of CD4+CD25+T cells in AMI patients 48 hours after admission was significantly higher than control group(P＜0.01).The concentration of LXA4 in the AMI patients at admission was significantly higher than the percentage of 48 hours after admission and the control group(P＜0.01 or P＜0.05).The concentration of LXA4 in the AMI patients 48 hours after admission was significantly higher than the control group(P＜0.01).There was negative correlation between the concentration of LXA4 and the percentage of CD4+CD25+CD127-Treg cells(r=-0.738,P=0.002).ConclusionCD4+CD25+CD127-Treg cells and LXA4 play important roles in immune regulation in the occurrence and the development of AMI patients,and has effect of protection in ischemia-reperfusion injury of myocardial cells.

Acute myocardial infarction;Lipid oxygen element A4;CD4+CD25+CD127-regulatory T cells

R542.22

A

1673-7210(2015)03(a)-0042-04

2014-12-02本文編輯:程銘)