超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質譜法快速鑒別生曬參中的皂苷類成分

張曉旭 王洪平 楊 陽 杜茂波 毛 森 陳 暢 劉玉欣 李韶菁.河北大學藥學院，河北保定 0700；.中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京 00700；.中國中醫(yī)科學院，北京 00700；.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 00700

超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質譜法快速鑒別生曬參中的皂苷類成分

張曉旭1，2王洪平2楊 陽3杜茂波2毛 森4陳 暢2劉玉欣1李韶菁2
1.河北大學藥學院，河北保定 071002；2.中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京 100700；3.中國中醫(yī)科學院，北京 100700；4.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100700

目的 采用超高效液相色譜與串聯(lián)四極桿飛行時間質譜聯(lián)用技術，快速全面鑒別生曬參中人參皂苷類成分。方法色譜分離采用Agilent Zorbax RRHD Eclipse Plus C18色譜柱；流動相為水（含0.1%甲酸，A）和乙腈（含0.1%甲酸，B），梯度洗脫。質譜定性采用高分辨飛行時間質譜，電噴霧雙噴離子源（Dual AJS ESI），負離子模式。 結果11 min內對生曬參中的95個皂苷類成分進行了鑒別。結論本研究為目前生曬參的質量控制提供了可行的依據。

人參；人參皂苷；超高效液相色譜；四極桿飛行時間質譜

人參為五加科植物人參（Panax GinsengC.A.Meyer）的干燥根，是我國名貴中藥材，被《神農本草經》列為上品，有大補元氣、復脈固脫、補脾益肺、生津、安神的功效，是常用的滋補強壯藥，在《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準—中藥成方制劑》（《中藥部頒標準》）收錄的4000余種中成藥中，含人參的處方就達到307個，占到了近1/10[1]。因此為保證人參藥材質量，許多學者對其主要藥效成分人參皂苷進行了較為深入的研究，取得了一些進展[2]，一些微量的人參皂苷逐漸被分離和分析出來[3]，但全面反映人參中皂苷類成分的組成、快速辨識其中的皂苷類成分卻少有報道。超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF-MS/MS）聯(lián)用技術具有高分離度、高靈敏度和高分辨率等特點，可通過化合物的精確分子量推測分子式信息，并結合二級質譜的碎片離子推斷其化學結構組成，近年來已逐漸被用于復雜中藥化學成分的研究[4]。本研究選取生曬參為研究對象，采用UPLC-Q-TOF-MS/MS法，對其皂苷類成分進行了快速全面的分析鑒別。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

Agilent 1290超高效液相色譜儀 （美國Agilent公司），配有在線脫氣機，四元泵，自動進樣器，柱溫箱和二極管陣列檢測器；Q-TOF 6540質譜儀 （美國Agilent公司），配有Dual AJS ESI離子源，分析軟件為Mass Hunter Data Acquisition在線工作站和Qualitative Analysis離線分析軟件；N-1100型旋轉蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；KQ-250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DFT-50型粉碎機 （溫嶺市林大機械有限公司）；BP211D型天平（賽多利斯科學儀器有限公司）。

1.1.2 藥品與試劑

人參皂苷20（S）-F1、20（S）-F2、Rb1、Rb2、Rb3、Rd、Re、Rg1、Rg3對照品購自中國食品藥品檢定研究院；人參皂苷Rc、Rf對照品購自北京世紀奧科生物技術有限公司。乙腈、甲醇和甲酸（Fisher，美國）為質譜級；水為超純水；其余試劑均為分析純。生曬參藥材購自吉林省宏久和善堂人參有限公司，經中國中醫(yī)科學院中藥研究所孫偉博士鑒定為五加科植物人參（Panax Ginseng C.A.Meyer）的干燥根。

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液的制備

1.2.1.1 對照品儲備液 分別取12種對照品人參皂苷20（S）-F1、20（S）-F2、Rb1、Rb2、Rb3、Rd、Re、Rg1、Rg3、Rc、Rf適量，精密稱定，用甲醇溶解并定容至5mL容量瓶中，濃度為200 μg/mL，于4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 對照品混合液 分別精密吸取以上各對照品溶液適量于5 mL容量瓶中，并用甲醇定容至刻度，使每個對照品的終濃度為10 μg/mL，經0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

1.2.2 供試品溶液制備

稱取藥材粉末（已過40目篩）1.0 g，置具塞三角燒瓶中，加入70%甲醇10 mL，超聲提取30 min，過濾，殘渣繼續(xù)加70%甲醇10 mL，繼續(xù)超聲提取30 min，共提取3次，合并濾液，于40℃旋轉蒸發(fā)儀濃縮至干，殘渣用70%甲醇溶解并定容至5 mL容量瓶中，經0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

1.2.3 色譜條件

Agilent Zorbax RRHD Eclipse Plus C18色譜柱（100 mm×3 mm，1.8 μm），流動相由水（含0.1%甲酸，A）和乙腈（含0.1%甲酸，B）組成，梯度洗脫：0～3 min，5%～30%B；3～5 min，30%～35%B；5～8.5 min，35%～42%B；8.5～10 min，42%～95%B；10～11 min，95%B；進樣量：2 μL；流速：0.8 mL/min；柱溫：45℃；分流比：1∶1。

1.2.4 質譜條件

采用Dual AJS ESI離子源，負離子模式。掃描范圍：m/z 100～1700；干燥氣溫度：300℃；干燥氣流速：5 L/min；霧化器壓力：35 Psig（1 Psig=6.895 kPa）；鞘氣溫度：400℃；鞘氣流速：12 L/min；毛細管電壓：3500 V；毛細管出口電壓：280 V；噴嘴電壓：1500 V；碰撞能量：50、55、60 V；參比離子：m/z 119.0363和1033.9881。

2 結果

2.1 生曬參藥材基峰離子圖

乙腈-水作為流動相使人參皂苷類成分得到了良好的分離，經過分流后以0.4 mL/min的流速進入到質譜系統(tǒng)中，得到較好的電噴霧電離狀態(tài)和最小化的離子抑制效應[5]。根據“1.2.1”項下的樣品處理方法處理樣品，并根據“1.2.3”和“1.2.4”項下的色譜質譜條件進樣，生曬參供試液中的人參皂苷成分在11 min內得到良好的分離，共識別了95個色譜峰，藥材基峰離子圖見圖1（A）。

2.2 利用對照品鑒別化合物

通過與對照品的保留時間及碎片離子信息比較，共11個化合物被鑒定：人參皂苷Re（峰11）、Rg1（峰12）、Rf（峰30）、Rb1（峰42）、Rc（峰46）、Rb2（峰51）、Rb3（峰52）、20（S）-F1（峰60）、Rd（峰64）、20（S）-F2（峰92）、Rg3（峰94），人參皂苷混合對照品的基峰離子圖見圖1（B）。

2.3 皂苷類成分的裂解途徑及主要特征性化合物的鑒別

皂苷類成分經過超高效液相的分離，大多數人參皂苷在一級質譜ESI負離子模式下形成[M-H]-和[M+ COOH]-的準分子離子峰，其中丙二酰基化人參皂苷和齊墩果烷型人參皂苷為酸性皂苷，主要以[M-H]-準分子離子存在[6]。二級質譜中，皂苷類成分經過碰撞誘導解離（CID）而產生糖苷鍵的斷裂，最后生成特征性的去糖基化離子。因此可根據去糖基化離子的母核結構，推斷皂苷的結構類型。人參皂苷的常規(guī)裂解方式及途徑見圖2。

人參皂苷根據糖苷基結構，可分為四環(huán)三萜類的達瑪烷型和五環(huán)三萜類的齊墩果烷型；達瑪烷型根據四環(huán)母核上羥基的有無，又分為人參二醇型和人參三醇型。根據質譜的技術原理，同一類型的化合物有相同或相似的裂解規(guī)律，因此鑒別不同類型人參皂苷的特征性成分，是辨識與其有類似結構人參皂苷的前提。

在基峰離子圖中，峰26的二級質譜中有特征性碎片離子m/z 459.3884的存在，顯示此化合物為人參二醇型皂苷。其在一級質譜中產生m/z 1269.6447的[M-H]-分子離子峰，推測其分子式為C60H102O28。母核連接的糖苷鍵斷裂，生成了[M-H-162]-、[M-H-324]-、[M-H-486]-、[M-H-684]-和[M-H-810]-的去糖基化離子和一些糖離子。根據圖3（A）的裂解途徑及圖4中人參皂苷的結構組成，此化合物被鑒定為人參皂苷Ra0。

同理得出峰37為人參三醇型三七皂苷R2，峰62為齊墩果烷型竹節(jié)參皂苷Ⅰva。經過能量碰撞，母核上連接的糖苷鍵斷裂，生成[M-H-（Glc+H2O）]-、[M-H-（Xyl+H2O）]-等去糖基化離子和糖離子，如m/z為131.0354的[Xyl-H2O-H]-、m/z為161.0448的[Glc-H2O-H]-等，見圖3（B，C）。

2.4 丙二?；藚⒃碥盏蔫b別

丙二酰基人參皂苷是鮮人參和生曬參中人參皂苷的主要存在形式，其特征性的?；I極不穩(wěn)定，易脫羧[13]，因此常作為人參原材料質量控制的重要指標[6]，然而目前對丙二?；藚⒃碥罩讣y圖譜鑒別的文獻較少。本文在總結前人研究的基礎上，鑒別了丙二?；藚⒃碥?，以期為生曬參的質量評價提供依據。本研究鑒別出的17個丙二酰人參皂苷中，其一級質譜圖均能見到[M-H]-準分子離子峰和[M-H-CO2]-的碎片離子峰；其中的3個二丙二酰基人參皂苷，其一級質譜除能檢測到[M-H]-準分子離子峰和[M-H-CO2-CO2]-的碎片離子峰外，尚能檢到[M-H-CO2]-碎片離子峰。峰65、峰70對應的Ma-Rd和2Ma-Rd的ESI/MS圖譜見圖5。

2.5 生曬參藥材中皂苷類成分的鑒定結果

人參皂苷類成分有大量的同分異構體，如[M-H]-為m/z 769.47的有峰37、峰38、峰39，根據文獻參考[2]，再由于3者的極性不同，在色譜柱中的保留時間有所差異，推測3個成分分別為三七皂苷R2、人參皂苷F3和偽人參皂苷RT3。同理推測出竹節(jié)參皂苷Ⅰva（峰62）、姜狀三七苷R1（峰91）[14]，人參皂苷Ra2（峰35）、人參皂苷Ra1（峰47）[15]。

一級質譜中[M-H]-均為m/z 783.49的峰27、峰92、及峰94，參照對照品的保留時間和質譜離子特征，推測出峰92、峰94分別為人參皂苷F2、人參皂苷Rg3，峰27的糖苷元離子為m/z 475.3723，為人參三醇型皂苷，推測為人參皂苷Rg2[5]。同理推測出峰11、峰64、峰77分別為人參皂苷Re、人參皂苷Rd和絞股藍皂苷ⅩⅦ[2]。

根據精確分子量、特征碎片離子、相對保留時間及參考相關文獻，本研究在11 min內鑒別出95個皂苷類成分，包括m/z 459.3838的二醇型人參皂苷（峰26、峰28、峰31等52個）、m/z 475.3787的三醇型人參皂苷（峰3、峰5、峰6等28個）、m/z 455.3603的齊墩果烷型人參皂苷（峰45、峰57、峰62等8個）、m/z 491.3737的達瑪烷型衍生物（峰 4、峰24）和 m/z 475.3787的達瑪烷型衍生物（峰1、峰10、峰15）及其他（峰34、峰40），質譜定性分析及鑒定結果見表1。

3 討論

實驗采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術測定生曬參中人參皂苷類成分，通過該法提供精確的分子質量，得到可能的分子式組成，并參考碎片離子等，在11 min內鑒定出生曬參的95種皂苷類成分。生曬參中的皂苷類成分中存在有大量的同分異構體，受飛行時間質譜原理的局限性，不能對同分異構體進行準確判定。本文通過比對對照品，考察特征性碎片及母核結構，結合相關文獻保留時間及出峰順序，對部分人參皂苷的同分異構體進行了鑒別，未判定的同分異構體有待進一步研究。

本實驗實現了快速全息化的鑒別，為進一步研究人參藥材的物質基礎和質量評價奠定基礎，同時對中藥多成分尤其是微量成分的辨識也具有重要意義。

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Rapid analysis of ginsenosides in dried fresh Ginseng by ultra-performance liquid chromatography with quadrupole time-of-flight mass spectrometry

ZHANG Xiaoxu1,2WANG Hongping2YANG Yang3DU Maobo2MAO Sen4CHEN Chang2LIU Yuxin1LI Shaojing2
1.College of Pharmacy,Hebei University,Hebei Province,Baoding 071002,China;2.Institute of Chinese Materia Medica,China Academy of Chinese Medical Science,Beijing 100700,China;3.China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700,China;4.Dongzhimen Hospital of Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100700,China

ObjectiveTo identify the saponins components from dried fresh Ginseng by ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry rapidly and comprehensively.Methods Chromatographic separation was achieved on an Agilent Zorbax RRHD Eclipse Plus C18column.The mobile phase was consisted of 0.1%formic acid water(A)and 0.1%formic acid acetonitrile(B)with a gradient program.Qualitative analysis was performed on an Agilent 6540 quadrupole time-of-flight spectrometer mass which equipped with a Dual AJS ESI source operating in negative mode.Results A total of 95 ginsenosides in dried fresh Ginseng were identified only in 11 minutes.Conclusion This study provides a feasible basis for the quality control of the dried fresh Ginseng.

Panax Ginseng;Ginsenosides;UPLC;Q-TOF

R284.1

A

1673-7210（2015）03（c）-0130-07

2014-12-11本文編輯：衛(wèi) 軻）

國家科技重大專項“重大新藥創(chuàng)制”項目（編號2014ZX09304307001、2012ZX09103201-055）；國家自然科學基金資助項目（編號81303261、81274133）；中國中醫(yī)科學院中藥研究所基本科研業(yè)務費自主選題項目（編號ZZ2014060、ZZ2014005）。

劉玉欣（1956-），男，博士，教授，主要從事細胞及分子藥理學研究；李韶菁（1974-），女，博士，副研究員，主要從事中藥組效關系及分子藥理學研究。