獼猴桃藤總黃酮純化工藝研究△

李雪，李棟紅，王小平，白吉慶

(陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046)

·基礎(chǔ)研究·

獼猴桃藤總黃酮純化工藝研究△

李雪，李棟紅，王小平*，白吉慶

(陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046)

目的：獼猴桃藤中總黃酮純化工藝的優(yōu)選。方法：采用單因素設(shè)計(jì)，以總黃酮的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)。結(jié)果：最佳純化條件樣品與聚酰胺的比例為1∶10，10倍量柱體積的60%乙醇洗脫，所純化的總黃酮含量最高，可達(dá)51.8%。結(jié)論：該純化工藝簡(jiǎn)單、可行，可用于獼猴桃藤中總黃酮的純化。

獼猴桃藤；總黃酮；純化工藝；正交設(shè)計(jì)

獼猴桃藤為獼猴桃科獼猴桃屬植物獼猴桃ActinidiaChinensisPlanch.的藤[1]。獼猴桃根具有清熱解毒、活血散結(jié)、祛風(fēng)利濕之功能。臨床上用于治療胃癌、乳腺癌、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、淋巴性結(jié)核、跌撲損傷、癰癤等病[2]。我國(guó)為獼猴桃的主要產(chǎn)區(qū)，陜西省廣泛栽培，栽植面積占全國(guó)60%以上。近年發(fā)現(xiàn)中華獼猴桃根富含黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)等成分，具有降壓、抗腫瘤等藥理作用[2-5]。獼猴桃根資源相對(duì)匱乏，但其藤因?yàn)楣r(nóng)每年都要修剪，資源非常豐富。前期研究發(fā)現(xiàn)獼猴桃藤富含大量黃酮類(lèi)成分，但對(duì)其總黃酮純化工藝研究報(bào)道較少，因此本文對(duì)其總黃酮的純化工藝進(jìn)行研究，希望為獼猴桃藤總黃酮的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 儀器與試劑、試藥

1.1 儀器

紫外-分光光度計(jì)(上海美普達(dá)儀器有限公司)；德國(guó)IKA RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；KQ-300VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DZF-6050B真空干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)；101-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京科偉永興儀器有限公司)；BT125D電子天平(賽多利斯)。

1.2 試劑、試藥

獼猴桃藤，經(jīng)陜西中醫(yī)學(xué)院生藥教研室白吉慶副教授鑒定為獼猴桃科獼猴桃屬植物獼猴桃ActinidiaChinensisPlanch.的藤；蘆丁對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，批號(hào)：100080-200707)；聚酰胺(100～200目)；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 粗提物制備 稱取獼猴桃藤藤飲片150 g，用8倍量60%的乙醇提取3次，每次1 h，合并濾液，減壓回收乙醇至稠膏狀，減壓干燥，得粗提物14.64 g。

2.1.2 對(duì)照品的制備 精密稱取蘆丁對(duì)照品9.93 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取蘆丁對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL于10 mL容量瓶中，精密加入5%的亞硝酸鈉溶液0.4 mL，搖勻，放置6 min；加入10%硝酸鋁溶液0.4 mL，搖勻，放置6 min；加入4.3%的氫氧化鈉試液4 mL，加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)試劑為空白，用紫外-可見(jiàn)分光光度法，在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸收光度。以總黃酮(蘆丁計(jì))濃度為縱坐標(biāo)，吸光度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得Y=0.008 73X-0.002 8(r=0.999 9)，總黃酮(蘆丁計(jì))在0.01～0.08 mg·mL-1線性關(guān)系好良好[6]。

2.3 上柱溶液的制備

稱取粗提物適量置燒瓶中，精密加入10倍量60%的乙醇，稱定重量，超聲20 min，取出，室溫放置，稱重，用60%的乙醇補(bǔ)足減失的重量，過(guò)濾，濾液備用。

2.4 純化工藝考察

2.4.1 洗脫量的考察 取供試品2 g(平行3份)，精密稱定，按照2.3項(xiàng)下的方法制備上柱溶液，加到已處理好的聚酰胺(10 g)柱上(30 cm×5 cm)，分別用6、8、10、12倍量柱體積的60%乙醇洗脫，收集洗脫液，搖勻，精密量取0.3 mL置10 mL容量瓶中，照2.2項(xiàng)下的方法自加入5%的亞硝酸鈉0.4 mL起，依法測(cè)定吸光度。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算總黃酮的濃度。精密量取洗脫液適量，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105 ℃烘3 h，取出，置干燥器中冷至室溫，精密稱重。計(jì)算所得純化物中總黃酮的含量分別為31.6%、40.5%、49.2%、42.8%。

2.4.2 洗脫濃度的考察 取供試品2 g(平行3份)，精密稱定，按照2.3項(xiàng)下的方法制備上柱溶液，加到已處理好的聚酰胺(10 g)柱上(30 cm×5 cm)，用10倍量柱體積的50%、60%、70%、80%乙醇洗脫，收集洗脫液，搖勻，精密量取0.3 mL置10 mL容量瓶中，照2.2項(xiàng)下的方法自加入5%的亞硝酸鈉0.4 mL起，依法測(cè)定吸光度。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算總黃酮的濃度。精密量取洗脫液適量，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105 ℃烘3 h，取出，置干燥器中冷至室溫，精密稱重。計(jì)算所得純化物中總黃酮的含量分別為32.4%、48.6%、39.2%、40.6%。

2.4.3 上樣量的考察 分別取供試品1、2、3 g(平行3份)，精密稱定，按照2.3項(xiàng)下的方法制備上柱溶液，加到已處理好的聚酰胺(10 g)柱上(30 cm×5 cm)，分別用10倍量柱體積的60%乙醇洗脫，收集洗脫液，搖勻，精密量取0.3 mL置10 mL容量瓶中，照2.2項(xiàng)下的方法自加入5%的亞硝酸鈉0.4 mL起依法測(cè)定吸光度。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算總黃酮的濃度。精密量取洗脫液適量，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105 ℃烘3 h，取出，置干燥器中冷至室溫，精密稱重，計(jì)算所得純化物中總黃酮的含量分別為51.8%、48.5%、46.4%。

2.5 結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳純化條件為樣品與聚酰胺的比例為1∶10，10倍量柱體積的60%乙醇洗脫。

2.6 工藝驗(yàn)證

取供試品5 g(平行3份)，精密稱定，按照2.3項(xiàng)下的方法制備上柱溶液，加到已處理好的聚酰胺(50 g)柱上(30 cm×5 cm)，分別用10倍量柱體積的60%乙醇洗脫，收集洗脫液，搖勻，精密量取0.3 mL置10 mL容量瓶中，照2.2項(xiàng)下的方法自加入5%的亞硝酸鈉0.4 mL起，依法測(cè)定吸光度。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算總黃酮的濃度。精密量取洗脫液適量，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105 ℃烘3 h，取出，置干燥器中冷至室溫，精密稱重，計(jì)算所得純化物中總黃酮的含量分別為51.6%，52.5%，50.9%，表明優(yōu)選的純化工藝穩(wěn)定可行。

3 結(jié)論與意義

采用薄層色譜法，獼猴桃藤粗提物色譜中在與蘆丁對(duì)照品相應(yīng)的位置出現(xiàn)相同的斑點(diǎn)，表明獼猴桃藤粗提物中含有蘆丁，故本文選擇蘆丁作為對(duì)照品測(cè)定獼猴桃藤粗提物純化前后總黃酮的含量。本文采用單因素試驗(yàn)，篩選影響獼猴桃藤粗提物中總黃酮純化效果的主要因素，并對(duì)優(yōu)化的純化工藝進(jìn)行放大試驗(yàn)驗(yàn)證，為獼猴桃藤總黃酮工業(yè)化生產(chǎn)及開(kāi)發(fā)利用提供參考。

本試驗(yàn)以蘆丁為對(duì)照品，用紫外-分光光度法對(duì)總黃酮進(jìn)行含量測(cè)定，通過(guò)聚酰胺柱層析對(duì)獼猴桃藤中總黃酮純化效果進(jìn)行篩選。結(jié)果表明，樣品與聚酰胺的比例為1∶10，洗脫劑為10倍量柱體積60%的乙醇，所得純化物中總黃酮含量最高，可達(dá)51.8%。本試驗(yàn)對(duì)優(yōu)化的工藝進(jìn)行放大試驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果純化效果較為理想，純化后總黃酮的含量可高達(dá)50%以上，與單因素考察所得的最佳純化效果進(jìn)行比較，無(wú)顯著差異。該純化工藝簡(jiǎn)單、可行，重復(fù)性好，可用于獼猴桃藤中總黃酮的純化。

[1] 國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草：第九卷(第三冊(cè)) [ M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999.

[2] 赫軍，馬秉智，趙鐵.藤梨根的化學(xué)成分研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志.2014，49(3)：184-186.

[3] 邸學(xué)，海波，楊欣欣.藤梨根藥材HPLC指紋圖譜及質(zhì)量研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志.2013，19(10)：135-137.

[4] 龍凱花，王小平，白吉慶.中藥藤梨根抗腫瘤研究[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2013，15(10)：846-849.

[5] 邸學(xué)，徐洋洋，裴世柱.響應(yīng)面法優(yōu)化藤梨根總生物堿提取工藝[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào).2013，15(7)：58-61.

[6] 王小平，白吉慶.藤梨根總黃酮提取方法及含量測(cè)定研究[J].陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，31(3)：65-66.

Purification Process of total flavonoids in Vine ofActinidiachinensis

LI Xue，LI Donghong，WANG Xiaoping*，BAI Jiqing

(Shaanxi University of TCM, Xianyang 712046，Shaanxi，China)

Objective：To optimize of flavonoids purification process ofActinidiachinensisvine.Methods：The optimized The purification process of the flavonoids was optimized with the total flavonoids as a index.Results：Optimal purification process was as following: The ratio of samples and adsorbent 1∶10, tenfold column volumes of 60% ethanol elute, the content of total flavonoids was 71.8%.Conclusion：The purification process is simple and feasible, and can be used for purification of total flavonoids in vine ofA.chinensis.

Vine ofActinidiachinens；total flavonoids；purification process；orthogonal design

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.2.010

2015-01-28)

陜西省科技資源統(tǒng)籌中藥現(xiàn)代化專項(xiàng)(2012KTCL03-14)；陜西省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(1689)

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王小平，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥質(zhì)量分析與新藥研究；E-mail：wangxiaoping323@126.com