制備腦缺血再灌注損傷動物模型的研究進(jìn)展

陳路，李瑋瑋，劉春慧

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010100；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010100)

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制備腦缺血再灌注損傷動物模型的研究進(jìn)展

陳路1，李瑋瑋1，劉春慧2Δ

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010100；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010100)

缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular disease，ICVD)是腦部主要動脈的血流暫時或永久的減少引起腦短暫的、突發(fā)的、可逆性神經(jīng)功能障礙。及時恢復(fù)腦組織的血液供應(yīng)是挽救患者生命的最主要辦法，但恢復(fù)血液灌注的同時又給腦組織器官等帶來了新的損傷，這就是腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)。如何建立一種理想的、高效的、易操作的腦缺血再灌注損傷動物模型來模擬臨床進(jìn)行研究，以及近年來科研工作者們?nèi)绾螌Υ四Ｐ瓦M(jìn)行改良創(chuàng)新，本文就以上內(nèi)容進(jìn)行了綜述。

腦缺血再灌注損傷；動物模型；制備

缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular disease，ICVD)是嚴(yán)重危害人類身心健康的常見病，多發(fā)病，好發(fā)于50～70歲中老年人，男性多于女性，發(fā)病無先兆，是神經(jīng)系統(tǒng)最為常見的疾病，其發(fā)病率、致死率、致殘率呈現(xiàn)出逐年升高的趨勢。ICVD的病因病機(jī)十分復(fù)雜，目前尚不能完全闡釋清楚，孫建強(qiáng)等[1]認(rèn)為ICVD的發(fā)生以下幾個方面有關(guān)：①興奮性氨基酸(excitatory amino acids，EAA)細(xì)胞毒作用；②能量衰竭及酸中毒；③氧自由基損傷；④Ca2+超載；⑤缺血半暗帶功能障礙；⑥一氧化氮(nitric oxide，NO)和一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，NOS)的作用；⑦凋亡調(diào)控基因的激活；⑧炎癥因子損害。近年來，ICVD在發(fā)病機(jī)制與綜合治療方面的研究已取得了突飛猛進(jìn)的進(jìn)步，成效顯著，而這其中，腦缺血再灌注模型的研究與發(fā)展發(fā)揮了重要作用，其地位的重要性已得到充分肯定[2]。

ICVD再灌注模型可分為局灶性腦缺血再灌注以及全腦缺血再灌注模型[3]。在ICVD的動物實(shí)驗(yàn)中，局灶性腦缺血再灌注模型是常用模型，而大腦中動脈阻塞再灌注(middle cerebral artery occlusion，MCAO/R)是其最常用的模型制備方法，除此之外另有開顱機(jī)械閉塞大腦中動脈法、光化學(xué)法、微栓子栓塞法以及化學(xué)物質(zhì)直接損傷法等[4]。制備局灶性腦缺血再灌注模型時，最初使用的是猴、狗、貓和兔等中型動物，由于大鼠的大腦中動脈的生理結(jié)構(gòu)和基底節(jié)的血液供應(yīng)與人相類似，故近20年來，應(yīng)用大鼠制備模型者逐漸增多，同時，大鼠具有生命力強(qiáng)，抗感染能力強(qiáng)以及種內(nèi)純合性優(yōu)良等特點(diǎn)，而且實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過程中，大鼠操作方便，易存活。但近年來，小鼠制備腦缺血再灌注模型的文獻(xiàn)報(bào)道逐漸增多，實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦比大鼠好，因?yàn)樾∈蟪伺c大鼠具有相同的解剖結(jié)構(gòu)外，其價格低廉，操作簡便及生化指標(biāo)檢測清晰等也是主要原因。

1 局灶性腦缺血再灌注模型的制備

1.1 傳統(tǒng)制模方法 1986年，日本學(xué)者Koizumi等[5]首先采用經(jīng)頸總動脈(commond carotid artery，CCA)插入尼龍線的方法制備出了大鼠大腦中動脈局灶性腦缺血再灌注(MCAO/R)模型。該模型的制作步驟是：雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量250～300 g；Ⅰ.線栓制備：用Takeno釣魚尼龍線(直徑0.20 mm)，頭端涂硅橡膠；涂膠標(biāo)準(zhǔn)為長5 mm、直徑0.25～0.30 mm；Ⅱ.模型的復(fù)制：大鼠用2%戊巴比妥那 (40 mg/kg) 腹腔注射麻醉。麻醉大鼠仰臥于手術(shù)臺上，頸部正中切口，鈍性分離各層組織，分離到氣管前肌后，沿右側(cè)胸鎖乳突肌腱向下分離，分離至動脈鞘后暴露右側(cè)頸總動脈，頸內(nèi)動脈(internal carotid artery，ECA)、頸外動脈(external carotid artery，ECA)及翼腭動脈(pterygopalatine，PPA)。結(jié)扎ECA和PPA，從CCA切口插入線栓，經(jīng)過ICA到達(dá)大腦中動脈(middle cerebral artery，MCA)起始端，結(jié)扎ICA近心端；恢復(fù)再灌注時，由ECA插入線栓至MCA起始端，然后再將尼龍線往回抽到ECA處即可。電子溫度儀測量直腸溫度，動物體溫嚴(yán)格控制在36.5 ℃～37.5 ℃[6]。這種制備方法，無須開顱，MCA閉塞效果較理想。但結(jié)扎甲狀腺上、枕、咽升、上頜外舌和翼腭動脈需要一定手術(shù)技巧。若從動物模型效果、動物來源、實(shí)驗(yàn)成本等因素綜合考慮，則目前多選用Wistar大鼠或者SD(Sprague-Dawley)大鼠[7]。

1989年， Longa等[8]對該制模方法進(jìn)行改進(jìn)，將大鼠體質(zhì)量控制在300～400g，進(jìn)線深度17 mm，尼龍線直徑0.2 mm，并將線栓頂端燙成圓球處理，并通過回抽尼龍線進(jìn)行再灌注。該模型的具體操作方法為：大鼠10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺上，頸部正中皮膚切開, 鈍性分離各層組織，暴露右側(cè)頸CCA。分離至頸內(nèi)動脈ICA、頸外動脈ECA分叉后一段。于ICA、ECA處用動脈夾夾閉，ECA近心端及遠(yuǎn)心端手術(shù)線線結(jié)扎，中間剪斷。ECA近結(jié)扎端斜向下剪一小口，將尼龍線由頸外動脈插入至頸內(nèi)動脈，繼續(xù)插入顱內(nèi)，插入至微感阻力，使線栓頭端通過MCA起始處，此時即實(shí)現(xiàn)大腦中動脈的血流阻塞。該造模方法以3個月齡的Wistar或SD大鼠為最常用的動物，但近年來國外使用小鼠的報(bào)道逐漸增多[9]。

研究表明，Koizumi法與Zea Longa法相比較，前者更能取得明顯的梗死效果和模型成功率。而且Koizumi法使用的的栓線更柔軟，更粗，并能更好的減少血流以及刺破血管的危險性。而后者使用的的尼龍線不易推進(jìn)血管，不能完全阻塞深穿動脈和后交通動脈的血供，從而導(dǎo)致腦組織缺血不完全。這種方法在術(shù)后引起蛛網(wǎng)膜下腔出血的幾率較Koizumi法高[10]。然而，以上2種制備方法均已成為制備局灶性腦缺血再灌注模型經(jīng)典，為后世學(xué)者的科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究奠定了操作基礎(chǔ)。然而，由于這2種方法制作的模型均存在模型成功率低、插線困難等不足，故后世諸多學(xué)者及科研工作者對此進(jìn)行了改良。

1.2 對傳統(tǒng)方法的改良 吳遠(yuǎn)華等[11]使用頭端去棱角鈍化的方法制作栓線進(jìn)行模型制備，較容易使線栓頭端直徑統(tǒng)一，實(shí)際操作發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血發(fā)生率低。趙瑾等[12]對傳統(tǒng)Zea Longa法進(jìn)行改良后，發(fā)現(xiàn)小鼠造模成功與否的3個重要影響因素分別為24 ℃左右的室溫、進(jìn)線的深度、體重與線栓直徑的匹配程度。陳永暢等[13]在制備小鼠局灶性腦缺血再灌注模型時只分離結(jié)扎CCA，不分離結(jié)扎ECA或PPA，也不分離ICA，提高了造模成功率以及動物術(shù)后恢復(fù)能力。高煥民等[14]將大鼠分為左側(cè)大腦中動脈缺血再灌注組(左側(cè)優(yōu)勢組)和右側(cè)大腦中動脈缺血再灌注組(右側(cè)優(yōu)勢組)，并分別進(jìn)行造模，發(fā)現(xiàn)左側(cè)優(yōu)勢組缺血程度較右側(cè)優(yōu)勢組明顯加重，神經(jīng)元數(shù)量缺失明顯，腦梗死體積明顯加大。武強(qiáng)等[15]在模型制備過程中將栓線進(jìn)行了個性化改進(jìn)，選用了硬度較佳且直徑有多種選擇的魚線，而線栓前端僅加熱成光滑的球面，并未膨大成球形栓線。另外，他們并未永久性地結(jié)扎CCA和PPA，而是進(jìn)行臨時阻斷。獲得了穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好、控制腦缺血及再灌注時間準(zhǔn)確的模型。孫念霞等[16]對傳統(tǒng)制備方法進(jìn)行改良時時ECA兩斷端除了手術(shù)線結(jié)扎外，線結(jié)外端用電刀夾閉，并在插線時借助彎鑷的力量使魚線沿血管前內(nèi)側(cè)壁前行，提示此法可有效防止線結(jié)脫落，提高插線成功率。馬志健等[17]采用雙側(cè)CCA阻斷再灌注模型(bilateral common carotid artery occlusion，BCCO)、線栓法MCA腦缺血再灌注模型(middle cerebral artery occlusion，MCAC)、四血管法全腦缺血再灌注模型(global cerebral ischemia-reperfusion，GI)等3種常用的腦缺血再灌注動物模型，觀察不同腦損傷情況下的形態(tài)學(xué)改變，發(fā)現(xiàn)不同的腦缺血模型的應(yīng)用不同，GI是研究缺血損傷后恢復(fù)相對理想的模型。雷延成等[18]對傳統(tǒng)制模方法進(jìn)行如下改良：①將水合氯醛的濃度由10%降至3.6%；②將ECA結(jié)扎或血管夾閉法改為ICA盲插結(jié)合夾鑷法；③將胸骨舌骨肌-胸鎖乳突肌間隙入路改為胸骨舌骨肌手術(shù)入路；④將缺血再灌注并縫合皮膚時間由120 min減少至80 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)改良后的模型更加穩(wěn)定，存活時間延長，且能夠保證神經(jīng)干細(xì)胞移植方面的研究條件。

1.3 模型制備成功的評價方法 局灶性腦缺血再灌注模型制備成功與否的評價方法包括神經(jīng)學(xué)評分(五級四分法)、2,3,5-氯化三苯基四氮唑法、腦組織病理改變、測量生化指標(biāo)、檢測腦梗死體積等[19]。

五級四分法的評定標(biāo)準(zhǔn)為：0分：無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：輕微神經(jīng)功能缺損，不能完全伸展對側(cè)前爪；2分：中度局灶性神經(jīng)功能缺損，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分：重度局灶性神經(jīng)功能缺損，向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識水平下降。評分在3～4分的大鼠即為造模成功[20]。

紅四氮唑法(TTC)：評定方法為制模后特定時間將動物再次麻醉，仰臥，開胸，剪開右心房，用恒流泵行左心室生理鹽水灌洗，充分灌洗至右心房，再灌注溴2,3,5-氯化三苯基四氮唑紅至無血水流出，斷頭取腦，制備2 mm厚的冠狀切片，每隔10張切片取1張，置于甲醛溶液中固定12 h，大腦缺血梗死灶顯示蒼白色，非梗死灶顯示紅色，數(shù)碼相機(jī)拍照。腦梗死體積計(jì)算：由公式V= ∑(A1+A2)t/2算出梗死體積。其中t表示切片厚度，A1和A2分別表示切塊嘴、尾側(cè)梗死面積[21]。

測量生化指標(biāo)主要包括：血及組織中的超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase，SOD)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、谷胱甘肽過氧化物酶 (glutathione Peroxidase，GSH-Px)和過氧化氫酶(catalase，CAT)、一氧化氮合酶 (nitric oxide synthase，NOS)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)等。

2 全腦缺血再灌注模型的制備

目前，全腦缺血再灌注模型的制備方法有很多種，包括：二血管阻斷加低血壓法大鼠模型、三血管阻斷法(雙側(cè)頸總動脈和基底動脈)大鼠模型、四腦動脈閉塞大鼠模型(四血管阻斷法)、頸動脈分流大鼠模型、四腦動脈閉塞加放血制備兔全腦缺血模型、沙土鼠全腦缺血再灌注損傷模型等。國內(nèi)文獻(xiàn)中，四血管阻斷法使用者居多，而國外多采用四血管阻斷法和二血管阻斷加低血壓法，且以后者居多[22]。

2.1 四血管阻斷法的制備方法 四血管阻斷法的制作步驟主要是：大鼠10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉，俯臥位固定，在枕骨后暴露皮膚，找到第一頸椎兩側(cè)的翼小孔，并用尖端直徑0.5 mm的電凝器插入翼小孔，灼燒雙側(cè)椎動脈，造成永久性閉塞。待動物適應(yīng)24 h后，在頸部正中切口，暴露雙側(cè)CCA，用動脈夾夾閉阻斷，10～15 min后松開動脈夾恢復(fù)血流，進(jìn)行再灌注實(shí)驗(yàn)[23]。這種制模方法多選用Wistar或SD大鼠，亦可使用蒙古沙鼠、獼猴、家兔、家貓等動物。

2.2 二血管阻斷加低壓法的制備方法 二血管阻斷加低壓法的主要步驟是：10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，分離暴露右側(cè)股動脈，行股動脈插管，接BL-420生物機(jī)能記錄系統(tǒng)監(jiān)測動脈血壓。頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈及左側(cè)頸靜脈，經(jīng)左側(cè)頸靜脈插管，建立給藥途徑，靜脈注射肝素150 IU/kg。經(jīng)左頸靜脈回抽血液，當(dāng)平均動脈壓達(dá)35～40 mmHg時，用微型動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈，此為缺血期開始。期間經(jīng)頸靜脈回抽放血或靜脈注射回輸血液保持平均動脈壓在35～40 mmHg。15 min缺血期后移去微型動脈夾，去除雙側(cè)頸總動脈的夾閉，回輸血液，此為再灌注期[24]。這種制模方法多選用Wistar或SD大鼠。

2.3 對傳統(tǒng)方法的改良 陳遠(yuǎn)壽等[25]采用三血管阻斷法的方法制備小鼠全腦缺血模型，分別于缺血8、12、16 min，再灌注3 d，以及缺血12 min后，分別再灌注6 h，3、7、28 d，發(fā)現(xiàn)這種模型是用于研究腦梗死后神經(jīng)細(xì)胞死亡及小鼠基因操作較為理想的模型。張金文等[26]對Pulsinelli四血管阻塞法進(jìn)行改良，包括用自制燒灼器燒灼經(jīng)翼孔走行的椎動脈等，結(jié)果顯示制模成功率較高。武釗等[27]通過改良二血管阻斷加低血壓法，在原法基礎(chǔ)上融入靜脈留置針插管技術(shù)，建立大鼠全腦缺血再灌注模型，發(fā)現(xiàn)此改良法可較好的建立大鼠全腦缺血再灌注模型，并對腦復(fù)蘇疾病的進(jìn)一步治療研究提供良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。周越菡等[28]對三血管阻斷法法進(jìn)行改良，將基底動脈(basilar artery，BA)和CCA結(jié)扎，阻斷脊髓血流與腦血流間的通路，從而引起短暫性的全腦缺血及海馬神經(jīng)元的遲發(fā)性死亡。陽生光等[29]改良了傳統(tǒng)四血管阻斷法大鼠模型的制作方法，采用針頭阻塞法，并留置針頭，永久性阻斷雙側(cè)椎動脈(vertebral artery，VA)，并應(yīng)用蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosinstaining，HE)染色檢測大鼠海馬CA1區(qū)的存活神經(jīng)元數(shù)來證實(shí)全腦缺血再灌注模型的成功，也證實(shí)了全腦缺血再灌注后存在著損傷。武釗等[30]制備全腦缺血再灌注模型時在傳統(tǒng)微型動脈夾基礎(chǔ)上新增加了一個吻合口，克服現(xiàn)有微型動脈夾易滑脫松動且夾閉不全的缺陷，更好的發(fā)揮了血管夾閉的作用。林綠標(biāo)等[31]在制備貓全腦缺血再灌注損傷模型時參照Pulsinelli四動脈結(jié)扎法，進(jìn)行以下改良：提出電凝位于翼突與第二頸椎橫突之間的椎動脈，永久性阻斷雙側(cè)椎動脈，再臨時阻斷雙側(cè)頸總動脈，以動態(tài)腦電圖監(jiān)測出靜息腦電波為判定貓全腦缺血的標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果提示改進(jìn)后的模型效果精確，造模成功率較普通制備方法高。

3 結(jié)語

如何能夠模擬人類ICVD的發(fā)病過程，建立生理指標(biāo)控制嚴(yán)格、可重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)化腦缺血再灌注損傷動物模型，自始至終都是研究人員所要解決的問題。近年來，隨著分子藥理學(xué)、生物學(xué)、生理學(xué)等學(xué)科的不斷發(fā)展，腦缺血再灌注模型在理論基礎(chǔ)、實(shí)驗(yàn)條件、技術(shù)操作等方面取得了長足的進(jìn)展，并日趨成熟。但是，從多方面來看，目前國內(nèi)無論在實(shí)驗(yàn)條件、或是在模型制作過程中各種生理指標(biāo)、影響因素的控制以及對干擾因素的排除等，與國外還存在較大的差距。很多相關(guān)動物模型尚需進(jìn)一步完善，眾多觀察指標(biāo)的量化及標(biāo)準(zhǔn)化研究還需進(jìn)一步研究，才能真正達(dá)到重現(xiàn)性好、接近臨床的、可控制的模型的要求，滿足科學(xué)以及臨床醫(yī)學(xué)研究的需要。因此，諸多學(xué)者及科研工作者還需牢固基礎(chǔ)知識，刻苦鉆研，努力提高業(yè)務(wù)水平，力求為人類缺血性腦血管疾病的發(fā)展做出更突出的貢獻(xiàn)。

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(編校：王冬梅)

Progress in preparation of cerebral ischemia reperfusion injury in animal models

CHEN Lu1, LI Wei-wei1, LIU Chun-hui2Δ

(1.College of Traditional Chinese Medicine,Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010100, China; 2.College of Traditional Chinese Medicine, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010100, China)

Ischemic cerebrovascular disease(ICVD) is temporary or permanent reduction of blood flow of the main arteries of the brain caused by cerebral transient,sudden,reversible neurological dysfunction.Timely recovery of blood supply to the brain is the most important way to save the patient’s life,but at the same time gave restore blood perfusion brain tissue organs brought new damage,which is cerebeal ischemia reperfusion injury(CIRI).How to build an ideal,efficient,easy to operate brain ischemia-reperfusion injury in animal models to simulate the clinical study,and how to improve and innovate this model by researchers in recent years were reviewed in this article.

cerebral ischemia reperfusion injury; animal models; preparation

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)科技百萬工程(YKD2014KJBW015)

陳路，男，碩士在讀，研究方向：方劑學(xué)組方配伍規(guī)律，E-mail：chenlu3530@126.com；劉春慧，通信作者，女，博士在讀，副教授，研究方向：方劑學(xué)組方配伍規(guī)律，E-mail：haoxin777@126.com 。

R285.5

A

1005-1678(2015)10-0158-04