兩種放散法檢測新生兒溶血患兒紅細(xì)胞致敏抗體的比較▲

黎海瀾 焦 偉 莫柱寧 朱春麗 陽子驥

(廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院輸血科，南寧市 530021，E-mail:46549668@qq．com)

母嬰血型不合新生兒溶血病(hemolytic disease of newborn，HDN)可導(dǎo)致新生兒黃疸、貧血、水腫、肝脾腫大，甚至膽紅素腦病。因此，采用敏感而且準(zhǔn)確的檢測技術(shù)對HDN早期、準(zhǔn)確的診斷有重要的意義［1－4］。直接抗球蛋白試驗(yàn)、抗體游離試驗(yàn)和抗體放散試驗(yàn)被稱為檢測HDN的“三項(xiàng)試驗(yàn)”，是早期檢測HDN的經(jīng)典方法。放散試驗(yàn)在三項(xiàng)中最為敏感，是確診HDN的實(shí)驗(yàn)［5］。放散方法有多種，目前國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室多采用傳統(tǒng)的熱放散法或酸放散法。本研究分別用酸放散和熱放散法檢測HDN患兒紅細(xì)胞致敏抗體，以評價(jià)兩種方法在HDN實(shí)驗(yàn)室診斷中的應(yīng)用效果?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1．1 臨床資料 選擇2012年1月至2014年5月我院收治355例疑似HDN的患兒及其母親血標(biāo)本，其中男性患兒172例，女性患兒183例，年齡2 h至13 d，≤5 d 341例，＞5 d 14例，臨床主要表現(xiàn)為貧血和黃疸。隨機(jī)選取同期在本院住院的70例母嬰血型相同或相合、直接抗球蛋白試驗(yàn)及抗體篩查陰性的高膽紅素血癥患兒血樣本做研究對照，其中男34例，女36例;年齡9 h至11 d;合并新生兒窒息13例、母乳缺乏12例、感染9例、出生后體重明顯下降5例、胎糞排出延遲7例、頭顱血腫6例、低血糖2例、胎膜早破8例、宮內(nèi)窘迫8例。

1．2 試劑 標(biāo)準(zhǔn)抗-A(B)血清、IgM 抗-D、E、C、c、e及抗人球蛋白試劑、篩選細(xì)胞、譜細(xì)胞等均來自上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司。ABO標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室自制，酸放散試劑盒購自長春博迅生物技術(shù)有限公司，DiaMed低離子/抗人球蛋白卡、DiaMed專用離心機(jī)、DiaMed專用卡孵育系統(tǒng)等均由珠海保瑞達(dá)公司提供。其他儀器還有KA-2200型離心機(jī)(日本久保田研究所)，恒溫水浴箱等。試劑均在有效期內(nèi)使用。

1．3 方法 采母親、HDN患兒靜脈血(必要時(shí)臍帶血)，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝。母親血樣本用于血型鑒定及抗體檢測?；純貉獦?biāo)本經(jīng)3 400 r/min離心2 min，分離血漿及壓積紅細(xì)胞。壓積紅細(xì)胞用生理鹽水充分洗滌3次，留取末次洗液作對照。取壓積紅細(xì)胞10 μl配成2%、1%紅細(xì)胞鹽水懸液備用。在2支試管中分別加入洗滌好的壓積紅細(xì)胞各1 ml，待同時(shí)做熱放散、酸放散試驗(yàn)。

1．3．1 血型鑒定、血清抗體檢測和實(shí)驗(yàn)方案:參照文獻(xiàn)［6］，鑒定患兒及母親ABO及Rh血型，根據(jù)母嬰ABO血型相合與否，按以下程序檢測:三項(xiàng)試驗(yàn);母親血清抗體檢測等。

1．3．2 熱放散法:依照文獻(xiàn)［6］。在 1 體積(≥1 ml)的壓積紅細(xì)胞中加入等容量的生理鹽水，混勻，置56℃水浴箱中孵育10 min，期間輕搖幾次。取出后置預(yù)先準(zhǔn)備盛有56℃熱水的離心套管內(nèi)，立刻以3 400 r/min離心2 min，取上清液(放散液)做相應(yīng)檢測。

1．3．3 酸放散法:嚴(yán)格依照廠商的試劑盒說明書進(jìn)行酸放散。酸放散液配制:將放散液A與放散液B按體積比4∶1比例混合均勻(必須現(xiàn)配現(xiàn)用)。將1 ml洗滌好的待檢壓積紅細(xì)胞與1 ml配制好的酸放散液混合均勻，室溫孵育1 min后，以3 400 r/min離心1 min(勿超時(shí))，取上清放散液與中和液按500μl∶80 μl比例混勻，再以3 400 r/min離心2 min，取出上清液(此上清液中含有從紅細(xì)胞表面解離的抗體)做相應(yīng)的檢測。

1．3．4 檢測放散液中 IgG抗-A(B)、抗-Rh抗體:用微柱凝膠法分別檢測2種放散液中的抗-A(B)、抗-Rh抗體，選取98例檢出抗體的放散液進(jìn)行倍比稀釋后加相應(yīng)試劑紅細(xì)胞，測定抗體效價(jià)并按凝集強(qiáng)度4+(12分)、3+(10分)、2+(8分)、1+(5分)、±(2分)、0(0分)計(jì)算評分［7］。在低離子/抗球蛋白卡中加入1%相應(yīng)試劑紅細(xì)胞各 50 μl后，各加上述放散液 50 μl，37℃孵育15 min，置卡式專用離心機(jī)離心10 min，按產(chǎn)品說明書判讀結(jié)果。

1．4 母嬰血型不合新生兒溶血病診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］(1)母子血型不合;(2)抗體釋放試驗(yàn)或直接抗球蛋白試驗(yàn)陽性;(3)發(fā)生高膽紅素血癥。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 13．0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料分布不符合正態(tài)性，故用中位數(shù)表達(dá)，采用秩和檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用秩和檢驗(yàn)，以P ＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 兩組檢測結(jié)果 355例疑似母嬰血型不合HDN患兒中，確診為 HDN 277例，其中 ABO-HDN 275例，Rh-HDN 2例。275例ABO-HDN患兒樣本中，酸放散試驗(yàn)均檢出與患兒血型抗原所對應(yīng)的抗體，無假陽性。熱放散試驗(yàn)檢出的陽性病例，酸放散試驗(yàn)均檢出陽性。其中有6例ABO-HDN患兒采用酸放散試驗(yàn)結(jié)果陽性(2+～4+)，而熱放散試驗(yàn)結(jié)果陰性，但加入放散液量成倍增加(≥100 μl)時(shí)結(jié)果均陽性(±～1+)。隨即取患兒用于其他檢測的血樣本，并確保用于熱放散的壓積紅細(xì)胞≥1 ml，嚴(yán)格按文獻(xiàn)操作規(guī)程重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果與原來一致。2例Rh-HDN患兒用酸放散法、熱放散法檢測均陽性。放散液的回收量和外觀比較:等體積的致敏紅細(xì)胞，酸放散法獲得的放散液外觀呈淺紅色透明、清晰，量多于熱放散法;熱放散法所得放散液呈櫻紅色半透明。酸放散試驗(yàn)耗時(shí)約35 min，熱放散試驗(yàn)則為45 min。

70例高膽紅素血癥患兒血樣本(其中母嬰均為O型30例、A型15例、B型15例，母親為AB型10例)同時(shí)用酸放散法與熱放散法進(jìn)行抗體釋放試驗(yàn)，結(jié)果均陰性。

2．2 兩種檢測方法檢出的抗體效價(jià)及其評分比較 酸放散法放散液中IgG抗-A(B)、抗-Rh抗體效價(jià)及評分均高于熱放散法(u=6．280，P＜0．001)。酸放散法與熱放散法所得紅細(xì)胞放散液中抗體評分分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。98例母嬰血型不合HDN兩種放散液中抗體效價(jià)及評分分布、熱放散法與酸放散法對HDN患兒紅細(xì)胞致敏抗體的放散效果比較，分別見表1、表2。

表1 98例母嬰血型不合HDN兩種放散液中抗體效價(jià)分布(n，%)

表2 98例HDN患兒熱放散法與酸放散法放散液中抗體效價(jià)評分［中位數(shù)(四分位間距)］

3 討論

本研究結(jié)果顯示，酸放散法效果優(yōu)于傳統(tǒng)熱放散法，酸放散法的抗體放出效率高于熱放散法(P＜0．05)。酸放散法放散液中IgG抗-A(B)、抗-Rh抗體效價(jià)評分均高于熱放散法(P＜0．05)，酸放散液抗體效價(jià)為4、8、16、32者比例明顯高于熱放散液。在受檢的98例HDN患兒熱放散液中，93例(94．9%)抗體效價(jià)≤4，5例(5．1%)抗體效價(jià)為8;而酸放散液中65例(66．3%)抗體效價(jià)≤4，20 例(20．4%)抗體效價(jià)為 8，11 例(11．2%)抗體效價(jià)為16，2例(2．0%)抗體效價(jià)為32。筆者在實(shí)驗(yàn)中選取部分標(biāo)本做了熱放散后充分洗滌3次，然后將其用酸放散法進(jìn)行重復(fù)放散試驗(yàn)，仍可檢出致敏的抗體。6例ABO-HDN患兒采用酸放散試驗(yàn)結(jié)果陽性，而熱放散試驗(yàn)結(jié)果陰性，但加入放散液量成倍增加(≥100 μl)時(shí)出現(xiàn)弱陽性結(jié)果，說明對等體積致敏紅細(xì)胞進(jìn)行放散時(shí)，酸放散法所得放散液抗體濃度明顯高于熱放散法。據(jù)之推測:對受檢標(biāo)本量較少(如壓積紅細(xì)胞＜1 ml)的病例，用酸放散試驗(yàn)應(yīng)比傳統(tǒng)熱放散試驗(yàn)更有優(yōu)勢。筆者發(fā)現(xiàn)熱放散試驗(yàn)時(shí)，放散液要全部用于相應(yīng)反應(yīng)體系中(放散液應(yīng)≥100 μl)，并及時(shí)檢測，這不僅使抗體檢測的方法學(xué)選擇受到限制，而且實(shí)驗(yàn)室不在反應(yīng)體系(如微柱凝膠法)中調(diào)整放散液的加入劑量，就有可能得到假陰性結(jié)果，會延誤HDN患兒的診治。這提示:對HDN的血清學(xué)檢測，采用不同的紅細(xì)胞致敏抗體放散方法及對放散液中抗體檢測方法的正確選擇影響著實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

綜上所述，對于HDN的實(shí)驗(yàn)室診斷，酸放散試驗(yàn)與傳統(tǒng)熱放散試驗(yàn)定性檢測結(jié)果無差異，但酸放散試驗(yàn)放散效能較優(yōu)，人為干擾因素少，耗時(shí)短，試驗(yàn)條件技術(shù)要求難度低，是一種更可靠、便捷的HDN診斷方法。

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